Purificación e identificación de proteínas específicas de tipo celular a partir de tejidos complejos utilizando una línea de ratón de ARNt sintetasa de metionina mutante

Este protocolo permite etiquetar proteínas de una manera específica para el tipo de célula. Esta es la primera técnica que ofrece tal posibilidad y se puede hacer in vitro o in vivo. La principal ventaja de la técnica es que las proteínas específicas del tipo celular marcado pueden purificarse sin identificar o visualizarse in situ mediante inmunofluorescentes.

Para comenzar a preparar el lisado tisular añadiendo tampón de lisis a un volumen de 12 a 15 veces el peso húmedo del tejido y triturar el tejido hasta homogeneizarlo. Caliente este homogeneizado durante 15 minutos a 75 grados centígrados para desnaturalizar la proteína, luego centrifugar la muestra y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Esta muestra se puede almacenar a menos 80 grados centígrados.

A continuación, para la alquilación, diluya la muestra homogeneizada de dos a tres veces en tampón salino fosfato que contenga un inhibidor de la proteasa libre de EDTA. Luego agregue yodoacetamida recién preparada a una concentración final de 20 milimoles. Deje la muestra durante una o dos horas a 20 grados centígrados en la oscuridad.

Repita los pasos de adición e incubación de yodoacetamida dos veces. Prepare la columna según las instrucciones del fabricante primero haciendo vórtice de las columnas. Luego retirando la tapa cortando la parte inferior y centrifugandolas.

A continuación, realice un intercambio de búfer equilibrando primero las columnas de intercambio de búfer utilizando el búfer de intercambio de química de clic y, a continuación, intercambiando todas las muestras alquiladas. Para evaluar la incorporación de azidonorleucina tomar 40 microlitros de la muestra aludida y añadir tampón salino fosfato a un volumen final de 120 microlitros. Luego configure la reacción química de clic haciendo vórtice la reacción durante 20 segundos.

Después de agregar cada reactivo en el orden indicado lo más rápido posible, incubar las muestras en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante la noche con rotación continua. Al día siguiente, centrifugar las muestras durante cinco minutos a 17, 000 veces G después de la centrifugación se verá un pellet ligeramente turquesa. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y almacene la muestra a menos 80 grados centígrados.

Para purificación de proteínas etiquetadas. Someter todas las muestras a un procedimiento de intercambio de tampón como se demuestra para limpiar las sobras de alquino libre utilizando el tampón de unión de neutravidina como tampón de equilibrio. Luego lave las perlas de neutravidina de alta capacidad tres veces mezclando las perlas con el tampón de unión.

Centrifuga la mezcla, desecha el sobrenadante y repite esto tres veces. Luego prepare una suspensión uno a uno agregando el mismo volumen de perlas secas de neutravidina y tampón de unión de neutravidina. Guarde de 20 a 40 microlitros de cada muestra como lisado prepurificado y guárdelo a menos 20 grados centígrados.

Después de medir la concentración de proteína de la muestra, mezcle un miligramo de proteína con 40 microlitros de la suspensión de perlas. Incubar la mezcla durante la noche a cuatro grados centígrados con rotación continua que permite que las proteínas marcadas se unan a las perlas. Al día siguiente recoger el sobrenadante por centrifugación.

Coloque una alícuota de 20 a 40 microlitros del sobrenadante a un lado para su posterior análisis y congele el resto a menos 80 grados centígrados. A continuación, lave las perlas tres veces agregando un tampón de lavado de neutravidina enfriado. Sedimentar las cuentas y desechar el sobrenadante.

Luego agregue el mismo tampón e incube las perlas durante 10 minutos bajo rotación continua a cuatro grados centígrados antes de desechar el sobrenadante. Repita el lavado con los amortiguadores de lavado de neutravidina dos y tres, y eluya las proteínas clicadas incubando las perlas durante 30 minutos a 20 grados centígrados con un volumen de tampón de elución de neutravidina, correspondiente a un volumen de las perlas secas utilizadas. Durante la elución, mantenga las perlas en suspensión a 1000 revoluciones por minuto en un agitador de bloque térmico eludir dos veces y combine ambos eluidos.

Las reacciones de clic se analizaron mediante la página SDS y Western immuno blot. Se muestran imágenes representativas de los experimentos para la administración de azidonorleucina por inyección intraperitoneal y para la administración de azidonorleucina a través del agua potable. Otro experimento proporciona un ejemplo para la determinación de la concentración óptima de alquino escindible de biotina disulfuro.

En este ejemplo, el cambio de pliegue entre la muestra marcada y el control es más alto a 14 Concentración de alquino micromolar. Aquí se muestra un ejemplo de un resultado de espectrometría de masas con un enriquecimiento claro en la muestra marcada con azidonorleucina en comparación con el control. Esta diferencia ya era visible en la tinción de proteína total.

Además de los cambios en la intensidad del péptido, también hay proteínas únicas que se encuentran en ambas muestras. Este es un protocolo técnicamente complejo y es un paso que debe seguirse cuidadosamente utilizando la alquilación de controles negativos adecuados, la limpieza adecuada (indistinta) y adecuada del archivo sin clic. Nuestros pasos clave en este protocolo, las proteínas purificadas pueden identificarse mediante espectrometría de masas si el interés de los investigadores es estudiar proteínas o cargarlas en un gel para estudiar proteínas de interés por Western blot.

La capacidad de este método para marcar proteínas de un origen celular específico tiene muchas aplicaciones como la tensión de proteínas o el estudio de la síntesis de proteínas in vitro o in vivo.