Name: Purificación e identificación de proteínas específicas de tipo celular a partir de tejidos complejos utilizando una línea de ratón de ARNt sintetasa de metionina mutante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Aprende a purificar e identificar proteínas específicas de tipo celular desde tejidos complejos utilizando un modelo de ratón MetRS* mutante. Este método avanza el estudio de la síntesis proteica in vitro e in vivo.

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B.A-C está financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), por la Comunidad de Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) y las ayudas MICINN (PID2020-113270RA-I00). R. A-P está financiado por la Comunidad de Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. está financiado por la Sociedad Max Planck, un premio Advanced Investigator del Consejo Europeo de Investigación (subvención 743216), DFG CRC 1080: Mecanismos moleculares y celulares de la homeostasis neuronal, y DFG CRC 902: Principios moleculares de la regulación basada en ARN. Agradecemos a D.C Dieterich y P. Landgraf por su asesoramiento técnico y la síntesis del DST-Alkyne. Agradecemos a E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast y a la instalación animal del MPI for Brain Research por su excelente apoyo. Agradecemos a Sandra Goebbels por compartir la línea de ratones Nex-Cre. Agradecemos a Antonio G. Carroggio por su ayuda con la edición en inglés. B.A-C. Diseñé, conduje y analicé experimentos. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. y S. t. D. realizó y analizó experimentos. B.A-C y E.M.S. diseñaron experimentos, y supervisaron el proyecto, B.A-C escribió el artículo. Todos los autores editaron el artículo.

