Name: Establecimiento de organoides pulmonares humanos y diferenciación proximal para generar organoides maduros de las vías respiratorias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprende a establecer organoides pulmonares humanos a partir de tejidos primarios y diferenciarlos proximalmente para generar modelos 3D que simulan el epitelio respiratorio humano con precisión fisiológica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos al Centro de Ciencias Panorómicas y a la Unidad de Microscopio Electrónico, Facultad de Medicina Li Ka Shing, Universidad de Hong Kong, por su asistencia en imágenes confocales y citometría de flujo. Este trabajo fue apoyado en parte por fondos del Fondo de Salud e Investigación Médica (HMRF, 17161272 y 19180392) de la Oficina de Alimentos y Salud; Fondo General de Investigación (GRF, 17105420) del Consejo de Becas de Investigación; y Health@InnoHK, Comisión de Innovación y Tecnología, el Gobierno de la Región Administrativa Especial de Hong Kong.

Toda la experimentación con tejidos humanos descritos en este documento fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Hong Kong / Autoridad Hospitalaria Hong Kong West Cluster (UW13-364 y UW21-695). Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes antes de la recolección de tejidos.
1. Derivación del organoide pulmonar humano
<ol><li>Preparación de materiales experimentales<ol>
<li>Prepare el medio basal complementando el medio DMEM/F12 avanzado con 2 mM de glutamina, 10 mM HEPES, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina.</li>
		<li>Preparar el medio de expansión organoide pulmonar humana complementando el medio basal con 10% de R-spondina 1 medio condicionado, 10% de medio condicionado de Noggin, 1x suplemento de B27, 1,25 mM de N-acetilcisteína, 10 mM de nicotinamida, 5 μM de Y-27632, 500 nM de A-83-01, 1 μM de SB202190, 5 ng/mL de factor de crecimiento fibroblst (FGF)-7, 20 ng/mL de FGF-10 y 100 μg/mL de primocina (ver Tabla de Materiales). NOTA: El medio acondicionado R-spondin 1 y Noggin puede ser reemplazado por R-spondinante comercial 1 (500 ng/mL) y Noggin (100 ng/mL).</li>
		<li>Precalentar una placa de cultivo en suspensión de 24 pocillos en una incubadora de cultivo celular. Utilice una incubadora de cultivo celular estándar con 5% de CO2 y atmósfera humidificada a 37 °C. Descongele la matriz del sótano en una nevera de 4 °C. Mantenga la matriz del sótano y el medio de cultivo en hielo durante la experimentación.</li>
	</ol></li>
	<li>Aislamiento celular de tejidos pulmonares humanos para cultivo de organoides en 3D<ol>
<li>Procure tejidos pulmonares humanos recién resecados de un tamaño de alrededor de 0,5 cm de pacientes que se someten a resección quirúrgica debido a diversas enfermedades. Transportar los tejidos pulmonares en 30 ml de medio basal a temperatura ambiente y procesarlos lo más rápido posible dentro de una campana de bioseguridad.</li>
		<li>Picar los tejidos pulmonares en trozos pequeños (0,5-1 mm) con un bisturí estéril en una placa de cultivo celular de 10 cm. Lavar las piezas de tejido con 10 ml de medio basal frío en un tubo centrífugo de 15 ml, seguido de centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Desechar el sobrenadante y resuspend el pellet en 8 mL de medio basal suplementado con colagenasa a una concentración final de 2 mg/mL. Digiera las piezas de tejido agitando el tubo a 120 rpm durante 30-40 min a 37 °C.</li>
		<li>Pipetee hacia arriba y hacia abajo durante 20x para cortar las piezas de tejido digeridas utilizando una pipeta serológica de 10 ml. Apilar un colador de 100 μm en un tubo centrífugo de 50 ml y filtrar la suspensión.</li>
		<li>Recupere las piezas de tejido en el colador con el medio basal y transfiéralas a un tubo centrífugo de 15 ml, seguido de una segunda ronda de cizallamiento y filtrado. Se puede realizar un filtrado de cizallamiento adicional 1x-2x para aislar más células, especialmente cuando se adquiere un pequeño trozo de tejido (por ejemplo, <0,5 cm).</li>
		<li>Agregue FBS al flujo con una concentración final del 2% para terminar la digestión, seguido de centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Resuspend el pellet celular en 10 mL de medio basal, seguido de centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>(Opcional) Si se ven muchos eritrocitos en el pellet (estimado por el color del pellet), vuelva a suspender el pellet celular en 2 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos e incube a temperatura ambiente durante 5 min. Luego, agregue 10 ml de medio basal al tubo, seguido de centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Vuelva a suspender el pellet en la matriz del sótano frío y manténgalo en hielo. Añadir 80-160 μL de matriz basal para células recuperadas de un tejido pulmonar de tamaño alrededor de 0,5 cm; la cantidad es suficiente para sembrar 2-4 gotas.</li>
		<li>Dispensar 40 μL de suspensión a cada pocillo de una placa de cultivo de suspensión de 24 pocillos precalentada. Incubar la placa de cultivo a 37 °C durante 10-15 min. Deje que la matriz del sótano se solidifique para formar una gota.</li>
		<li>Añadir 500 μL de medio de expansión de organoides pulmonares humanos suplementado con 5 nM de Heregulin beta-1 a cada pocillo e incubar la placa en una incubadora de cultivo celular.</li>
		<li>Refresque el medio cada 3 días. Retire el medio viejo mientras mantiene la gota intacta y agregue el medio fresco con precaución. Pase los organoides después de la incubación durante 10-14 días. Use Heregulin beta-1 solo en el cultivo inicial antes del primer pasaje.</li>
		<li>Observe los organoides bajo un microscopio para asegurarse de que los organoides no estén incrustados con una densidad celular muy alta. Si una gota se desintegra debido a una densidad celular demasiado alta, recupere y vuelva a incrustar los organoides y las células con un mayor volumen de matriz basal para hacer más gotas con una densidad celular más baja y deseable.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Expansión de organoides pulmonares humanos
<ol><li>Prepare una pipeta Pasteur quemando la punta de una pipeta Pasteur en una llama, como un quemador Bunsen, para reducir la abertura de 1,5 mm a alrededor de 1,0 mm de diámetro. Enfríe las pipetas, seguido de un autoclave para esterilizar. Humedezca las pipetas con el medio basal para evitar la fijación y pérdida de células durante el cizallamiento mecánico.</li>
