Name: Extracción a pequeña escala de ADN genómico de Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprende a extraer ADN genómico de Caenorhabditis elegans con un protocolo rápido y económico usando un kit comercial y termociclador. Este método eficiente produce plantillas de PCR fiables para aplicaciones de investigación y educativas.

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La cepa N2 y la bacteria E. coli OP50 se obtuvieron del Centro de Genética Caenorhabditis (CGC), que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). La cepa blmp-1(tm548) se obtuvo del National Bioresource Project, Japón. Los autores agradecen a WormBase. Este trabajo fue apoyado por NIH R01GM097591 a T.L.G., financiamiento interno de Texas Woman's University a T.L.G, y el Centro de Investigación Estudiantil de TWU a M.F.L.

1. Mantenimiento de C. elegans
NOTA: Las cepas N2 (tipo salvaje) y blmp-1(tm548) C. elegans se mantuvieron en placas estándar de medios de crecimiento de nematodos (NGM) a 20 °C.
<ol><li>Preparar placas NGM disolviendo 23.005 g de polvo NGM en 973 mL de agua en un matraz de 2 L. Cubra la abertura del matraz con papel de aluminio (o tapa autoclavable que permite la ventilación) y asegure la cubierta con cinta de autoclave. Autoclave para disolver el polvo y esterilizar el contenido con un ciclo de esterilización de al menos 30 min.</li>
	<li>Enfríe el medio a 60 °C en un baño de agua.</li>
	<li>Al medio enfriado, agregue 25 ml de tampón estéril de fosfato de 1 M (KH2PO4), pH 6.0; 1 ml de solución de cloruro de calcio de 1 M; y 1 ml de solución de sulfato de magnesio de 1 M.</li>
	<li>Revuelva el medio en una placa de agitación magnética para obtener una mezcla homogénea y evitar el enfriamiento y la solidificación desiguales (~ 5 min). Asegúrese de que la barra de agitación gire lo suficientemente rápido como para crear un vórtice, pero no tan rápido como para que se introduzcan burbujas (~ 250-300 rpm).</li>
	<li>Vierta ~ 25 ml del medio en cada placa de Petri de 10 cm (~ 40 placas en total). Seque las placas a temperatura ambiente durante la noche (típicamente 16-25 ° C).</li>
	<li>Cultive una colonia de Escherichia coli OP50 en 30-50 ml de caldo LB durante la noche a 37 ° C.</li>
	<li>Sembrar cada placa con 500 μL de cultivo de E. coli OP50 y dejar secar a temperatura ambiente antes de su uso (típicamente 16-25 °C)8. Guarde las placas a 4 °C durante un máximo de 3 semanas.</li>
	<li>Transfiera C. elegans a placas sembradas utilizando un pico de alambre u otro método y déjelos crecer a L4 o etapa adulta a la temperatura requerida para la cepa (típicamente 16-25 ° C, 1-2 días si los animales fueron chapados hambrientos como dauers, 3-4 días si los animales fueron chapados como embriones)8.</li>
</ol>2. Extracción de ADN de un solo gusano
NOTA: Este método es útil para extraer ADN de un solo gusano (un gusano en 1,8 μL de volumen total). Se puede hacer una mezcla maestra si se lisan varios gusanos a la vez.
<ol><li>Programe un termociclador para un ciclo a 55 °C durante 10 min seguido de 95 °C durante 3 min (programa de lisis).</li>
	<li>Alícuota 0,8 μL de la solución de extracción del kit en la pared interior de un tubo pcr de 0,2 ml sobre hielo. Agregue 0,2 μL de la solución de preparación de tejidos del kit a la gota de la solución de extracción. Mezclar por pipeteo.</li>
	<li>Identificar un animal L4 o adulto bajo un microscopio de disección9. Para identificar hermafroditas L4, busque una vulva característica que sea visible como un semicírculo pálido en el medio del animal. Identifique hermafroditas adultos buscando los animales más grandes en la placa que puedan tener embriones ovalados visibles en su útero.</li>
