Name: Identificación de fragmentos de ARN resultantes de la degradación enzimática mediante espectrometría de masas MALDI-TOF (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprende a caracterizar fragmentos de ARN mediante espectrometría de masas MALDI-TOF para estudios de biopolímeros. Esta técnica permite analizar muestras pequeñas con mínimo entrenamiento.

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Es importante señalar que este trabajo fue un esfuerzo de colaboración entre tres instituciones, dos grupos de investigación y una instalación central. La distribución y la carga de trabajo se llevaron a cabo de la siguiente manera: La expresión de proteínas (Xrn-1) se llevó a cabo en la Universidad de Denver (Denver, CO). La síntesis, cuantificación y experimentación de oligonucleótidos (principalmente degradación enzimática) se llevaron a cabo en la Universidad de Colorado Denver (Denver, CO). La optimización también se llevó a cabo allí. La detección, adquisición y análisis de MALDI-TOF se llevaron a cabo en la Instalación Básica de Recursos Analíticos de la Universidad Estatal de Colorado. (Fort Collins, CO). SS desea agradecer un Premio UROP (CU Denver) y becas Eureca (CU Denver) por apoyo. E. G.C. agradece el apoyo de NIGMS, a través de R00GM115757. MJER reconoce el apoyo de NIGMS, a través de 1R15GM132816. K.B. reconoce el ID de recurso: SCR_021758. El trabajo también fue apoyado por un Premio Maestro-Académico (MJER), TH-21-028, de la Fundación Henry Dreyfus.

<ol><li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+and+polymer+analyses+up+to+m%2Fz+100+000+by+laser+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).</li>
<li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10%2C000+daltons%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).</li>
<li>Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+nobel+prize+2002+goes+to+analytical+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chimia%22%5BJournal%5D)">Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry.</a> Chimia. 57, 73(2003).</li>
<li>Aristri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-based+polyurethane+resins+derived+from+tannin%3A+Source%2C+synthesis%2C+characterization%2C+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Forests%22%5BJournal%5D)">Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application.</a> Forests. 12 (11), 1516(2021).</li>
<li>Pedrazzani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-n-Alkylresorcinol+profiles+in+different+cultivars+of+einkorn%2C+emmer+spelt%2C+common+wheat%2C+and+tritordeum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).</li>
<li>Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+cell+assays+to+determine+compound+uptake+or+drug+action+using+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).</li>
<li>Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+diagnostic+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).</li>
<li>Kaufmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrix-assisted+laser+desorption+ionization+%28MALDI%29+mass+spectrometry%3A+a+novel+analytical+tool+in+molecular+biology+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology.</a> Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).</li>
<li>Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8-Oxo-7%2C8-dihydroguanosine+inhibits+or+changes+the+selectivity+of+the+theophylline+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer.</a> ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).</li>
<li>Chapman, E. G., DeRose, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+processing+of+platinated+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Enzymatic processing of platinated RNAs.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).</li>
<li>Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+strand+scission+in+double+stranded+RNA+via+a+C5-pyrimidine+radical%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).</li>
<li>Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+RNA+cleavage+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), 2(2013).</li>
<li>Ghodke, P. P., Guengerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+%CE%B7+and+%CE%BA+bypass+N2-guanine-O6-alkylguanine+DNA+alkyltransferase+cross-linked+DNA+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124(2021).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2021).</li>
<li>Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+rare+bacterial+pathogens+by+16S+rRNA+gene+sequencing+and+MALDI-TOF+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176(2016).</li>
<li>Su, K. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proofreading+and+DNA+repair+assay+using+single+nucleotide+extension+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862(2018).</li>