Todos los experimentos con animales se realizaron con permiso de las oficinas gubernamentales locales en Alemania (RP Darmstadt; protocolos: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) o España (Comité de Experimentación Animal de la UCM y Consejería Ambiental de la Comunidad de Madrid, número de protocolo: PROEX 005.0/21) y cumplen con las normas de la Sociedad Max Planck y la normativa española y siguen las directrices de la UE para el bienestar animal.
1. Etiquetado metabólico in vivo con ANL
<ol><li>Agua potable:<ol><li>Disuelva ANL y maltosa en el agua potable regular de los ratones. La concentración de maltosa recomendada es de 0,7% (peso / vol). La cantidad máxima de ANL añadida al agua potable es del 1% (peso / vol). Una vez que la mezcla esté lista, esterilizarla por filtración y almacenarla a 4 °C.</li>
		<li>Proporcionar la mezcla preparada en el paso 1.1 a los ratones. Cambie las botellas con frecuencia (por ejemplo, cada 3 días) para evitar contaminaciones y revíselas todos los días para buscar posibles contaminaciones u obstrucciones. Controle la cantidad de agua potable diariamente pesándola, para conocer la ingesta de ANL de los ratones. NOTA: El período máximo de etiquetado evaluado aquí es de 3 semanas utilizando una concentración de ANL del 1% en el agua potable, lo que resultó en un etiquetado bien detectable en el cerebro. Un buen etiquetado también se puede lograr en 2 semanas. Ni tiempos de etiquetado más cortos, ni puntos de tiempo más largos, ni otras cantidades de ANL han sido estudiadas por nosotros utilizando este método de administración, lo que no implica que lo anterior no funcionaría. Las tasas de incorporación de ANL pueden variar según el tejido estudiado o el tipo de célula. El tiempo de etiquetado puede variar dependiendo de la pregunta científica; Por ejemplo, si los proteomas fueran a ser marcados, entonces el tiempo de etiquetado debe calcularse en función de las vidas medias promedio de las proteínas en el tejido estudiado. Si el interés es solo identificar proteínas recién sintetizadas, los tiempos pueden acortarse. Los períodos de etiquetado y las dosis de ANL deben probarse empíricamente para cada condición experimental y tipo de célula de interés.</li>
	</ol></li>
	<li>Administración intraperitoneal:<ol><li>Disuelva el ANL en solución fisiológica de NaCl a 400 mM, tampón salino fosfato (PBS) o agua.</li>
		<li>Asegúrese de que la osmolaridad de la solución esté dentro del rango fisiológico. Aquí, se administran 10 ml / kg de peso corporal de solución de ANL a los ratones. NOTA: Un buen etiquetado en las neuronas excitadoras del cerebro se obtiene con éxito mediante una inyección intraperitoneal (IP) diaria con 400 mM ANL durante 1 semana. En este estudio no se han probado concentraciones más bajas de ANL ni otros períodos de etiquetado mediante inyecciones IP, lo que no implica que no funcionen. ANL es suministrado como clorhidrato por algunas compañías. En este caso, el pH de las soluciones debe ajustarse al pH adecuado (dependiendo de la vía de administración). La ANL también puede ser sintetizada siguiendo el método publicado por Link et al.11 con algunas modificaciones5. El etiquetado de ANL se puede realizar utilizando otras concentraciones de ANL, períodos de tiempo y rutas de administración. Para tejidos/tipos de células con bajas tasas metabólicas, se puede utilizar una dieta de metionina de bajo contenido, siempre comenzando 1 semana antes de la administración de ANL. Cuando se utiliza 400 mM ANL, puede precipitar mientras se almacena a 4 °C; el calentamiento hasta 37 °C devuelve el ANL a la solución. Deje que alcance la temperatura ambiente antes de la inyección. En la mayoría de las regiones del mundo, la administración de ANL a ratones es un experimento animal y debe ser aprobado por las autoridades pertinentes.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Recolección de tejidos, lisis y extracción de proteínas
<ol><li>Disección de tejido: disecciona el área de tejido que contiene el tipo de célula de interés y observa el peso de la pieza de tejido recolectada. NOTA: Las muestras pueden almacenarse a -80 °C durante varios meses (punto de parada). En el protocolo actual, se diseccionaron la corteza y el hipocampo de los ratones.</li>
	<li>Lisis tisular: Homogeneizar el tejido a temperatura ambiente añadiendo un volumen 12-15 veces el peso húmedo del tejido del tampón de lisis (PBS pH 7.4, 1% peso / vol SDS, 1% (vol / vol) Triton X-100, Benzonasa (1: 1000 vol / vol), un inhibidor de la proteasa (PI) (EDTA libre 1: 4000)). Por ejemplo, para una pieza de tejido de 20 mg, agregue 240-300 μL de tampón de lisis. Triturar el tejido hasta homogeneizarlo. NOTA: Las muestras pueden almacenarse a -80 °C durante varios meses (punto de parada). Para la homogeneización directa en tubos de 1,5 ml, se recomienda el uso de un homogeneizador portátil que funcione con baterías, especialmente cuando se procesan pequeños trozos de tejido. Para piezas más grandes, se puede usar un homogeneizador Dounce. A cada tampón donde se incluyen inhibidores de la proteasa (IP), deben agregarse inmediatamente antes de su uso y no antes.</li>
	<li>Desnaturalización de proteínas: Calentar el homogeneizado a 75 °C durante 15 min y centrifugar a 17.000 x g durante 15 min a 10 °C. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.</li>
	<li>Medición del contenido de proteína: Mida la concentración de proteína de cada muestra y ajuste todas las muestras para compararlas con la misma concentración de proteína; Ajuste la concentración agregando tampón de lisis. Un rango de concentración óptimo está entre 2-4 μg/μL. NOTA: Las muestras pueden almacenarse a -80 °C durante varios meses (punto de parada).</li>
	<li>Alquilación<ol><li>Diluir las muestras homogeneizadas 2-3 veces en PBS (pH 7.8) + PI (libre de EDTA 1:4000).</li>
		<li>Añadir yodoacetamida (IAA) a una concentración final de 20 mM (solución madre 500 mM).</li>
		<li>Dejar las muestras durante 1-2 h a 20 °C en la oscuridad. Realice los pasos 2.5.2-2.5.3 dos veces. NOTA: Para algunos tejidos, si el clic no específico en el control negativo permanece alto, podría ser necesario realizar un paso de reducción antes de la alquilación12. Prepare el stock de IAA recién hecho justo antes de agregarlo a las muestras. Las muestras pueden almacenarse a -80 °C durante varios meses (punto de parada).</li>
	</ol></li>
	<li>Intercambio de búfer: equilibre las columnas de intercambio de búfer utilizando el búfer de intercambio químico de clic (PBS pH 7.8, 0.04% (peso / vol) SDS, 0.08% (vol / vol) Triton X-100 y PI (1: 4000)). Siga las instrucciones del fabricante. Intercambie todas las muestras alquiladas. NOTA: Las muestras elutadas pueden almacenarse a -80 °C durante varios meses (punto de parada). En este paso, se elimina el IAA y el búfer de química de clic intercambia el búfer. La proteína se puede medir nuevamente después del paso de intercambio de tampón para asegurarse de que las proteínas no se perdieron durante el proceso de intercambio de tampón. Dependiendo del tipo de columnas utilizadas para el intercambio de tampón, la proteína puede perderse masivamente. Utilice las columnas recomendadas para evitar la pérdida de proteínas. Para el almacenamiento de muestras, se recomienda la preparación de alícuotas.</li>
	<li>Haga clic en la reacción para evaluar la incorporación de ANL en el experimento<ol><li>Tomar 40 μL de las muestras eluidas en el paso 2.6 y añadir PBS (pH 7,8) a un volumen final de 120 μL.</li>
		<li>Para configurar la reacción química de clic, agregue los siguientes reactivos en el orden y vórtice dados durante 20 s después de cada adición: 1.5 μL de ligando triazol (stock 40 mM), 1.5 μL de biotina alquino (stock 5 mM) y 1 μL de bromuro de Cu(I) (stock 10 mg/mL, disuelto en DMSO por pipeteo cuidadoso hacia arriba y hacia abajo, no vórtice). Agregue los reactivos lo más rápido posible.</li>