	<li>Usando una selección de alambre de platino, transfiera el animal seleccionado a la solución10.</li>
	<li>Centrifugar el tubo brevemente (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g) a temperatura ambiente para recoger el contenido en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Coloque el tubo en el termociclador y ejecute el programa de lisis establecido en el paso 2.1.</li>
	<li>Cuando se complete el programa, centrífique brevemente el tubo y colóquelo sobre hielo. Agregue 0.8 μL de la solución de neutralización del kit a la mezcla. Mezclar por pipeteo.</li>
	<li>Centrifugar el tubo brevemente a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).</li>
	<li>Utilice directamente el lisado para PCR o guárdelo a 4 °C o -20 °C para su uso futuro. NOTA: El ADN extraído es estable a 4 °C o -20 °C durante al menos 6 meses7.</li>
</ol>3. Extracción de ADN de unos pocos individuos
NOTA: Este método es útil para extraer ADN de algunos gusanos. Se puede preparar una mezcla maestra si se lisan varias cepas a la vez.
<ol><li>Programe el termociclador para un ciclo a 55 °C durante 10 min seguido de 95 °C durante 3 min (programa de lisis).</li>
	<li>Alícuota 2,0 μL de la solución de extracción del kit en la pared interior de un tubo PCR de 0,2 ml sobre hielo. Agregue 0,5 μL de la solución de preparación de tejidos del kit a la gota de la solución de extracción. Mezclar por pipeteo.</li>
	<li>Identificar L4 o animales adultos bajo un microscopio de disección9. Los hermafroditas L4 tienen una vulva característica que es visible como un semicírculo pálido en el medio del animal. Los hermafroditas adultos son los animales más grandes en la placa y pueden tener embriones ovalados visibles en su útero.</li>
	<li>Usando una selección de alambre de platino, transfiera algunos animales a la solución: 9 animales producen 1 equivalente animal de ADN genómico por 0.5 μL de lisado, y 16 animales producen ~ 1 equivalente animal de ADN genómico en 0.25 μL (3.5 nematodos / μL)10. NOTA: Es difícil transferir más de 16 animales a este volumen.</li>
	<li>Centrifugar el tubo brevemente a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).</li>
	<li>Coloque el tubo en el termociclador y ejecute el programa de lisis establecido en el paso 3.1.</li>
	<li>Cuando se complete el programa, centrífique brevemente el tubo y colóquelo sobre hielo. Agregue 2 μL de la solución de neutralización del kit a la mezcla. Mezclar por pipeteo.</li>
	<li>Centrifugar el tubo brevemente a temperatura ambiente (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).</li>
	<li>Utilice directamente la lisis para PCR o guárdela a 4 °C o -20 °C para su uso futuro. NOTA: El ADN extraído es estable a 4 °C o -20 °C durante al menos 6 meses7.</li>
</ol>4. Reacción de PCR
NOTA: Se describe una aplicación posterior de esta técnica de lisis de gusanos, detectando una mutación de deleción utilizando una polimerasa rápida. También se demuestra la efectividad de los dos protocolos de lisis de gusanos en la producción de ADN de plantilla genómica para PCR exitosa en diluciones a 1/50 de un gusano por reacción.
<ol><li>Extraiga ADN de un solo gusano y 16 gusanos utilizando cepas mutantes y N2 de tipo salvaje, como se describe anteriormente en los Pasos 2 y 3.</li>
	<li>Prepare diluciones de 2, 10, 20 y 50 veces de ADN de un solo gusano de animales N2 de tipo salvaje.</li>
	<li>Configure las reacciones de PCR siguiendo el protocolo del fabricante utilizando cebadores específicos para la secuencia de interés y la mezcla maestra de PCR de arranque en caliente (Tabla 1 y Tabla 2). Utilice 1 μL de ADN sin diluir o 2 μL de ADN diluido como plantilla en cada reacción.</li>
	<li>Confirme los productos de PCR mediante electroforesis en gel e imágenes11.</li>
</ol>

