Purificación e identificación de proteínas específicas de tipo celular a partir de tejidos complejos utilizando una línea de ratón de ARNt sintetasa de metionina mutante
13 de abril de 2022
Este protocolo describe cómo realizar el marcado de proteínas específicas del tipo celular con azidonorleucina (ANL) utilizando una línea de ratón que expresa una sintetasa de ARNt de L274G-Metionina mutante (MetRS*) y los pasos necesarios para el aislamiento de proteínas específicas de tipo celular marcadas. Describimos dos posibles vías de administración de ANL en ratones vivos mediante (1) agua potable y (2) inyecciones intraperitoneales.
Este protocolo permite etiquetar proteínas de una manera específica para el tipo de célula. Esta es la primera técnica que ofrece tal posibilidad y se puede hacer in vitro o in vivo. La principal ventaja de la técnica es que las proteínas específicas del tipo celular marcado pueden purificarse sin identificar o visualizarse in situ mediante inmunofluorescentes.
Para comenzar a preparar el lisado tisular añadiendo tampón de lisis a un volumen de 12 a 15 veces el peso húmedo del tejido y triturar el tejido hasta homogeneizarlo. Caliente este homogeneizado durante 15 minutos a 75 grados centígrados para desnaturalizar la proteína, luego centrifugar la muestra y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Esta muestra se puede almacenar a menos 80 grados centígrados.
A continuación, para la alquilación, diluya la muestra homogeneizada de dos a tres veces en tampón salino fosfato que contenga un inhibidor de la proteasa libre de EDTA. Luego agregue yodoacetamida recién preparada a una concentración final de 20 milimoles. Deje la muestra durante una o dos horas a 20 grados centígrados en la oscuridad.
Repita los pasos de adición e incubación de yodoacetamida dos veces. Prepare la columna según las instrucciones del fabricante primero haciendo vórtice de las columnas. Luego retirando la tapa cortando la parte inferior y centrifugandolas.
A continuación, realice un intercambio de búfer equilibrando primero las columnas de intercambio de búfer utilizando el búfer de intercambio de química de clic y, a continuación, intercambiando todas las muestras alquiladas. Para evaluar la incorporación de azidonorleucina tomar 40 microlitros de la muestra aludida y añadir tampón salino fosfato a un volumen final de 120 microlitros. Luego configure la reacción química de clic haciendo vórtice la reacción durante 20 segundos.
Después de agregar cada reactivo en el orden indicado lo más rápido posible, incubar las muestras en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante la noche con rotación continua. Al día siguiente, centrifugar las muestras durante cinco minutos a 17, 000 veces G después de la centrifugación se verá un pellet ligeramente turquesa. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y almacene la muestra a menos 80 grados centígrados.
Para purificación de proteínas etiquetadas. Someter todas las muestras a un procedimiento de intercambio de tampón como se demuestra para limpiar las sobras de alquino libre utilizando el tampón de unión de neutravidina como tampón de equilibrio. Luego lave las perlas de neutravidina de alta capacidad tres veces mezclando las perlas con el tampón de unión.
Centrifuga la mezcla, desecha el sobrenadante y repite esto tres veces. Luego prepare una suspensión uno a uno agregando el mismo volumen de perlas secas de neutravidina y tampón de unión de neutravidina. Guarde de 20 a 40 microlitros de cada muestra como lisado prepurificado y guárdelo a menos 20 grados centígrados.
Después de medir la concentración de proteína de la muestra, mezcle un miligramo de proteína con 40 microlitros de la suspensión de perlas. Incubar la mezcla durante la noche a cuatro grados centígrados con rotación continua que permite que las proteínas marcadas se unan a las perlas. Al día siguiente recoger el sobrenadante por centrifugación.
Coloque una alícuota de 20 a 40 microlitros del sobrenadante a un lado para su posterior análisis y congele el resto a menos 80 grados centígrados. A continuación, lave las perlas tres veces agregando un tampón de lavado de neutravidina enfriado. Sedimentar las cuentas y desechar el sobrenadante.
Luego agregue el mismo tampón e incube las perlas durante 10 minutos bajo rotación continua a cuatro grados centígrados antes de desechar el sobrenadante. Repita el lavado con los amortiguadores de lavado de neutravidina dos y tres, y eluya las proteínas clicadas incubando las perlas durante 30 minutos a 20 grados centígrados con un volumen de tampón de elución de neutravidina, correspondiente a un volumen de las perlas secas utilizadas. Durante la elución, mantenga las perlas en suspensión a 1000 revoluciones por minuto en un agitador de bloque térmico eludir dos veces y combine ambos eluidos.
Las reacciones de clic se analizaron mediante la página SDS y Western immuno blot. Se muestran imágenes representativas de los experimentos para la administración de azidonorleucina por inyección intraperitoneal y para la administración de azidonorleucina a través del agua potable. Otro experimento proporciona un ejemplo para la determinación de la concentración óptima de alquino escindible de biotina disulfuro.
En este ejemplo, el cambio de pliegue entre la muestra marcada y el control es más alto a 14 Concentración de alquino micromolar. Aquí se muestra un ejemplo de un resultado de espectrometría de masas con un enriquecimiento claro en la muestra marcada con azidonorleucina en comparación con el control. Esta diferencia ya era visible en la tinción de proteína total.