		<li>Incubar las muestras durante la noche en la oscuridad a 4 °C con rotación continua.</li>
		<li>Centrifugar las muestras a 4 °C durante 5 min a 17.000 x g. Una bolita ligeramente turquesa será visible. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. NOTA: Prepare el caldo de bromuro de Cu (I) inmediatamente antes de usarlo para evitar la oxidación del cobre. Mantener constante la relación de volúmenes entre la muestra lisada y el PBS entre muestras es esencial para garantizar la misma concentración final de detergente en cada tubo. Para acelerar el montaje de la reacción química de clic, se recomienda un vórtice de mesa con bastidores para tubos. Almacene las muestras en las que se ha hecho clic a -80 °C durante varios meses, o a -20 °C durante un par de semanas hasta su posterior procesamiento (punto de parada).</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de Western blot para evaluar la incorporación de ANL en el experimento<ol><li>Ejecute una SDS-PAGE con 20-40 μL del sobrenadante de la reacción química de clic (paso 2.7). Use geles de acrilamida al 12%, funcione en SDS al 1%, Tris-HCl al 250 mM, glicina al 2 mM. Corra hasta que la parte delantera esté fuera del gel.</li>
		<li>Transferir las proteínas a una membrana de nitrocelulosa o PVDF13.</li>
		<li>Incubar la membrana durante la noche a 4 °C con el anticuerpo GFP (1:500, la proteína GFP se cotraduce con MetRS*5) y el anticuerpo de biotina (1:1000) para la detección de alquinos clic, que se conjuga con la biotina.</li>
		<li>Lave el anticuerpo primario 2 veces durante 10 minutos y agregue el anticuerpo secundario durante 1,5 h.</li>
		<li>Lave el anticuerpo secundario 2 veces durante 10 minutos y escanee (si usa anticuerpos conjugados con fluoróforos) o exponerlo a películas (si usa anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante).</li>
		<li>Cuantificar la señal de biotina utilizando ImageJ o software similar, evaluar el etiquetado general de cada muestra del experimento y detectar posibles valores atípicos. Evaluar la relación señal-ruido (etiquetado de la muestra ANL al fondo de los controles negativos) del experimento y detectar posibles animales que no pudieron incorporar/incorporar ANL. NOTA: Para muestras con alta incorporación de ANL, la purificación de proteínas es teóricamente posible utilizando alquinos no escindibles como el utilizado en esta sección para la evaluación de la incorporación de ANL. Usando muestras cerebrales, el fondo obtenido en los controles negativos por EM después de la purificación de proteínas utilizando alquinos no escindibles es demasiado alto14. Por lo tanto, solo se utilizaron los alquinos no escindibles, más fáciles de manejar y no escindibles, para una primera muestra general y evaluación del experimento. Independientemente del tipo de alquino destinado a la purificación de proteínas, es aconsejable realizar los pasos para la optimización de la dosificación de alquinos descritos en la siguiente sección (paso 2.9).</li>
	</ol></li>
	<li>Reacción de clic para la optimización de la dosis de alquino escindible<ol><li>Preparar cuatro tubos con 40 μL de una muestra representativa (obtenida en la etapa 2.6 y evaluada en la etapa 2.8) y añadir PBS (pH 7,8) a un volumen final de 120 μL.</li>
		<li>Configure la reacción química de clic como se explica en el paso 2.7, pero esta vez, agregue cuatro cantidades diferentes del DST-alquino. Para dicho alquino, se recomienda probar 5 μM, 15 μM, 30 μM y 60 μM.</li>
		<li>Repita el paso 2.8 para decidir cuál es la dosis de alquino más adecuada para la pregunta experimental específica en estudio, en función de la mayor eficiencia de etiquetado con la señal de fondo más baja. NOTA: Antes de someter las muestras restantes a una reacción de clic, se debe determinar la cantidad óptima de cualquier alquino. Hay varias opciones de alquinos disponibles comercialmente que se pueden utilizar. Se diferencian en la forma de escisión (por ejemplo, agentes ligeros o reductores). También es posible la química de clic sin cobre utilizando reactivos promovidos por deformación (por ejemplo, reactivos DBCO). Los pequeños cambios en la cantidad de alquinos o reactivos DBCO a menudo aumentan significativamente la señal en el control negativo (fondo). Aquí, se describe la purificación de proteínas utilizando un alquino con un puente disulfuro escindible por agentes reductores (disulfuro biotina alquino o DST-alquino15). Cuando utilice el DST-alquino, para ejecutar el SDS-PAGE (paso 8.1), evite cargar tampones con agentes reductores fuertes como DTT o β-mercaptoetanol para evitar la escisión de alquinos. En este estudio, el calentamiento a 72 °C, durante 5 min, utilizando 5 mM de N-etilmaleimida (NEM) en el tampón de carga no afecta la estabilidad del DST-alquino. El paso 2.9.2 se puede repetir, probando dosis más finas en el rango de la mejor observada.</li>
	</ol></li>
	<li>Reacción de clic preparativa para la purificación de proteínas<ol><li>Haga clic en todas las muestras obtenidas en el paso 2.6 con la dosis óptima de alquino determinada en el paso 2.9 y analice una fracción por SDS-PAGE y Western blot (paso 2.8). NOTA: Asegúrese de que las pipetas estén calibradas correctamente para garantizar la precisión de la ampliación de la muestra. Las muestras en las que se hace clic se pueden almacenar a -80 °C durante varios meses (punto de parada).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Purificación de proteínas
<ol><li>Intercambio de búfer<ol><li>Sujete todas las muestras en las que se haga clic a un procedimiento de intercambio de tampón como se describe en el paso 2.6, pero utilice el tampón de unión de neutravidina como tampón de equilibrio (PBS pH 7.4, 0.15% (peso / vol) SDS, 1% (vol / vol) Triton X-100 y PI (1: 2000)). NOTA: Las muestras elutadas pueden almacenarse a -80 °C durante varios meses (punto de parada). En este paso, se elimina el alquino libre sin clic y el tampón de unión de neutravidina intercambia el tampón.</li>
	</ol></li>
	<li>Unión a perlas de neutravidina<ol><li>Lave las perlas de alta capacidad de Neutravidin con el tampón de unión de Neutravidin (ver paso 3.1); Mezclar las perlas con el tampón y centrifugar la mezcla durante 5 min a 3000 x g, y desechar el sobrenadante. Repita tres veces.</li>
		<li>Prepare una suspensión 1:1 de perlas de Neutravidin agregando el mismo volumen de perlas secas y tampón de unión de Neutravidina.</li>
		<li>Reservar 20-40 μL de cada muestra como lisado prepurificado y almacenarlo a -20 °C.</li>
		<li>Medir la concentración de proteínas (ver paso 2.4) y mezclar 100 μg de proteína con 4 μL de la suspensión de perlas obtenida en el paso 3.2.2.</li>
		<li>Incubar la mezcla durante la noche a 4 °C con rotación continua, permitiendo que las proteínas marcadas se unan a las perlas. NOTA: En cuanto a la reacción química de clic, la reacción básica de purificación de afinidad descrita en el paso 3.2.4 se puede ampliar. Por ejemplo, para la purificación de proteínas de las neuronas excitadoras del hipocampo, se mezcla 1 mg de lisado de proteínas con 40 μL de perlas de Neutravidin (suspensión 1: 1). La cantidad de perlas de Neutravidin se puede aumentar o reducir de acuerdo con la cantidad de proteínas marcadas por mg de proteína total, que dependerá del tipo de célula elegido y el período de etiquetado y debe determinarse empíricamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavados de perlas de neutravidina y elución de proteínas<ol><li>Recoger los sobrenadantes por centrifugación (véase el paso 3.2.1). Reservar una alícuota de 20-40 μl de cada sobrenadante para su posterior análisis y congelar el resto a -80 °C.</li>