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+window+into+biology%3A+A+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">The cuticle.</a> WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).</li>
<li>Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+mapping+system+in+Caenorhabditis+elegans+based+on+polymorphic+sequence-tagged+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites.</a> Genetics. 131, 609-624 (1992).</li>
<li>Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Caenorhabditis+elegans+genomic+DNA+and+detection+of+deletions+in+the+unc-93+gene+using+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).</li>
<li>Fay, D., Bender, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNPs%3A+introduction+and+two-point+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">SNPs: introduction and two-point mapping.</a> WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-10 (2008).</li>
<li>Biron, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBiron%2C+D+%22C.+elegans%3A+Methods+and+Applications%22">C. elegans: Methods and Applications</a>. Haspel, G. , Humana Press. Totowa, NJ. (2015).</li>
<li>Sigma-Aldrich. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf</a> (2013).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , ed. The C. Elegans Research Community, Wormbook (2006).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152(2009).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293(2011).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923(2012).</li>
<li>Gumienny, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+SMA-10%2FLRIG+is+a+conserved+transmembrane+protein+that+enhances+bone+morphogenetic+protein+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling.</a> PLoS Genetics. 6, 1000963(2010).</li>
<li>Nelson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bow-tie+genetic+architecture+for+morphogenesis+suggested+by+a+genome-wide+RNAi+screen+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, 1002010(2011).</li>
<li>Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLMP-1+contributes+to+collagen-related+morphogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans.</a> Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).</li>
<li>Horn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRE-1%2FFBXO11-dependent+degradation+of+BLMP-1%2FBLIMP-1+governs+C.+elegans+developmental+timing+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation.</a> Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).</li>
<li>Huang, T. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLMP-1%2FBlimp-1+regulates+the+spatiotemporal+cell+migration+pattern+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10, 1004428(2014).</li>
<li>Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interactions+between+the+DBL-1%2FBMP-like+pathway+and+dpy+body+size-associated+genes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).</li>
<li>Madeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EMBL-EBI+search+and+sequence+analysis+tools+APIs+in+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019.</a> Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Determinar los genotipos de C. elegans es un paso importante al realizar cruces genéticos para crear nuevas cepas de C. elegans . La extracción de ADN genómico utilizando uno o pocos C. elegans es un paso crucial en el genotipado de C. elegans. Este protocolo describe la extracción de ADN genómico de C. elegans utilizando un kit comercial. Este método es rápido y funciona de manera robusta. El ADN genómico extraído utilizando este método se puede utilizar para aplicaciones pos...