	<li>Paso de organoides pulmonares con cizallamiento mecánico<ol>
<li>Use una punta de 1 ml y pipetee hacia arriba y hacia abajo para romper las gotas obtenidas arriba. Luego, transfiera los organoides junto con el medio a un tubo centrífugo de 15 ml y ajuste el volumen a 10 ml con medio basal frío. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 °C</li>
		<li>Lavar los organoides con 10 ml de medio basal frío una vez más. Resuspendir los organoides en 2 mL de medio basal frío. Pipetea hacia arriba y hacia abajo para cortar los organoides en trozos pequeños con una pipeta Pasteur.</li>
		<li>Suplementar con medio basal a un volumen total de 10 mL, seguido de centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Resuspend los fragmentos organoides con matriz de basamento frío suficiente para permitir una expansión de 1:3 a 1:5. Manténgase en hielo.</li>
		<li>Coloque 40 μL de suspensión organoide en cada pocillo de una placa de 24 pocillos precalentada. Incubar la placa de cultivo a 37 °C durante 10-15 min. Deje que la matriz del sótano se solidifique.</li>
		<li>Añadir 500 μL de medio de expansión organoide pulmonar a cada pocillo e incubar en una incubadora de cultivo celular. Refresque el medio cada 3 días. Pase los organoides cada 2 semanas con una proporción de 1:3 a 1:5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Paso de organoides pulmonares con tripsinización NOTA: Se prefiere la tripsinización cuando es difícil cortar el organoide pulmonar en pedazos pequeños usando una pipeta Pasteur, o el tamaño de los organoides es muy variable, o las experimentaciones posteriores requieren organoides de tamaño más uniforme.<ol>
<li>Extraiga los organoides pulmonares como se muestra en el paso 2.2.1. Resuspend el organoide en 1 mL de enzima disociación e incubar en un baño de agua a 37 °C durante 3-5 min.</li>
		<li>Agregue 1 ml de medio basal al tubo. Corta los organoides mecánicamente mediante pipeteos de los organoides hacia arriba y hacia abajo en pedazos pequeños usando una pipeta Pasteur. Compruebe el tamaño de las piezas organoides bajo un microscopio con un aumento de 4x. Luego, agregue 40 μL de FBS para terminar la digestión. NOTA: Determine el tamaño de los fragmentos organoides bajo el microscopio de acuerdo con la disposición experimental. Si un experimento necesita más organoides u organoides de tamaño más uniforme, corte los organoides en pedazos más pequeños o incluso en células individuales. Luego, toma más tiempo, probablemente 3 semanas, antes de que los organoides estén listos para la experimentación.</li>
		<li>Recargue con medio basal hasta un volumen final de 10 ml, seguido de centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Resuspend las piezas organoides en matriz de basamento frío con un volumen suficiente para pasar con una proporción de 1:5-1:10. Manténgase en hielo.</li>
		<li>Coloque 40 μL de suspensión organoide en cada pocillo de una placa de 24 pocillos precalentada. Incubar la placa de cultivo a 37 °C durante 10-15 min. Deje que la matriz del sótano se solidifique.</li>
		<li>Suplementar con 500 μL de medio de expansión organoide pulmonar por pozo e incubar en una incubadora de cultivo celular. Actualice el medio de expansión cada 3 días. Pase los organoides después de 2-3 semanas. NOTA: Alrededor de 100 organoides están montados dentro de una gota de 40 μL de matriz basal. Los organoides pulmonares normalmente crecen mejor con una densidad celular relativamente alta. Vuelva a incrustar los organoides con una densidad celular más baja si las gotas se desintegran o los organoides en crecimiento se unen debido a la densidad celular demasiado alta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Diferenciación proximal para generar organoides maduros de las vías respiratorias
<ol><li>Preparar el medio de diferenciación proximal (medio PD) complementando el medio basal de interfaz líquida de aire con 1 suplemento de interfaz de líquido de aire, 1 suplemento de mantenimiento de interfaz líquida de aire, 4 μg/ml de heparina, 1 μM de hidrocortisona, 10 μM de Y-27632 y 10 μM de DAPT (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Organoides 3D de las vías respiratorias<ol>
<li>Incubar organoides pulmonares en el medio de expansión durante 7-10 días después de la transmisión a través de cizallamiento mecánico. Reemplace el medio de expansión por el medio PD. Incubar los organoides en el medio PD durante 14 días en una incubadora de cultivo celular.</li>
		<li>Deseche el medio de DP en cada pozo. Agregue un tampón de lisado celular para cosechar el organoide diferenciado de las vías respiratorias para la extracción de ARN y la detección de la expresión génica celular mediante el ensayo RT-qPCR.</li>
		<li>Alternativamente, incube los organoides a 37 ° C durante 60 minutos después de la adición de 10 mM EDTA para disociar los organoides en células individuales, seguido de un análisis de citometría de flujo para examinar las poblaciones celulares. Los organoides están listos para diversas manipulaciones experimentales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Organoide 2D de las vías respiratorias<ol>
<li>Preparar suficientes organoides pulmonares 3D para el cultivo de diferenciación 2D. Se requiere un total de 1,3 x 105 y 4,5 x 105 celdas para un inserto de soporte permeable de 24 pocillos y un inserto de soporte permeable de 12 pocillos, respectivamente.</li>
		<li>Después de que los organoides pulmonares 3D crezcan en el medio de expansión durante 2 semanas, digiera los organoides en células individuales y firme en los insertos de 24 y 12 pocillos para generar organoides de las vías respiratorias 2D.</li>
		<li>Preincubar los insertos con el medio basal durante la noche en una incubadora de cultivo celular. Agregue 250 μL y 500 μL de medio basal en la cámara superior e inferior de una placa de 24 pocillos, respectivamente. Para una placa de 12 pocillos, agregue 500 μL y 1,000 μL de medio basal en la cámara superior e inferior, respectivamente.</li>
		<li>Cosechar organoides pulmonares 3D como se describe en el paso 2.2.1. Resuspendir los organoides con 1 ml de enzima disociación e incubar en un baño de agua a 37 °C durante 3-5 min.</li>