		<li>Lave las perlas con el tampón de lavado 1 de Neutravidin refrigerado (PBS pH 7.4, 0.2% (peso / vol) SDS, 1% (vol / vol) Triton X-100 y PI (1: 2000)) agregando el amortiguador, sedimentando las perlas y desechando el sobrenadante. Repita este paso tres veces.</li>
		<li>A continuación, añadir el mismo tampón e incubar las perlas durante 10 minutos bajo rotación continua a 4 °C antes de desechar el sobrenadante. Repita este paso tres veces.</li>
		<li>Lave las perlas como se explica en los pasos 3.3.2-3.3.3 pero utilizando el tampón de lavado 2 de Neutravidin (1x PBS, pH 7.4 y PI 1:2000).</li>
		<li>Lavar las perlas como se explica en el paso 3.3.2-3.3.3 pero utilizando el tampón de lavado Neutravidin 3 (bicarbonato de amonio 50 mM y PI 1:2000).</li>
		<li>Eluya las proteínas clicadas incubando las perlas durante 30 min a 20 °C con un volumen de tampón de elución de Neutravidin (5% (vol/vol) β-mercaptoetanol y 0,03% (peso/vol) SDS) correspondiente a un volumen de las perlas secas utilizadas.</li>
		<li>Mantener las perlas en suspensión durante la elución por agitación continua (1000 rpm) en un agitador termobloque. Eluye dos veces y combine ambos eluidos. NOTA: La centrifugación establecida para la separación de la fracción sólida del purín (perlas) y la fase acuosa (sobrenadante), como se explica en el paso 3.2.1, se aplica a los pasos 3.3.1-3.3.7. La cantidad de SDS se puede aumentar si la elución de proteínas no es completa. Sin embargo, con cantidades superiores al 0,08%-0,1% de SDS, las proteínas no unidas específicamente a las perlas comienzan a ser eluyidas. β-mercaptoetanol es volátil y tóxico; Se recomienda el uso de una capucha para los pasos 3.3.6-3.3.7. Las muestras recogidas en los pasos 3.2.3 y 3.3.1 deben ser ejecutadas por SDS-PAGE y evaluadas por Western blot (ver paso 2.8) para evaluar la eficiencia de la purificación de afinidad (paso 3.3).</li>
	</ol></li>
	<li>Evaluación de proteínas eluidas<ol><li>Cargue 1/3 de las muestras eluyidas en una SDS-PAGE (consulte el paso 2.8.1).</li>
		<li>Tiñe el gel para visualizar proteínas usando un método de alta sensibilidad, como la tinción de plata o un método fluorescente.</li>
		<li>Si las muestras tienen la calidad esperada, lo que significa que hay 3-4 veces más proteína en las muestras marcadas con ANL en comparación con el control negativo, las proteínas eluyentes pueden identificarse mediante métodos de espectrometría de masas de rutina como el explicado en la referencia5.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+synaptic+protein+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of synaptic protein turnover.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).</li>
<li>Sutton, M. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+protein+synthesis%2C+synaptic+plasticity%2C+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory.</a> Cell. 127 (1), 49-58 (2006).</li>
<li>Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+dynamics+during+homeostatic+scaling+in+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons.</a> Elife. 9, 52939(2020).</li>
<li>Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+in+mice+as+affected+by+intracerebral+puromycin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Memory in mice as affected by intracerebral puromycin.</a> Science. 141 (3575), 57-59 (1963).</li>
<li>Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+metabolic+labeling%2C+detection+and+identification+of+nascent+proteomes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).</li>
<li>Alvarez-Castelao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+metabolic+labeling+of+nascent+proteomes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo.</a> Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).</li>
<li>Ngo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-selective+metabolic+labeling+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-selective metabolic labeling of proteins.</a> Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).</li>
<li>Mahdavi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+aminoacyl-tRNA+synthetase+for+cell-selective+analysis+of+mammalian+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).</li>
<li>Yuet, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+proteomic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).</li>
<li>Patel, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+labeling+and+label-free+mass+spectrometry-based+proteomics+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).</li>
<li>Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazo+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).</li>
<li>Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BONCAT%3A+Metabolic+labeling%2C+click+chemistry%2C+and+affinity+purification+of+newly+synthesized+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, Clifton, N.J. 199-215 (2015).</li>
<li>Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+proteins+by+immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of proteins by immunoblotting.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).</li>
<li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRAPome%3A+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).</li>
<li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li>
<li>Goebbels, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+targeting+of+principal+neurons+in+neocortex+and+hippocampus+of+NEX-Cre+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice.</a> Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).</li>
<li>van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+thiol-yne+addition+improves+the+specificity+of+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).</li>
<li>O'Fagain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Lyophilization of proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 244, Clifton, N.J. 309-321 (2004).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li>
<li>Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suspension+trapping+%28S-Trap%29+is+compatible+with+typical+protein+extraction+buffers+and+detergents+for+bottom-up+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).</li>
<li>tom Dieck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+newly+synthesized+target+proteins+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ.</a> Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).</li>
<li>McShane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+protein+stability+reveals+age-dependent+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation.</a> Cell. 167 (3), 803-815 (2016).</li>
<li>Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+non-canonical+amino+acids+into+the+developing+murine+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome.</a> Scientific Reports. 6, 32377(2016).</li>
<li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).</li>
<li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUnSET%2C+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).</li>
<li>Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioID%3A+A+screen+for+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">BioID: A screen for protein-protein interactions.</a> Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Los aspectos críticos del protocolo son; la inclusión de controles negativos, tener suficientes réplicas biológicas, la vía de administración de ANL, la cantidad y la duración, la alquilación de las muestras, la concentración de alquinos y la eliminación de β-mercaptoetanol cuando se usa DST-alquino.
Es clave incluir muestras de control negativo procedentes de animales marcados con ANL sin conductor Cre y, por lo tanto, sin expresión de MetRS*. Estas muestras deben someterse a todos los pasos ...