Aquí, se presentan dos protocolos relacionados para la lisis de Caenorhabditis elegans para hacer que el ADN sea accesible para aplicaciones basadas en PCR. La PCR es una técnica molecular de uso común utilizada para muchas aplicaciones, incluyendo el genotipado y la amplificación de fragmentos de ADN para clonación y secuenciación, entre otras. El pequeño (1 mm) gusano redondo de vida libre C. elegans es un sistema animal popular para la investigación biológica. La obtención de ADN genómico adecuado de un solo animal o de unos pocos animales es suficiente para amplificar la secuencia mediante PCR. Las larvas y adultos L4 tardíos contienen solo ~ 1,000 células somáticas (incluidas algunas células poliploides multinucleares), células germinales y (si el animal es un hermafrodita grávido) descendencia en el útero1. Sin embargo, estos animales están protegidos por una cutícula que debe ser interrumpida para extraer el ADN genómico2. Los métodos estándar para preparar la plantilla de ADN genómico de nematodos para PCR implican múltiples pasos y toman varias horas. Los animales se congelan primero en tampón de lisis de lombrices que contiene proteinasa K (-70 °C o menos) durante al menos 15-45 min (algunos protocolos recomiendan más tiempo)3,4,5,6. Este paso abre los animales.
Después de la congelación, los animales se incuban durante 1 h a 60-65 ° C para que la proteinasa K funcione, luego la enzima se inactiva durante 15-30 min a 95 ° C. La proteinasa K destruye las nucleasas que degradan el ADN. La inactivación de la proteinasa K antes de la PCR es importante para evitar que la proteinasa K degrade la ADN polimerasa. Los dos protocolos basados en kits descritos aquí son métodos rápidos, confiables y rentables para extraer ADN genómico de un solo animal o de unos pocos nematodos para aplicaciones diarias de laboratorio de investigación y enseñanza. El kit utilizado fue optimizado originalmente por el fabricante para extraer ADN de tejido animal, saliva y cabello7. Utiliza una solución patentada de preparación de tejidos y una solución de extracción para lisar las células y hacer que el ADN genómico sea accesible. Una solución de neutralización patentada neutraliza los componentes que pueden inhibir la PCR (por ejemplo, sales, iones y moléculas de unión a Mg2+).
Al genotipar, se puede probar un solo animal. Al determinar si una cepa es homocigota, la prueba de seis o más crías de un solo animal da una gran confianza en que una línea es homocigota o no (hay una probabilidad del 0,02% de elegir al azar seis progenies mutantes homocigotas de un padre heterocigoto [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Este método 1) es sencillo, con menos pasos que el método de la proteinasa K, y 2) disminuye el tiempo de preparación de la plantilla a 15 min. Los resultados de este trabajo demuestran que el protocolo desarrollado funciona de manera robusta en la extracción de ADN genómico de uno o varios gusanos, que se pueden usar de manera confiable para aplicaciones posteriores que no requieren ADN altamente purificado, incluida la PCR.

<table><tbody><tr><td>cinta de autoclave</td><td>Defend</td><td>43237-2</td><td></td></tr><tr><td>papel de aluminio,</td><td>envoltura Reynolds</td> de alta resistencia <td>2182934</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de calcio</td><td>Millipore Sigma 102382</td><td>(CAS 10035-04-8)</td><td></td></tr><tr><td>Kit Extract-N-Amp (incluye solución de preparación de tejidos, solución de extracción y solución de neutralización)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>XNAT2-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Placa calefactora/agitador Fisher</td><td>Scientific</td><td>11-100-495H</td><td></td></tr><tr><td>LB media, Lennox, cápsulas</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>3002-131</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de magnesio, 97% puro, anhidro</td><td>Microcentrífuga Thermo Scientific</td><td>AC413485000 (CAS 7487-88-9)</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Labnet International, Inc.</td><td>PrismR, C2500-R</td><td></td></tr><tr><td>NEB Q5U Arranque en caliente ADN polimerasa de alta fidelidad</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>M0515S</td> <td>"Pol E" utilizado en la Figura Suplementaria S1, una polimerasa de alta velocidad y alta fidelidad (20&ndash; 30 s/kb)</td></tr><tr><td>NGM media powder</td><td>US Biological Life Sciences</td><td>N1000</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>M0531S</td> <td>"Pol D" en la Figura 1B, una polimerasa de alta velocidad y alta fidelidad (15&ndash; 30 s/kb)</td></tr><tr><td>primers</td>, <td>Integrated DNA Technologies</td>, <td>ADN personalizado, oligo</td><td></td></tr><tr><td>, polimerasa PrimeSTAR, GXL</td>, <td>Takara Bio Inc.</td><td>R050B</td><td>"Pol C" en la Figura 1B, una polimerasa de alta fidelidad (1 min/kb) para plantillas ricas en GC y plantillas de hasta 30 kb</td></tr><tr><td>Escalera de ADN de 2 logaritmos púrpura de carga rápida (0.1&ndash; 10.0 kb)</td><td>Nueva Inglaterra Biolabs, Inc.</td><td>N0550S</td><td></td></tr><tr><td>SapphireAmp Fast PCR Master Mix Takara</td><td>Bio Inc.</td><td>RR350A</td> <td>"Pol A" en la Figura 1B, polimerasa utilizada en la Figura 1A, C, D, una polimerasa de alta velocidad (10 s/kb) para objetivos de hasta 5 kb</td></tr><tr><td>Mezcla de reacción de PCR Sigma ReadyMix Taq</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>P4600</td><td>"Pol B" en la Figura 1B, una polimerasa (1 min/kb) para objetivos de hasta 7 kb</td></tr><tr><td>Termociclador SimpliAmp Barra agitadora</td><td>A24812</td><td></td>de <td>Applied Biosystems</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-126</td><td></td></tr><tr><td>mezclador de vórtice</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>pico de gusano</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>59-AWP</td><td></td></tr></tbody></table>

