Caracterización de la peritonitis séptica inducida por Salmonella Typhimurium en ratones

La sepsis es una respuesta inmune desregulada del huésped a la invasión microbiana o daño tisular, que conduce a una lesión orgánica en un sitio distante del de la infección o el daño. El público en general se ha vuelto más consciente de este trastorno, durante la pandemia de COVID-19. En 2017, hubo 48,9 millones de incidencias de sepsis y 11 millones de muertes en todo el mundo, lo que representa casi el 20% de todas las muertes mundiales.

Como es de esperar, la mayoría de los casos son en hospitales. De hecho, un estudio encontró que casi el 62% de los aislamientos positivos de pacientes en UCI con sepsis, eran organismos gramnegativos. Hay varios modelos, y algunos de los modelos de sepsis de ratones comúnmente utilizados incluyen la endotoxemia inducida por LPS, el modelo de ligadura cecal y punción, y los sistemas de modelos de infección monobacteriana.

En nuestro laboratorio, hemos estandarizado un sistema modelo de ratón, para inducir sepsis peritoneal utilizando Salmonella Typhimurium. Este modelo es ventajoso sobre otros, ya que Salmonella Typhimurium es un patógeno intracelular que imita la condición clínicamente relevante de la sepsis gramnegativa. El resultado de la sepsis de peritonitis en este modelo, es sistémico con un 100% de mortalidad, dentro de las 96 horas posteriores a la infección.

Por lo tanto, este modelo es fundamental en el estudio de las respuestas inflamatorias del huésped. En este modelo, la sepsis se induce mediante la inyección intraperitoneal de 0,5 millones de UFC de Salmonella Typhimurium, en un ratón C57BL/6 de 8-10 semanas de edad. La infección sistémica se puede confirmar, mediante la evaluación de la carga bacteriana de los órganos, aproximadamente 16 horas después de la infección.

Los experimentos con Salmonella Typhimurium requieren la instalación de BSL-2 y el cumplimiento de las pautas de BSL-2. Se debe tener cuidado de usar el EPP adecuado, garantizar la seguridad y seguir los métodos estándar de eliminación de riesgos biológicos BSL-2. Todos los experimentos han sido aprobados por el comité institucional de ética animal.

Preparación de cultivo de Salmonella Typhimurium. Agregue cien microlitros de Salmonella Typhimurium NCTC 12023 glycerol stock, en 3 ml de caldo LB. Incubar el cultivo a 160 revoluciones por minuto, a 37 grados centígrados durante la noche.

Raye 50 microlitros del cultivo cultivado durante la noche en caldo LB, en un plato de agar Salmonella Shigella, e incube a 37 grados centígrados durante 12 horas. Elija una sola colonia de la placa de agar SS rayada, usando una micropunta. Expulse la micropunta en 3 ml de caldo LB y cultive a 160 RPM a 37 grados centígrados durante la noche.

Agregue 0.1 ml del cultivo bacteriano en 50 ml de caldo LB e incube a 37 grados centígrados, en una incubadora agitadora a 160 RPM, durante tres o cuatro horas, para alcanzar la fase logarítmica de crecimiento. Diluir el cultivo por un factor de dos usando caldo LB. Medir la densidad óptica del cultivo a una longitud de onda de luz de 600 nanómetros en un espectrofotómetro.

Una vez que el OD alcance uno, hacer dos alícuotas de 1 mL de cultivo, en tubos de microfuge de 1,5 mL. Centrifugar los tubos a 7, 750 G durante 15 minutos. Deseche este sobrenadante y lave el pellet con 1 ml de 1XPBS dos veces.

Centrifugar los tubos a 7, 750 G durante 15 minutos. Resuspender el pellet en 0.5 mL de 1XPBS, en dos tubos de microfuge diferentes de 1.5 mL. Combine las suspensiones de ambos tubos, en un tubo de 1,5 ml, que ahora contiene, aproximadamente dos multiplicados por 10 elevados a la potencia de ocho unidades formadoras de colonias por ml.

Preparar una suspensión celular bacteriana de 10 potencia seis UFC/ml, diluyendo la solución madre. Nota importante, optimice la UFC correspondiente a la OD en su laboratorio, para determinar la CFU para la OD uno, antes de iniciar los experimentos. Ratones e infecciones.

El día de la infección, sostenga al ratón con una mano, limpie la piel abdominal con etanol al 70% y extienda las patas traseras para una mejor accesibilidad de la pared abdominal. Inyecte 0,5 ml de 10 elevados a la potencia seis UFC/ml de suspensión bacteriana por vía intraperitoneal, con la ayuda de una jeringa de 1 ml. Después de la infección, placa el cultivo para verificar la UFC real inyectada, que puede variar de 0.2 a 0.8 millones de UFC por 0.5 ml.

Evaluación de órganos de la UFC. El ratón fue sacrificado usando asfixia por dióxido de carbono. Después de sacrificar el ratón infectado, limpie el abdomen con un trozo de algodón, sumergido en etanol al 70%.

Abra la piel abdominal. Consulte el artículo de Ray y Dittle, para obtener un protocolo de video, sobre cómo recolectar líquido de lavado peritoneal. Cortar abrir la cavidad peritoneal y recoger el órgano de interés.

En este video, estamos demostrando la enumeración de la UFC de órgano del hígado. El hígado sufre un extenso daño histopatológico, en este modelo de sepsis. Corte un pequeño trozo de hígado y colóquelo en un tubo de microfuge.

Esto se puede almacenar en hielo durante dos o tres horas, antes de continuar con el siguiente paso. Pesa la pieza y transfiérela a un tubo de microfuge. Preferiblemente, cortar las piezas que pesan alrededor de 10 a 15 mg, para una homogeneización adecuada.