La homeostasis aberrante de proteínas es causada por un desequilibrio en la síntesis y degradación de proteínas. Varias enfermedades están relacionadas con alteraciones en la homeostasis de proteínas. El sello distintivo de algunas enfermedades es la presencia de agregados en diferentes ubicaciones subcelulares y áreas cerebrales. La homeostasis proteica no sólo es importante en la enfermedad, sino que también desempeña un papel crucial en la función normal de los órganos y las células1. Por ejemplo, la síntesis de proteínas es necesaria para muchas formas de plasticidad neuronal2,3, determinada por el uso de inhibidores químicos que bloquean la síntesis de proteínas4. Sin embargo, no está claro en qué tipos de células se altera el proteoma para apoyar el aprendizaje y la memoria, ni se entiende qué proteínas específicas en cada tipo de célula aumentan o disminuyen en su síntesis o degradación. Por lo tanto, un estudio exhaustivo de la homeostasis de proteínas requiere la capacidad de diferenciar proteomas provenientes de tipos celulares específicos. De hecho, la identificación de proteomas específicos de tipo celular para estudiar los procesos celulares que ocurren en un entorno multicelular ha sido un obstáculo importante en proteómica. Por esta razón, desarrollamos una técnica que utiliza la expresión de MetRS* combinada con métodos bio-ortogonales que ha demostrado ser una forma efectiva de identificar y purificar proteomas específicos de tipo celular, llenando este vacío 5,6,7.
La expresión de un mutante MetRS* (MetRS L274G) permite la carga del anl analfa de metionina no canónico en el ARNt 8,9 correspondiente y su posterior incorporación a proteínas. Cuando la expresión de MetRS* está regulada por un promotor específico de tipo celular, el aminoácido no canónico se incorporará a las proteínas de manera selectiva de la célula. Una vez que se incorpora ANL en las proteínas, puede ser funcionalizada selectivamente por química de clics y posteriormente visualizada por imágenes (FUNCAT) o por Western Immunoblot (BONCAT). Alternativamente, las proteínas pueden purificarse selectivamente e identificarse mediante espectrometría de masas (EM). Usando esta tecnología, creamos una línea de ratón que expresa la proteína MetRS* bajo el control de la recombinasa Cre. Teniendo en cuenta el creciente número de líneas de ratón Cre disponibles, el sistema MetRS* se puede utilizar en cualquier campo para estudiar cualquier tipo de célula de cualquier tejido para el que exista una línea Cre. El marcaje de proteínas con ANL es posible in vitro o in vivo, y no altera el comportamiento del ratón ni la integridad de las proteínas6. El período de tiempo de etiquetado se puede adaptar a la pregunta científica de cada investigador, etiquetando proteínas recién sintetizadas (tiempos de etiquetado más cortos) o proteomas completos (tiempos de etiquetado más largos). El uso de esta técnica está limitado por el número de células del tipo que el investigador está dispuesto a estudiar; Por lo tanto, el aislamiento de proteínas de tipos celulares con números bajos o bajas tasas metabólicas no es posible por este método. El objetivo del método presentado es identificar proteínas/proteomas específicos del tipo celular marcados in vivo. En este protocolo, describimos cómo etiquetar proteomas específicos de tipo celular con ANL en ratones vivos y purificar las proteínas marcadas. Después de la purificación, las proteínas pueden ser identificadas por protocolos de espectrometría de masas de rutina 5,10. La reducción de la complejidad de la muestra lograda en este método mediante la purificación selectiva de proteínas de poblaciones celulares específicas permite al experimentador detectar cambios sutiles en los proteomas, por ejemplo, en respuesta a cambios ambientales. La purificación de las proteínas marcadas se puede lograr en ~ 10 días, sin incluir el análisis de MS o el período de etiquetado. Aquí, describimos dos métodos para la administración de ANL a ratones que expresan MetRS*, a saber, (1) agregar el aminoácido en el agua potable y (2) introducir ANL mediante inyecciones intraperitoneales. Independientemente del método elegido para la administración de ANL, los pasos de aislamiento y purificación son los mismos (a partir del paso 2).