		<li>Agregue 1 ml de medio basal al tubo. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para cortar los organoides en células individuales con una pipeta Pasteur y verifique las células bajo un microscopio. Luego, agregue 40 μL de FBS para terminar la digestión.</li>
		<li>Filtre las células a través de un colador de 40 μm en un tubo centrífugo de 50 ml. Transfiera la suspensión de la celda filtrada a un tubo de 15 ml. Recargue con medio basal a un volumen total de 10 ml, seguido de centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Resuspend el pellet, recogido de 24 gotas (40 μL), en 1-2,5 mL de medio de expansión organoide pulmonar dependiendo de la densidad celular en las gotas. Cuente el número de células con un contador celular bajo un microscopio. Ajuste la concentración de la celda a 1,3 x 106/ml (para insertos de 24 pocillos) o 9 x 105/ml (para insertos de 12 pocillos).</li>
		<li>Retire el medio basal de las cámaras superior e inferior. Agregue 500 μL y 1.000 μL de medio de expansión en la cámara inferior del inserto de 24 pocillos y el inserto de 12 pocillos, respectivamente. Semilla de 100 μL y 500 μL de suspensión celular preparada en la etapa 3.3.7 en la cámara apical del inserto de 24 pocillos y el inserto de 12 pocillos, respectivamente.</li>
		<li>Incubar en una incubadora de cultivo celular durante 2 días. Reemplace el medio de expansión con el medio PD en la cámara apical e inferior de las placas. Incubar los organoides en la incubadora de cultivo celular durante 14 días y refrescar el medio de EP cada 3 días. NOTA: Los cilios móviles son discernibles en los organoides 3D y 2D bajo un microscopio desde el día 7 después de la incubación en el medio PD. Después de 14 días de cultivo de diferenciación en el medio de EP, los organoides de las vías respiratorias están maduros para diversas manipulaciones experimentales.</li>
		<li>Mida la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) cada dos días utilizando un sistema de medición de resistencia eléctrica de acuerdo con un protocolo estándar descrito en17.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li>
<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3D+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li>
<li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li>
<li>Wroblewski, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+targets+cancer-associated+apical-junctional+constituents+in+gastroids+and+gastric+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells.</a> Gut. 64 (5), 720-730 (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+human+airway+organoids+to+assess+infectivity+of+emerging+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Lancaster, M. A., Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modelling+in+human+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Disease modelling in human organoids.</a> Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).</li>
<li>Millicell ERS-2 User Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F">https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</a> (2021).</li>
<li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> eLife. 4, 05098(2015).</li>
<li>Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+grow+a+lung%3A+Applying+principles+of+developmental+biology+to+generate+lung+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pathobiology+Reports%22%5BJournal%5D)">How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells.</a> Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).</li>
<li>Glinka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LGR4+and+LGR5+are+R-spondin+receptors+mediating+Wnt%2Fbeta-catenin+and+Wnt%2FPCP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling.</a> EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).</li>
<li>Groppe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+BMP+signalling+inhibition+by+the+cystine+knot+protein+Noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin.</a> Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).</li>
<li>Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+and+cellular+dynamics+during+regeneration+of+airway+epithelium+from+basal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors.</a> Development. 143 (5), 764-773 (2016).</li>
<li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+SMAD+signaling+inhibition+enables+long-term+expansion+of+diverse+epithelial+basal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).</li>
<li>Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGFR2+is+required+for+airway+basal+cell+self-renewal+and+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation.</a> Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).</li>
<li>Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+immunological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organoids in immunological research.</a> Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+applications+of+adult+stem+cell-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Translational applications of adult stem cell-derived organoids.</a> Development. 144 (6), 968-975 (2017).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).</li>
<li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+SARS-CoV-2+inhibitors+using+lung+and+colonic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids.</a> Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).</li>
<li>Mykytyn, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+entry+into+human+airway+organoids+is+serine+protease-mediated+and+facilitated+by+the+multibasic+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site.</a> eLife. 10, 64508(2021).</li>
<li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li>
<li>Lamers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+productively+infects+human+gut+enterocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes.</a> Science. 369 (6499), 50-54 (2020).</li>
<li>Mallapaty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mini+lungs+and+other+organoids+helping+to+beat+COVID%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mini lungs and other organoids helping to beat COVID.</a> Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).</li>
</ol>