Agregue 0.5 mL de 1XPBS en el tubo y homogeneice los órganos usando un homogeneizador de mano. Asegúrese de que los órganos estén completamente homogeneizados. Haga el volumen a 1 mL, agregando 0.5 mL de 1XPBS.

Centrifugar los tubos a 200 G durante cinco minutos, a cuatro grados centígrados. Recoge el sobrenadante en tubos de microfuge frescos. Prepare diluciones de 10 a la potencia menos uno, y 10 a la potencia menos dos, en una placa de 96 pocillos.

Extienda 50 microlitros del diluyente, sobre placas de agar SS frescas, e incube las placas a 37 grados centígrados durante 12 horas. Cuente el número de colonias que aparecen en cada condición y normalice los datos con el peso del órgano, utilizando la siguiente fórmula. Ufc/mg es igual al número de colonias, multiplicado por 20, multiplicado por el factor de dilución, el conjunto dividido por el peso del órgano en mg.

Tenga en cuenta que el número 20 se utiliza en la fórmula, para convertir las colonias por placa a UFC/ml. A este número se llega, dividiendo 1 mL de la cantidad de un volumen dado de cultivo chapado. En este caso, 50 microlitros.

Por ejemplo, si encuentra cien colonias en una placa de agar SS, donde se extienden 50 microlitros de 10 potencias menos una dilución de órgano homogeneizado, que pesa 10 mg, entonces ufc / mg será igual a 100 multiplicado por 20, multiplicado por 10, el todo dividido por 10, que es igual a 2000 UFC / mg. Análisis citométrico de flujo de diversas poblaciones de células inmunes en exudado peritoneal. Recolectar las células peritoneales como se describió anteriormente, por Ray y Dittle.

Resuspend el pellet celular del líquido de lavado peritoneal, en 1 mL de RPMI suplementado con 10% FBS. Enumere los números totales de células en el lavado peritoneal, utilizando un hemocitómetro. Ajuste el número de celda de tal manera, que cada tubo reciba de dos a cinco multiplicado por 10 elevado a la potencia cinco celdas.

Haga girar las células hacia abajo a 200 G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante. Lave las células una vez con 1XPBS.

Centrifugar las células a 200 G durante 10 minutos. Bloquee los receptores Fc usando el bloqueador FcR. Una es a la dilución 400, preparada en tampón de bloqueo, que consiste en 5% FBS y 0.02% de azida de sodio en PBS.

Incubar en hielo durante 15 minutos. Centrifugar las células a 200 G durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante.

Diluir los anticuerpos conjugados fluorocromo de interés en el tampón de bloqueo. Aquí, usamos uno es a 500 dilución de Ly6G anti-ratón, para teñir neutrófilos. Tenga en cuenta que también se pueden mostrar otras poblaciones de células inmunes, utilizando B220 anti-ratón para células B, CD3 anti-ratón para células T, anti-ratón F4/80 para macrófagos, etc.

Incubar alrededor de 0,2 millones de células en 200 microlitros de soluciones diluidas de anticuerpos, en tubos separados. Como control negativo, reserve un tubo en cada tipo de fluorocromo, para el control no manchado. En este tubo, incubar las células con 200 microlitros de tampón de bloqueo sin anticuerpos.

Incubar las muestras en hielo durante 45 minutos, con tapping intermitente cada 15 minutos. Centrifugar las células a 200 G durante 10 minutos, a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante.

Fije las células con 4% de paraformaldehído durante 15 minutos a temperatura ambiente, si es necesario almacenarlas durante varios días. Resuspend las células en 200 microlitros de tampón de tinción FACS, 2% FBS en PBS. Adquirir los datos en el citómetro de flujo.

Las imágenes de las placas de agar SS que se muestran aquí, indican la carga de CFU del órgano en el hígado y el bazo de ratones sépticos. El órgano homogeneizado Lys6 se extendió a la dilución de 10 a la potencia menos uno, y se incubó a 37 grados centígrados. Las colonias de S.Typhimurium pigmentadas de negro aparecieron después de aproximadamente 12 horas después de la incubación.

Una parte de la placa se muestra aquí como un recuadro ampliado para resaltar las colonias. Estos resultados sugieren que el patógeno se diseminó con éxito sistémicamente y colonizó los órganos internos. Esta figura muestra los sueros aislados de ratones sanos y sépticos.

El volumen de sangre recolectable de ratones sépticos es menor que el de los controles sanos, por lo que el suero obtenido es menor. Esto sucede debido al aumento de la coagulación en la sepsis. También los sueros de ratones sépticos, muestran una coloración roja distinta, lo que indica la aparición de hemólisis extensa.

La figura muestra gráficas citométricas de células peritoneales de ratones sanos y sépticos, teñidas con anticuerpos anti-Ly6G. Estas imágenes son representativas de un ratón sano y dos infectados. Los ratones sépticos vieron un aumento de la infiltración de neutrófilos en la cavidad peritoneal.

En este vídeo, hemos mostrado un método de inducción de sepsis bacteriana en ratones, mediante inyección intraperitoneal de Salmonella Typhimurium. Este es un modelo útil para estudiar los efectos de las intervenciones terapéuticas en la atenuación de la sepsis. En este sistema modelo, la composición celular de la cavidad peritoneal cambia drásticamente para combatir el patógeno.

Por lo tanto, es un modelo útil, en el estudio de los cambios cinéticos en las composiciones y funciones de las células inmunes durante la sepsis. El modelo también es útil para comprender el aumento de las especies reactivas intercelulares de oxígeno, los niveles de citoquinas proinflamatorias, la hemólisis y la coagulación de la sangre, todo lo cual ocurre durante la sepsis.