<table><tbody><tr><td>12% Geles de acrilamida</td><td>GenScript</td><td>SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Tóxico; utilice una bata de laboratorio, guantes y una campana extractora.</td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td>Tóxico; use una bata de laboratorio, guantes y una campana extractora</td></tr><tr><td>ANL</td><td></td><td></td><td>Sintetizado como se describió anteriormente para AHA (ver referencias 5 y 11)</td></tr><tr><td>ANL-HCl</td><td>IrishBotech</td><td>HAA1625.0500</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Biotina alquino</td> <td>Thermo,B10185</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Anticuerpo de pollo anti-GFP</td><td>Aves</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor completo de la proteasa libre de EDTA</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>Toxic; utilice una bata de laboratorio y guantes.</td></tr><tr><td>Bromuro de cobre (I)</td><td>Sigma</td><td>254185</td><td>99,999% (peso/peso)</td></tr><tr><td>Marcador de disulfuro (DST)-alquino</td><td></td><td></td><td>sintetizado según lo informado en el número de referencia 15, en el que se hace referencia a él como sonda 20</td></tr><tr><td>Filtros DMSO</td><td>Sigma 276855</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Merk</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Acetamida de yodo (IAA)</td><td>Sigma</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>IR anti pollo 800</td><td>LI-COR</td><td>IRDye 800CW</td><td>Burro anti-Pollo Anticuerpo Secundario</td></tr><tr><td>IR anti rabit 680</td><td>LI-COR</td><td>IRDye 680RD</td><td>Cabra anti-Conejo IgG Anticuerpo Secundario</td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Sigma</td><td>M9171</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador Manual</td><td>BioSpec Productos</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>N-etilmaleimida</td><td>Sigma</td><td>4259</td><td>Nocivo; Use una bata de laboratorio, guantes y una campana extractora.</td></tr><tr><td>Perlas de NeutrAvidin</td><td>Pierce</td><td>29200</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa</td><td>Bio-rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Thermo</td><td>J62036.K2</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X pH 7.8</td><td></td><td></td><td>Preparación descrita en el número de referencia 5</td></tr><tr><td>Columnas PD SpinTrap G-25 GE</td><td>Healthcare</td><td></td><td>Intercambio de tampones</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo,</td><td>23225</td><td>Los reactivos del kit de ensayo de proteínas BCA de Pierce son tóxicos para la vida acuática.</td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal anti-biotina</td><td>de conejo Cell Signaling</td><td>5597</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>SDS 10%</td><td>Sigma</td><td>71736</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE&nbsp; Tampón de funcionamiento MOPS</td><td>GenScript</td><td>M00138</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Tinción de rubí</td><td>Sigma</td><td>S4942</td><td></td></tr><tr><td>Mesa automática Vortexer</td><td>Eppendorf</td><td>Mixmate</td><td></td></tr><tr><td>Ligando triazol Sigma</td><td></td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Sigma de agua</td><td></td><td>W4502</td><td>Grado de biología molecular</td></tr></tbody></table>