J. Z., C.L. y M.C.C. figuran como inventores de la patente de organoides de las vías respiratorias (publicación No: US-2021-0207081-A1). Los otros autores no declaran intereses contrapuestos.

Las vías respiratorias humanas están revestidas con el epitelio de las vías respiratorias, también conocido como epitelio ciliado pseudoestratificado. Los principales tipos de células del epitelio de las vías respiratorias superiores son las células ciliadas que permiten el movimiento coordinado de sus cilios apicales para expulsar el moco y las partículas inhaladas de las vías respiratorias, las células caliciformes que producen y secretan moco y las células basales que recubren la membrana basal y están implicadas en l...

Los organoides se han convertido en una herramienta robusta y universal para el modelado in vitro del desarrollo de órganos y el estudio de la biología y la enfermedad. Cuando se cultivan en un medio de cultivo definido por el factor de crecimiento, las células madre adultas (ASC) de una variedad de órganos pueden expandirse en 3 dimensiones (3D) y autoensamblarse en grupos celulares similares a órganos compuestos de múltiples tipos de células, denominados organoides. El laboratorio de Clevers informó de la derivación del primer organoide derivado de ASC, el organoide intestinal humano, en 2009 1,2. Posteriormente, se han establecido organoides derivados de ASC para una variedad de órganos y tejidos humanos, incluyendo próstata 3,4, hígado 5,6, estómago 7,8,9, páncreas10, glándula mamaria11 y pulmón 12,13 . Estos organoides derivados de ASC conservaron las propiedades celulares, estructurales y funcionales críticas del órgano nativo y mantuvieron la estabilidad genética y fenotípica en cultivos de expansión a largo plazo14,15.
Los organoides también pueden derivarse de células madre pluripotentes (PSC), incluidas las células madre embrionarias (ES) y las células madre pluripotentes inducidas (iPS)16. Mientras que los organoides derivados de PSC explotan los mecanismos de desarrollo de órganos para su establecimiento, los ASC pueden ser coaccionados para formar organoides mediante la reconstrucción de condiciones que imitan el nicho de células madre durante la autorrenovación fisiológica del tejido o la reparación de tejidos. Los organoides derivados de PSC son modelos favorables para explorar el desarrollo y la organogénesis, aunque no pueden alcanzar el nivel de maduración comparable de los organoides derivados de ASC. El estado de maduración similar al fetal de los organoides derivados de PSC y la complejidad para establecer estos organoides impiden sustancialmente sus amplias aplicaciones para estudiar la biología y la patología en tejidos maduros.
El tracto respiratorio humano, desde la nariz hasta el bronquiolo terminal, está revestido con el epitelio de las vías respiratorias, también llamado epitelio ciliado pseudoestratificado, que consta de cuatro tipos principales de células, es decir, células ciliadas, células caliciformes, células basales y células club. Establecimos el organoide pulmonar humano derivado de ASC a partir de tejidos pulmonares humanos en colaboración con el laboratorio12,13 de Clevers. Estos organoides pulmonares se expanden consecutivamente en el medio de expansión durante más de un año; la duración precisa varía entre las diferentes líneas organoides obtenidas de diferentes donantes. Sin embargo, en comparación con el epitelio nativo de las vías respiratorias, estos organoides pulmonares expandibles a largo plazo no son lo suficientemente maduros ya que las células ciliadas, la principal población celular en las vías respiratorias humanas, están subrepresentadas en estos organoides pulmonares. Así, desarrollamos un protocolo de diferenciación proximal y generamos organoides de las vías respiratorias 3D y 2D que fenocopian morfológica y funcionalmente el epitelio de las vías respiratorias a un nivel casi fisiológico.
Aquí proporcionamos un protocolo de video para derivar organoides pulmonares humanos de los tejidos pulmonares primarios, expandir los organoides pulmonares e inducir la diferenciación proximal para generar organoides de las vías respiratorias 3D y 2D.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivos para el cultivo de organoides pulmonares</fuerte></td>Avanzado DMEM/F12 Invitrogen 12634010-A8301 Tocris 2939 500nM B27 suplemento Invitrogen 17504-044 1x Cultrex Matriz de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana Basal con Factor de Crecimiento Reducido, Tipo 2 (BME 2)</td><td>Trevigen</td><td>3533-010-0</td><td>70-80%</td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF-7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>GlutaMAX (glutamina)</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>1x</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Heregulina &beta;-1</td><td>Peprotech</td><td>100-03</td><td>5 nM</td></tr><tr><td>N-Acetilcisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin (medio condicional)hecho en</td> <td>casa-10x</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>1x</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>100 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Rspondin1 (medio condicional)</td><td>hecho