<li>Fagerquist, C. K., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antibacterial+immunity+proteins+in+Escherichia+coli+using+MALDI-TOF-TOF-MS%2FMS+and+Top-Down+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577(2021).</li>
<li>Phillips, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+RNA+containing+8-Oxo-7%2C8-dihydroguanosine+%288-oxoG%29+by+the+exoribonuclease+Xrn-1%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315(2021).</li>
<li>Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+solid-phase+synthesis+of+oligomers+of+RNA+containing+a+2%27-O-thiophenylmethyl+modification+and+characterization+via+circular+dichroism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189(2017).</li>
<li>Langeberg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+yeast+Xrn1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of yeast Xrn1.</a> Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).</li>
<li>Stevens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+Saccharomyces+cerevisiae+exoribonuclease+which+yields+5%27-mononucleotides+by+a+5%27+leads+to+3%27+mode+of+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).</li>
<li>Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+and+alkylation+stresses+activate+ribosome-quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control.</a> Nature Communications. 10 (1), 5611(2019).</li>
<li>Fasnacht, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+23S+rRNA+modification+ho5C2501+benefits+Escherichia+coli+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress.</a> Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).</li>
<li>Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+to+RNA+is+altered+by+the+presence+of+interacting+proteins+or+modified+nucleosides%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149(2021).</li>
<li>Tomar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+modulates+the+efficiency+of+NEIL1-catalyzed+excision+of+the+aflatoxin+B1-induced+formamidopyrimidine+guanine+adduct%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct.</a> Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).</li>
<li>Gaffney, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+env-dependent+cell+killing+by+bifunctional+small-molecule%2Fpeptide+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).</li>
<li>Sikorski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+display+of+a+chemoattractant+agonist+on+cancer+cells+activates+the+formyl+peptide+receptor+1+on+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells.</a> ChemBioChem. , 202100521(2022).</li>
<li>Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sixteen+different+types+of+lipid-conjugated+siRNAs+containing+saturated+and+unsaturated+fatty+Acids+and+exhibiting+enhanced+RNAi+potency%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El principal desafío en este flujo de trabajo surgió entre la finalización de los experimentos y la realización de los análisis espectrométricos de masas. Los experimentos se llevaron a cabo y completaron en la Universidad de Colorado Denver y se enviaron (durante la noche) a las instalaciones de la Universidad Estatal de Colorado. La adquisición de datos se llevó a cabo en el momento de la recepción, según conveniencia. Varias circunstancias inesperadas llevaron a retrasos en el proceso. En un caso, el mal funcionamient...

MALDI-TOF 1,2,3 es una técnica ampliamente utilizada para la caracterización y/o detección de moléculas de diferentes tamaños y características. Algunos de sus usos incluyen diversas aplicaciones como la detección de taninos de recursos naturales4, la obtención de imágenes de metabolitos en alimentos5, el descubrimiento o monitoreo de dianas o marcadores celulares de fármacos6, y el diagnóstico clínico7, por nombrar algunos. De relevancia para el presente trabajo es el uso de MALDI-TOF con ADN o ARN, con su uso en oligonucleótidos que se remonta a más de tres décadas8, donde se observaron varias limitaciones. Esta técnica ahora ha evolucionado a un medio confiable y comúnmente utilizado para caracterizar ambos biopolímeros9 e identificar / comprender reacciones químicas y bioquímicas, por ejemplo, caracterización de sitios platinados en ARN10, identificación de fragmentos de ARN después de la escisión de la hebra11,12, o formación de enlaces cruzados proteína-ADN13 . Por lo tanto, es valioso ilustrar y resaltar aspectos importantes del uso de esta técnica. Los conceptos básicos de MALDI-TOF se han descrito en formato de video también14 y no se desarrollarán más en este documento. Además, su aplicación en un contexto de ADN o proteína ha sido previamente descrita e ilustrada en dicho formato 15,16,17.