purificación e identificación de proteínas específicas de tipo celular a partir de tejidos complejos utilizando una línea de ratón de arnt sintetasa de metionina mutante

Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line

Comprender la homeostasis de proteínas in vivo es clave para saber cómo funcionan las células tanto en condiciones fisiológicas como de enfermedad. El presente protocolo describe el etiquetado in vivo y la posterior purificación de proteínas recién sintetizadas utilizando una línea de ratón diseñada para dirigir el etiquetado de proteínas a poblaciones celulares específicas. Es una línea inducible por la expresión de Cre recombinasa de L274G-Metionina ARNt sintetasa (MetRS*), lo que permite la incorporación de azidonorleucina (ANL) a las proteínas, que de otro modo no ocurrirá. Utilizando el método descrito aquí, es posible purificar proteomas específicos de tipo celular marcados in vivo y detectar cambios sutiles en el contenido de proteínas debido a la reducción de la complejidad de la muestra.

Siguiendo el protocolo descrito (resumido en la Figura 1), se administró ANL a ratones mediante inyecciones intraperitoneales diarias (400 mM ANL 10 mL/kg, Nex-Cre::MetRS*) durante 7 días, o a través de agua potable (0,7% maltosa, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*) durante 21 días. Después del etiquetado, las áreas cerebrales correspondientes fueron diseccionadas, lisadas, alquiladas y clicadas. Las reacciones de clic fueron analizadas por SDS-PAGE y Western Immunoblot. L...

Este protocolo describe cómo realizar el marcado de proteínas específicas del tipo celular con azidonorleucina (ANL) utilizando una línea de ratón que expresa una sintetasa de ARNt de L274G-Metionina mutante (MetRS*) y los pasos necesarios para el aislamiento de proteínas específicas de tipo celular marcadas. Describimos dos posibles vías de administración de ANL en ratones vivos mediante (1) agua potable y (2) inyecciones intraperitoneales.

Purificación e identificación de proteínas específicas de tipo celular a partir de tejidos complejos utilizando una línea de ratón de ARNt sintetasa de metionina mutante

Understanding protein homeostasis in vivo is key to knowing how the cells work in both physiological and disease conditions. The present protocol ...

Este protocolo permite etiquetar proteínas de una manera específica para el tipo de célula. Esta es la primera técnica que ofrece tal posibilidad y se puede hacer in vitro o in vivo. La principal ventaja de la técnica es que las proteínas específicas del tipo celular marcado pueden purificarse sin identificar o visualizarse in situ mediante inmunofluorescentes.Para comenzar a preparar el lisado tisular añadiendo tampón de lisis a un volumen de 12 a 15 veces el peso húmedo del tejido y triturar el tejido hasta homogeneizarlo. Caliente este homogeneizado durante 15 minutos a 75 grados centígrados para desnaturalizar la proteína, luego centrifugar la muestra y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Esta muestra se puede almacenar a menos 80 grados centígrados.A continuación, para la alquilación, diluya la muestra homogeneizada de dos a tres veces en tampón salino fosfato que contenga un inhibidor de la proteasa libre de EDTA. Luego agregue yodoacetamida recién preparada a una concentración final de 20 milimoles. Deje la muestra durante una o dos horas a 20 grados centígrados en la oscuridad.Repita los pasos de adición e incubación de yodoacetamida dos veces. Prepare la columna se

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Investigación

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Neurociencia

Este video muestra el método mejorado de inmunoprecipitación reticulante (eCLIP) para identificar proteínas de unión al ARN en testículos de ratón. eCLIP permite la identificación precisa de los sitios de unión donde las proteínas de unión al ARN (RBP) interactúan con sus ARN objetivo.