en</td><td></td> <td>casa-10x</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067</td><td>1 &micro; M</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>5 y micro; M</td></tr><tr><td><fuerte>Diferenciación proximal medio</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Tocris</td><td>2634</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td>Solución de Heparina</td><td>Tecnología de células madre</td><td>7980</td><td>4 y micro; g/mL</td></tr><tr><td>Solución madre de hidrocortisona</td><td>Tecnología StemCell</td><td>7925</td><td>1 &micro; M</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI 10X Suplemento</td><td></td><td></td> suplemento de <td>interfaz aire-líquido</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI Medio basal</td><td>StemCell Technology</td><td>05001</td><td>interfaz aire-líquido medio basal</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI Suplemento de mantenimiento</td> de <td>interfaz aire-líquido</td>Y-27632 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td>EquipmentCabina de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>seguridad biológica</td><td>Baker</td><td>1-800-992-2537</td><td></td></tr><tr><td>Carl Zeiss LSM 780 u 800</td><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>42093483</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX31SF</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5418BG040397</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN negro o ZEN azul software</td> de <td>análisis</td> <td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12mm Tecnología Trans-well</td><td>StemCell</td><td>#38023</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 12 pocillos</td><td>Cellstar</td><td>665970</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 15 y 50 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L6BF5Z8118</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo celular de 24 pocillos</td><td>Cellstar</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>6,5 mm Trans-well</td><td>StemCell Technology</td><td>#38024</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro de jeringa médica, 0,22 y micro; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGPR33RB</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Microfuge Puntas de</td> micropipeta <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TFLR140-200-Q21190531</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de pipeta Pasteur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-378893</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (5 ml, 10 ml, 25 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BA08003, 08004, 08005</td><td></td></tr><tr><td><Fuerte>Anticuerpos</Fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-Ratón Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-Ratón, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-Conejo Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-Conejo Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-Rata Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11007</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-Citoqueratina 5</td><td>Abcam</td><td>ab128190</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-FOX J1</td><td>Invitrogen</td><td>14-9965-82</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-Mucina 5AC</td><td>Abcam</td><td>ab3649</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-&beta;-tubulina 4</td><td>Sigma</td><td>T7941</td><td></td></tr><tr><td>Conejo Anti-p63</td><td>Abcam</td><td>ab124762</td><td></td></tr><tr><td>Rata Anti-Uteroglobina/CC-10</td><td>R& D Systems</td><td>MAB4218-SP</td><td></td></tr><<tr><td>fuerte>Otro reactivo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1217701</td><td>enzima de disociación</td></tr></tbody></table>

establecimiento de organoides pulmonares humanos y diferenciación proximal para generar organoides maduros de las vías respiratorias

Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids

La falta de un modelo robusto in vitro del epitelio respiratorio humano dificulta la comprensión de la biología y la patología del sistema respiratorio. Describimos un protocolo definido para derivar organoides pulmonares humanos a partir de células madre adultas en el tejido pulmonar e inducir la diferenciación proximal para generar organoides maduros de las vías respiratorias. Los organoides pulmonares se expanden consecutivamente durante más de 1 año con alta estabilidad, mientras que los organoides diferenciados de las vías respiratorias se utilizan para simular morfológica y funcionalmente el epitelio de las vías respiratorias humanas a un nivel casi fisiológico. Así, establecemos un modelo organoide robusto del epitelio de la vía aérea humana. La expansión a largo plazo de los organoides pulmonares y los organoides diferenciados de las vías respiratorias genera una fuente estable y renovable, lo que permite a los científicos reconstruir y expandir las células epiteliales de las vías respiratorias humanas en platos de cultivo. El sistema organoide pulmonar humano proporciona un modelo in vitro único y fisiológicamente activo para diversas aplicaciones, incluido el estudio de la interacción virus-huésped, las pruebas de medicamentos y el modelado de enfermedades.