extracción a pequeña escala de adn genómico de caenorhabditis elegans

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

La extracción de ADN genómico de uno o unos pocos Caenorhabditis elegans tiene muchas aplicaciones posteriores, incluida la PCR para líneas de genotipado, clonación y secuenciación. Los métodos tradicionales basados en la proteinasa K para la extracción de ADN genómico de C. elegans tardan varias horas. Los kits de extracción comerciales que rompen efectivamente la cutícula de C. elegans y extraen ADN genómico son limitados. Aquí se informa un método fácil, más rápido (~ 15 min) y rentable de extracción de ADN genómico de C. elegans que funciona bien para aplicaciones en el aula y la investigación. Este método de extracción de ADN está optimizado para utilizar nematodos monolarvales tardíos (L4) o adultos como material de partida para obtener una plantilla confiable para realizar PCR. Los resultados indican que la calidad del ADN es adecuada para amplificar objetivos genéticos de diferentes tamaños mediante PCR, lo que permite el genotipado de uno o varios animales incluso en diluciones a una quincuagésima parte del ADN genómico de un solo adulto por reacción. Los protocolos informados se pueden utilizar de manera confiable para producir rápidamente una plantilla de ADN a partir de una sola o una pequeña muestra de C. elegans para aplicaciones basadas en PCR.

El ADN genómico de uno o varios adultos de tipo salvaje se extrajo utilizando el kit comercial o el protocolo de lisis tradicional para comparar la eficacia de estos dos métodos. Estos lisados se utilizaron como plantillas para PCR para amplificar un objetivo más grande de ~ 2,100 bp (codificación blmp-1) o un objetivo más pequeño de ~ 500 bp (codificando una parte de sma-10). Ambos métodos produjeron con éxito productos de PCR apropiados (Figura 1A).
<p class="jove_con...

Aquí se presenta una descripción del aislamiento directo y relativamente rápido del ADN genómico de Caenorhabditis elegans de uno o unos pocos animales utilizando un kit de tejido disponible comercialmente. La preparación de gDNA resultante es una plantilla adecuada para PCR.

Extracción a pequeña escala de ADN genómico de Caenorhabditis elegans

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

Hemos desarrollado un método fácil, rápido y rentable de extracción de ADN genómico de C.elegans que funciona muy bien para aplicaciones en el aula y en la investigación. Estos protocolos se pueden utilizar de manera confiable para producir rápidamente plantillas de ADN a partir de una sola o una pequeña muestra de C.elegance para aplicaciones basadas en PCR. Los usuarios que no tienen experiencia en la selección de gusanos o el uso de un micropipetador pueden tener dificultades con los pasos que requieren estas habilidades.Observar a un practicante experto y practicar puede ayudar. Demostrando el procedimiento estará Farhan Lakdawala, un estudiante graduado de último año de mi laboratorio. Para extraer ADN de un solo gusano Caenorhabditis elegans, primero, establezca el programa de lisis que consiste en un ciclo a 55 grados Celsius durante 10 minutos seguido de 95 grados Celsius durante tres minutos en un termociclador.Para preparar la solución de lisis, primero, agregue 0.8 microlitros de solución de extracción del kit a la pared interior de un tubo de PCR de 0.2 mililitros sobre hielo. Luego agregue 0.2 microlitros de solución de preparación de tejido del kit a la gota de la sol

small-scale-extraction-of-caenorhabditis-elegans-genomic-dna

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Investigación

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Biology

Biología

Análisis de microarrays se realizó para determinar los perfiles de expresión génica...