Además de los cambios en la intensidad del péptido, también hay proteínas únicas que se encuentran en ambas muestras. Este es un protocolo técnicamente complejo y es un paso que debe seguirse cuidadosamente utilizando la alquilación de controles negativos adecuados, la limpieza adecuada (indistinta) y adecuada del archivo sin clic. Nuestros pasos clave en este protocolo, las proteínas purificadas pueden identificarse mediante espectrometría de masas si el interés de los investigadores es estudiar proteínas o cargarlas en un gel para estudiar proteínas de interés por Western blot.
La capacidad de este método para marcar proteínas de un origen celular específico tiene muchas aplicaciones como la tensión de proteínas o el estudio de la síntesis de proteínas in vitro o in vivo.
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Visión general
Este protocolo describe un enfoque novedoso para el etiquetado de proteínas específicas de tipos celulares utilizando azidonorleucina (ANL) con un modelo de ratón que expresa una sintetasa de tRNA de metionina mutante L274G (MetRS*). La técnica permite el etiquetado, la purificación y la visualización de proteínas in vitro e in vivo, facilitando el estudio de la síntesis de proteínas y la función celular.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Química de proteínas
Antecedentes
- Este protocolo permite el etiquetado selectivo de proteínas específicas de ciertos tipos celulares.
- Demuestra aplicaciones tanto in vitro como in vivo.
- El uso de azidonorleucina representa un avance en las técnicas de etiquetado de proteínas.
- La inmunofluorescencia puede utilizarse para visualizar proteínas etiquetadas.
Propósito del estudio
- Establecer un método para aislar proteínas específicas de tipos celulares.
- Proporcionar pasos detallados para el etiquetado y la purificación de proteínas.
- Mejorar el análisis de la síntesis de proteínas en varios contextos celulares.
Métodos utilizados
- El estudio involucra un modelo de ratón que expresa MetRS* para el etiquetado de proteínas.
- Los pasos detallados incluyen la preparación de lisados de tejido, alquilación y procedimientos de purificación usando perlas de neutravidina.
- Se emplean reacciones de click chemistry para evaluar la incorporación de azidonorleucina.
- Se describen protocolos para rutas de administración de ANL tanto por agua potable como intraperitoneal.
Resultados principales
- Se demostró el etiquetado exitoso de proteínas mediante varias técnicas de purificación.
- Se observó una clara distinción en las muestras etiquetadas, indicando una incorporación efectiva de azidonorleucina.
- Los hallazgos clave incluyen la identificación de proteínas únicas posiblemente vinculadas a los procesos biológicos bajo estudio.
- El protocolo enfatiza controles rigurosos y una ejecución cuidadosa para garantizar la fiabilidad.
Conclusiones
- Este estudio proporciona un protocolo único y complejo para estudiar proteínas específicas de tipos celulares.
- La capacidad de etiquetar proteínas ofrece valiosas ideas sobre los mecanismos celulares y la síntesis de proteínas.
- Los hallazgos pueden mejorar nuestra comprensión de varias funciones biológicas y modelos de enfermedades.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Cell-type-specific protein labeling and purification using the MetRS* mouse line enables precise interrogation of proteomic changes within complex tissues, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. This approach reduces sample complexity, allowing for the identification of subtle proteomic shifts relevant to disease and therapeutic intervention. The method enhances predictive confidence at critical inflection points in the discovery pipeline by enabling direct measurement of newly synthesized proteins in defined cellular populations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of protein synthesis dynamics in specific cell types within heterogeneous tissues.
- Supports functional target validation by isolating proteomic changes linked to genetic or pharmacological perturbations.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying cell-type contributions to disease-relevant pathways.
- Improves predictive confidence for target engagement and downstream biological effects.
Screening & Assay Development
- Provides validated, cell-type-specific proteomes for downstream assay development and screening workflows.
- Enables quantitative and reproducible measurement of newly synthesized proteins for assay standardization.
- Supports scalability and platform reuse by allowing both in vitro and in vivo applications.
- Improves reliability of compound evaluation by reducing background from non-target cell types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns proteomic outputs with disease-relevant cellular populations for translational biomarker discovery.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by tracking protein synthesis in vivo.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing cell-type-resolved proteomic data.
- Enhances predictive de-risking for translational research by clarifying cellular mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical research, providing a reusable platform for cell-type-specific proteomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling selective protein labeling in defined cell populations.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative proteomic outputs for assay readiness and compound screening.
- Analytics: Provides mass spectrometry and immunoblot readouts to compare proteomic profiles across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery-stage findings to preclinical models by enabling in vivo protein synthesis tracking.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable workflow for repeated use across diverse research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable proteomic workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying cell-type-specific effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, mouse genetics, and click chemistry techniques.
- Demands access to mass spectrometry, immunoblotting, and specialized labeling reagents.
- Necessitates rigorous cross-team standardization and negative controls to ensure data reliability.
- May require adaptation for different tissue types or model systems based on cellular complexity.
- Technical complexity and need for careful execution are critical for reproducible results.