Este protocolo permite la derivación de organoides pulmonares humanos con una alta tasa de éxito. El tejido pulmonar humano fresco se pica en trozos pequeños y luego se descompone con colagenasa. Las células individuales resultantes se incrustan en la matriz del basamento y se incuban en el medio de expansión organoide pulmonar complementado con un cóctel de factores de nicho para el crecimiento de células madre epiteliales (paso 1.1.2). La Figura 1 muestra la microfotografía de células pulm...

El protocolo presenta un método para derivar organoides pulmonares humanos a partir de tejidos pulmonares primarios, expandir los organoides pulmonares e inducir la diferenciación proximal para generar organoides de las vías respiratorias 3D y 2D que fenopicon fielmente el epitelio de las vías respiratorias humanas.

Establecimiento de organoides pulmonares humanos y diferenciación proximal para generar organoides maduros de las vías respiratorias

The lack of a robust in vitro model of the human respiratory epithelium hinders the understanding of the biology and pathology of the respiratory system. ...

Estamos introduciendo un método para establecer el cultivo organoide del epitelio de la vía aérea humana en placas de cultivo. Derivamos organoides pulmonares humanos directamente de tejidos pulmonares primarios con alta eficiencia. Los organoides pulmonares humanos derivados se expanden de manera estable durante más de un año, y un protocolo de diferenciación proximal permite la generación de organoides maduros de las vías respiratorias que pueden simular fielmente el epitelio de las vías respiratorias humanas a un nivel casi fisiológico.Por lo tanto, el sistema de cultivo permite a los científicos reconstruir y expandir el epitelio de las vías respiratorias humanas en placas de cultivo. Demostrando el procedimiento estarán Man Chun Chiu y Yifei Yu, estudiantes de doctorado en nuestro laboratorio Para comenzar el aislamiento celular de los tejidos pulmonares humanos para el cultivo de organoides en 3D, picar los tejidos pulmonares en trozos pequeños de un milímetro con un bisturí estéril y lavar los trozos de tejido con 10 mililitros de medio basal frío. Centrifugar los tejidos a 400 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante antes de volver a depositar el pellet en ocho mililitros de medio basal suplementado con colagenasa a una concentración final de dos miligramos por mililitro.Luego, digiera las piezas de tejido agitando el tubo a 120 RPM durante 30 a 40 minutos a 37 grados centígrados. Después de la digestión, binote hacia arriba y hacia abajo 20 veces usando una pipeta serológica de 10 mililitros para cortar las piezas de tejido digeridas. Luego, filtre la suspensión con un colador de 100 micras en un tubo de 50 mililitros.Recupere y transfiera las piezas de tejido del colador a un tubo centrífugo de 15 mililitros con el medio basal. Para terminar la digestión, agregue suero bovino fetal al flujo a través de una concentración final del 2% Luego, centrifugue el tubo y vuelva a suspender el pellet celular en 10 mililitros del medio basal como se describió anteriormente. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet en 80 a 160 microlitros de medio de matriz de sótano frío y coloque los tubos sobre hielo.A continuación, dispense 40 microlitros de la suspensión a cada pozo de una placa de cultivo de suspensión de 24 pocillos precalentada. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante 10 a 15 minutos. Permita que la matriz del sótano se solidifique y forme una gota.Después de la incubación, agregue 500 microlitros de medio de expansión de organoides pulmonares humanos suplementados con cinco nanomolares de heregulina beta 1 a cada pozo e incube la placa en una incubadora de cultivo celular. Después de tres días, retire el medio viejo mientras mantiene la gota intacta y agregue cuidadosamente el medio fresco. Después de 10 a 14 días de pase, observe los organoides bajo un microscopio y asegúrese de que los organoides no estén incrustados con una densidad celular muy alta.Para pasar los organoides pulmonares con cizallamiento, rompa las gotas mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo con una punta de un mililitro. Luego, transfiera los organoides junto con el medio a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y ajuste el volumen a 10 mililitros con un medio basal frío. Centrifugar el tubo a 300 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, desechar el sobrenadante y lavar los organoides con 10 mililitros de medio basal frío.Luego, resuspende los organoides en dos mililitros de medio basal frío y cizalla en trozos pequeños con una pipeta Pasteur. A continuación, agregue el medio basal a un volumen total de 10 mililitros y centrífuga antes de volver a depositar los fragmentos organoides con una matriz de basamento frío suficiente para permitir una expansión de 1: 3 a 1: 5 y coloque los tubos en hielo. Dispense 40 microlitros de suspensión organoide en cada pocillo de una placa de 24 pocillos precalentada para incubar a 37 grados Celsius para permitir que la matriz del sótano se solidifique durante 10 a 15 minutos.Más tarde, agregue 500 microlitros de medio de expansión organoide pulmonar a cada pozo e incube en una incubadora de cultivo celular. Refrescar el medio cada tres días y pasar los organoides cada dos semanas. Para pasar organoides pulmonares con tripsinización, resuspend extrajo organoides pulmonares en un mililitro de enzima de disociación.Incubar el organoide en un baño de agua de 