La determinación de perfiles genéticos de expresión en C. elegans Utilización de microarrays y PCR en tiempo real

Este video describe una técnica para cribar rápidamente un solo nematodo en busca de un marcador genético mediante cribado por PCR. En el protocolo de ejemplo, seleccionamos la edición del genoma basada en CRISPR.

PCR de un solo gusano: un método para extraer y amplificar el ADN genómico

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de RNA, DNA y proteínas de la misma muestra, en un esfuerzo por reducir la variación y mejorar la reproducibilidad, facilitar interpretaciones.

Nucleótido y extracciones de proteínas de Caenorhabditis elegans

Este método describe un protocolo para la preparación de extractos de proteína de alto rendimiento de caenorhabditis muestras de elegans y co-inmunoprecipitación posterior.

Preparación de extractos de proteínas y co-inmunoprecipitación de Caenorhabditis elegans

Aquí, describimos un protocolo detallado para aislar el extracto nuclear activo de la etapa larvaria 4 de C. elegans y visualizar la actividad de transcripción en un sistema in vitro .

Aislamiento del extracto nuclear activo de Caenorhabditis elegans y reconstitución para la transcripción in vitro

Este protocolo se puede utilizar para realizar estudios ecológicos a gran escala de los nematodos Caenorhabditis . La principal ventaja de este método es la organización y el análisis eficientes de los datos ecológicos y moleculares asociados con los nematodos recogidos de la naturaleza.

Un enfoque altamente escalable para realizar estudios ecológicos de los nematodos de Caenorhabditis Selfing

Se describe un protocolo que utiliza la microdisección láser para aislar tejidos de nematodos individuales para la secuenciación de ARN. El protocolo no requiere kits de herramientas genéticas específicas de la especie, lo que permite comparar los perfiles de expresión génica entre diferentes especies a nivel de muestras de un solo tejido.

Microdisección láser para aplicaciones de un solo tejido independientes de la especie

El presente protocolo describe un procedimiento para aislar intestinos de gusanos nematodos Caenorhabditis elegans adultos a mano para su aporte en genómica, proteómica, microbioma u otros ensayos.

Disección manual de los intestinos de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans es una de las principales especies modelo en biología, sin embargo, casi todas las investigaciones se realizan en ausencia de sus microbios naturalmente asociados. Los métodos descritos aquí ayudarán a mejorar nuestra comprensión de la diversidad de microbios asociados como base para futuras investigaciones funcionales de C. elegans.

Aislamiento y caracterización de la microbiota natural del nematodo modelo Caenorhabditis elegans

Los microcosmos de compost llevan la diversidad microbiana que se encuentra en la naturaleza al laboratorio para facilitar la investigación del microbioma en Caenorhabditis elegans. Aquí se proporcionan protocolos para establecer experimentos de microcosmos, y los experimentos demuestran la capacidad de modular la diversidad microbiana ambiental para explorar las relaciones entre la diversidad microbiana ambiental y la composición del microbioma intestinal del gusano.

Microcosmos de compost como entornos microbianamente diversos y naturales para la investigación del microbioma en Caenorhabditis elegans

Aquí presentamos un protocolo ATAC-seq rápido y sencillo para implementarse en un gusano completo de la etapa L4 de Caenorhabditis elegans usando solo 30 μL de pellet de gusano.

Perfilado de accesibilidad de la cromatina en larvas completas de Caenorhabditis elegans L4

Aprende a extraer ADN genómico de Caenorhabditis elegans con un protocolo rápido y económico usando un kit comercial y termociclador. Este método eficiente produce plantillas de PCR fiables para aplicaciones de investigación y educativas.

Extracción a pequeña escala de ADN genómico de Caenorhabditis elegans

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