Un método mejorado de inmunoprecipitación de reticulación para la identificación eficiente del ARN unido a proteínas en testículos de ratón

Aquí se describe un ensayo in vivo mutagénesis por un pequeño número de células hematopoyéticas purificadas utilizando el modelo de ratón transgénico LacI. El gen LacI puede ser aislado para determinar la frecuencia, la ubicación y tipo de mutantes de ADN espontáneamente surgido o después de la exposición a genotoxinas.

La identificación de mutaciones del ADN en Purificada hematopoyéticas células madre / progenitoras

Para estudiar la relación entre la homeostasis de las proteínas, el estrés y el envejecimiento, monitoreamos los cambios en el plegamiento de las proteínas siguiendo la disfunción de las proteínas, la localización de las proteínas en la célula y la estabilidad de las proteínas a nivel de organismo, celular y proteína, utilizando el metazoo genéticamente tratable Caenorhabditis elegans como sistema modelo.

Uso de Caenorhabditis elegans como sistema modelo para estudiar la homeostasis de proteínas en un organismo multicelular

Aquí se presenta un protocolo para experimentos FRET de alta precisión en el nivel de una sola molécula. Además, esta metodología puede usarse para identificar tres estados conformacionales en el dominio de unión al ligando del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinar las distancias exactas es el primer paso hacia la construcción de modelos estructurales basados ​​en experimentos FRET.

FRET de alta precisión a nivel de molécula única para la determinación de estructuras de biomoléculas

En este método, presentamos procedimientos bioquímicos para el aislamiento rápido y eficiente de proteínas de filamento intermedio (IF) de múltiples tejidos de ratón. Se pueden usar IFs aisladas para estudiar los cambios en las modificaciones postraduccionales por espectrometría de masas y otros ensayos bioquímicos.

Aislamiento de proteínas de filamento intermedio de múltiples tejidos de ratón para estudiar las modificaciones postraduccionales asociadas al envejecimiento

Este método describe un enfoque robusto y reproducible para la comparación de los niveles de proteína en distintos tejidos y en diferentes puntos de tiempo del desarrollo usando un enfoque Blot western cuantitativo estandarizado.

Robusta comparación de niveles de proteína en los tejidos y a lo largo de desarrollo estandarizados cuantitativos Western Blotting

La traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) permite un aislamiento rápido y eficiente del ARNm de traducción específico del tipo de célula. Aquí, demostramos un método que combina la inyección hidrodinámica de cola-vena en un modelo de ratón de repoblación hepática y TRAP para examinar el perfil de expresión de los hepatocitos repoblados.

Perfilado de expresión génica específico del tipo de celda en el hígado del ratón

Aquí, describimos la inmunoprecipitación de ribosomas y el ARN asociado de poblaciones selectas de células germinales macho adultas utilizando el sistema RiboTag. La cría estratégica y la cuidadosa inmunoprecipitación dan como resultado resultados limpios y reproducibles que informan sobre el traducto de células germinales y proporcionan información sobre los mecanismos de los fenotipos mutantes.

RiboTag Inmunoprecipitación en las células germinales del ratón macho

Este artículo presenta una serie de métodos consecutivos para la expresión y purificación de Salmonella typhimurium triptófano sintasa comp este protocolo un sistema rápido para purificar el complejo proteico en un día. Los métodos cubiertos son la mutagénesis dirigida al sitio, la expresión de proteínas en Escherichia coli,la cromatografía de afinidad, la cromatografía de filtración en gel y la cristalización.

Mutagénesis por PCR, clonación, expresión, protocolos rápidos de purificación de proteínas y cristalización del tipo salvaje y formas mutantes de triptófano sintasa

Este protocolo tiene como objetivo aislar los ARNm ribosómicos de traducción específicos del tipo celular utilizando el modelo de ratón NuTRAP.

Aislar ARN específicos del tipo de célula de muestras de tejido heterogéneo congeladas a presión sin clasificación celular

Aquí, describimos un protocolo para extraer tubulina endógena de células de mamíferos, que pueden carecer o contener enzimas modificadoras de microtúbulos específicas, para obtener microtúbulos enriquecidos para una modificación específica. Luego describimos cómo los microtúbulos extraídos se pueden decorar con proteínas purificadas de unión a microtúbulos para preparar rejillas para la microscopía crioelectrónica.

Extracción de microtúbulos modificados de células de mamíferos para estudiar complejos microtúbulos-proteínas mediante microscopía crioelectrónica

Aprende a purificar e identificar proteínas específicas de tipo celular desde tejidos complejos utilizando un modelo de ratón MetRS* mutante. Este método avanza el estudio de la síntesis proteica in vitro e in vivo.

Purificación e identificación de proteínas específicas de tipo celular a partir de tejidos complejos utilizando una línea de ratón de ARNt sintetasa de metionina mutante (Video) | JoVE Journal

Purificación e identificación de proteínas específicas de tipo celular a partir de tejidos complejos utilizando una línea de ratón de ARNt sintetasa de metionina mutante

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