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos. Luego, agregue un mililitro de medio basal al tubo y corte los organoides mecánicamente mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Verifique el tamaño de las piezas organoides bajo un microscopio a un aumento de 100X antes de terminar la digestión con 40 microlitros de suero fetal bovino.Enrasar el volumen hasta 10 mililitros con medio basal y centrífuga antes de volver a depositar las piezas organoides en una matriz de basamento frío con un volumen suficiente para pasar con una proporción de 1:5 a 1:10. Más tarde, dispensar 40 microlitros de suspensión organoide en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y cultivar la placa como se demostró anteriormente. Para generar organoides 3D de las vías respiratorias, incube los organoides pulmonares en el medio de expansión durante siete a 10 días después del paso a través de la cizalladura mecánica.Luego, reemplace el medio de expansión con el medio de diferenciación proximal e incube los organoides en una incubadora de cultivo celular. Después de 14 días, deseche el medio en cada pocillo y agregue tampón de lisado celular para cosechar el organoide diferenciado de las vías respiratorias para la extracción de ARN y la detección de la expresión génica celular mediante el ensayo RT-qPCR. Preincuba los insertos en la incubadora de cultivo celular con 250 y 500 microlitros del medio basal en la cámara superior e inferior de una placa de 24 pocillos, respectivamente.Luego, agregue un mililitro de medio basal al tubo y pipetee hacia arriba y hacia abajo para cortar los organoides en células individuales. Observe las células bajo un microscopio antes de terminar la digestión con 40 microlitros de suero fetal bovino. Filtre las células a través de un colador de 40 micras en un tubo de 50 mililitros y transfiera la suspensión de células filtradas a un tubo de 15 mililitros.Recarga la suspensión con medio basal hasta un volumen total de 10 mililitros. Después de la centrifugación, resuspender el pellet recogido de 24 gotas en 1 a 2,5 mililitros de medio de expansión organoide pulmonar, dependiendo de la densidad celular. Cuente el número de células con el contador celular bajo un microscopio, luego ajuste la concentración celular a 1.3 veces 10 a seis por mililitro para insertos de 24 pocillos.Retire el medio basal de las cámaras superior e inferior antes de agregar 500 microlitros de medio de expansión en la cámara inferior. Separe 100 microlitros de suspensión celular preparados anteriormente en la cámara apical del inserto de 24 pocillos e incuben. Después de dos días, reemplace el medio de expansión con un medio de diferenciación proximal tanto en la cámara apical como en la inferior de la placa.Incubar los organoides durante 14 días y refrescar el medio cada tres días. Mida la resistencia eléctrica transepitelial todos los días utilizando un sistema de medición de resistencia eléctrica. En la microfotografía representativa, las células pulmonares recién aisladas se pueden ver incrustadas en la matriz de membrana basal del factor de crecimiento reducido tipo dos.Los organoides quísticos fueron apareciendo y creciendo con el tiempo. Los organoides pulmonares después del cuarto pasaje se muestran aquí. A las dos horas de la cizalladura mecánica, los fragmentos organoides incrustados en el extracto de la membrana basal formaron los dominios quísticos.La microfotografía del mismo campo en el quinto día confirmó el crecimiento de organoides a lo largo del tiempo. Los organoides en expansión albergaban los cuatro tipos principales de células epiteliales de las vías respiratorias, incluidas las células ciliadas positivas para ACCTUB o FOXJ1 positivas, las células basales P63 positivas, las células club CC10 positivas y las células caliciformes positivas para MUC5AC en un estado prematuro. Los organoides incubados en el medio de expansión y diferenciación proximal desarrollaron una morfología distinta a lo largo del tiempo.Después de dos semanas de diferenciación en el medio de diferenciación proximal, los cilios móviles fueron discernibles en cada organoide. Se observó que la celia que golpeaba sincrónicamente conducía los desechos celulares dentro de la luz organoide y los arremolinaba unidireccionalmente para eliminar las partículas inhaladas. Además, el análisis de citometría de flujo demostró que los organoides diferenciados acomodaron cuatro tipos de células epiteliales de las vías respiratorias en el medio de diferenciación y expansión proximal.Después de dos semanas de diferenciación, los organoides de las vías respiratorias 2D desarrollaron una barrera epitelial intacta. Se realizó un ensayo de bloqueo de dextrano para evaluar la integridad de la barrera epitelial formada en organoides de las vías respiratorias 2D. Los organoides 2D contenían abundantes células ciliadas.El organoide pulmonar expandible a largo plazo y el organoide diferenciado de las vías respiratorias proporcionan un sistema modelo fisiológicamente activo y universal para estudiar la biología y la patología respiratorias, incluida la COVID-19.

establishing-human-lung-organoids-proximal-differentiation-to

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo dirige eficientemente madre embrionarias de ratón endodermo definitivo derivado de las células de las vías respiratorias para madurar las células epiteliales. Esta técnica utiliza la diferenciación 3 dimensiones andamios pulmonares descelularizados para dirigir especificación linaje de pulmón, en un entorno de cultivo definido, libre de suero.

Generación de células epiteliales de las vías respiratorias del ratón ESC-Obtenido usando Descelularizado pulmón andamios

Este artículo proporciona una metodología detallada para los enfoques de disociación tisular y fraccionamiento celular que permiten el enriquecimiento de células epiteliales viables de las regiones proximal y distal del pulmón humano. En este caso, estos enfoques se aplican para el análisis funcional de células progenitoras epiteliales pulmonares mediante el uso de modelos de cultivo de organoides 3D.

Aislamiento y enriquecimiento de células progenitoras epiteliales pulmonares humanas para cultivo de organoides

Describimos un protocolo simple para desarrollar organoides epiteliales mucociliares a partir de células ectoderm profundas aisladas de embriones Xenopus laevis. Los progenitores multipotentes regeneran precursores de células de copa epitelial y permiten el seguimiento en vivo de la iniciación y progresión de las transiciones celulares en la superficie de los organoides.

Organoides epiteliales mucocilios de células embrionarias de Xenopus: generación, cultura e imágenes en vivo de alta resolución

El artículo describe la diferenciación dirigida paso a paso de células madre pluripotentes inducidas a organoides pulmonares enteros tridimensionales que contienen células pulmonares epiteliales proximales y distales junto con mesénquima.

Generación de organoides pulmonares enteros en 3D a partir de células madre pluripotentes inducidas para modelar la biología y la enfermedad del desarrollo pulmonar

El protocolo describe un biorreactor habilitado para imágenes que permite la eliminación selectiva del epitelio endógeno de la tráquea de la rata y la distribución homogénea de las células exógenas en la superficie de la luz, seguido de un cultivo in vitro a largo plazo de la construcción célula-tejido.

Biorreactor guiado por imágenes para generar tejido biodiseñado de las vías respiratorias

Los avances recientes en los protocolos de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por humanos permiten la derivación gradual de tipos de células específicas de órganos. Aquí, proporcionamos pasos detallados para el mantenimiento y la expansión de las células basales de las vías respiratorias derivadas de iPSC y su diferenciación en un epitelio mucociliar en cultivos de interfaz aire-líquido.

Generación de cultivos de interfaz aire-líquido de células epiteliales de las vías respiratorias a partir de células madre pluripotentes humanas

Este artículo describe la generación de un modelo complejo de barrera multicelular de la vía aérea compuesto por epitelio pulmonar derivado de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), mesénquima, células endoteliales y macrófagos en un cultivo de interfaz aire-líquido.

Cocultivo epitelial, mesenquimatal, endotelial e inmunitario derivado de iPSC para modelar la integridad de la barrera de las vías respiratorias en la salud y la enfermedad pulmonar

En este protocolo de vídeo damos una explicación paso a paso de la transducción lentiviral en organoides del epitelio intestinal primario y del procesamiento y análisis posterior de estos cultivos mediante RT-PCR cuantitativo, microarrays de ARN e inmunohistoquímica.

Un protocolo para la de Lentiviral Transducción y Análisis de Aguas abajo de Intestinal organoides

El cultivo agregado de adipocitos maduros de membrana (MAAC) es un nuevo método para el cultivo de adipocitos humanos maduros. Aquí detallamos cómo aislar adipocitos de adiposo humano y cómo configurar MAAC.

Aislamiento y cultivo de adipocitos maduros humanos utilizando cultivos agregados de adipocitos maduros de membrana (MAAC)

Toda la estructura 3D y el contenido celular de los organoides, así como su parecido fenotípico con el tejido original se pueden capturar utilizando el protocolo de imágenes 3D de resolución de una sola célula descrito aquí. Este protocolo se puede aplicar a una amplia gama de organoides que varían en origen, tamaño y forma.

Imagen tridimensional de resolución de una sola célula de organoides intactos

Aprende a establecer organoides pulmonares humanos a partir de tejidos primarios y diferenciarlos proximalmente para generar modelos 3D que simulan el epitelio respiratorio humano con precisión fisiológica.

Establecimiento de organoides pulmonares humanos y diferenciación proximal para generar organoides maduros de las vías respiratorias (Video) | JoVE Journal

Establecimiento de organoides pulmonares humanos y diferenciación proximal para generar organoides maduros de las vías respiratorias

Explorar más videos