El protocolo para detectar fragmentos de ARN formados después de la hidrólisis enzimática se informa aquí. El modelo experimental fue elegido en base a un hallazgo reciente publicado por nuestro grupo18, donde se utilizó MALDI-TOF para determinar la reactividad única entre la exoribonucleasa Xrn-1 y los oligonucleótidos de ARN que contienen la lesión oxidativa 8-oxoG. Las hebras largas de 20 nucleótidos se obtuvieron mediante síntesis en fase sólida19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] y [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], mientras que Xrn-1 se expresó y purificó siguiendo el informe20 descrito anteriormente. En resumen, Xrn-121 es una exoribonucleasa 5'-3' con varias funciones biológicas clave que degradan múltiples tipos de ARN, incluido el ARNoxidado 22. Se encontró que la procesividad de la enzima se detiene al encontrarse con 8-oxoG, lo que llevó a fragmentos de ARN que contienen extremos 5'-fosforilados [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], y [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
Finalmente, es importante señalar que la espectrometría de masas es un método poderoso que, a través de diversas metodologías, puede adaptarse a otros fines23,24; por lo tanto, elegir el método de ionización correcto, así como otra configuración experimental es de suma importancia.

<table><tbody><tr><td>0.6 mL MCT Graduado Violeta Fisher</td><td>Scientific</td><td>05-408-127</td><td></td></tr><tr><td>6'-Trihidroxiacetofenona monohidrato 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>480-66-0</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo 99.9%, grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Trifosfato de adenosina, 10 mM</td><td>New Englang Bioscience</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de amonio, dibásico 98% </td><td>Sigma Aldrich</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de amonio 98.0%, grado ACS</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-01-8</td><td></td></tr><tr><td>Estándar de prueba bacteriana Bruker</td><td>Bruker Daltonics</td><td>8255343</td><td></td></tr><tr><td>Fuente comercial de Xrn-1</td><td>New England BioLabs</td><td>M0338S</td><td></td></tr><tr><td>Pirocarbonato de dietilo, 97 %</td><td>ACROS Organics</td><td></td> A0368487 <td></td></tr><tr><td>análisis Flex software</td><td>Bruker daltonics</td><td></td><td>FlexAnalysis versión 3.4, Bruker Daltonics</td></tr><tr><td>Lambda 365 espectrofotómetro UV-vis</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa MALDI: MSP 96 blanco de acero rectificado</td><td>Bruker Daltonics</td><td>280799</td><td></td></tr><tr><td>espectrómetro de masas</td><td>Bruker</td><td></td><td>Microflex LRFTOF (Bruker Daltonics, Billerica, MA)</td></tr><tr><td>Mili-Q IQ 7000</td><td>Se utilizó el sistema Milipore Sigma</td><td></td><td>A Mili-Q para purificar toda el agua utilizada en este trabajo</td></tr><tr><td>Dispositivos centrífugos Nanosep con membrana OmegaTM 10 K, azul (24/paquete)</td>Medios filtrantes <td>Pall Corporation</td><td>OD010C33</td><td>, Omega (polietersulfona modificada) Tamaño de poro 10 K</td></tr><tr><td>NEBuffer 3</td><td>New England Biolabs</td><td>B7003S</td><td>Esta es</td></tr><tr><td>la solución B Herramienta de análisis de oligo</td><td>IDT-DNA</td><td></td><td>https://www.idtdna.com/calc/analyzer</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta P10</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-441</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta P200</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-419</td><td></td></tr><tr><td>RNasa Away</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleótido quinasa</td><td>Nueva Inglaterra BioLabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 T4 Tampón de reacción de polinucleótido quinasa</td><td>Nuevo Inglaterra BioLabs</td><td>B0201S</td><td>Esta es la solución A</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Alfa Aesar</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>Xrn-1 exoribonucleasa</td><td>Expresado en casa</td><td>Ver ref. 20</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta ZipTip para la preparación de muestras</td><td>Millipore</td><td>ZTC 18S 096</td><td>10 &micro; L puntas de pipeta cargadas con un estándar C18 0.6 y micro; Cama L</td></tr></tbody></table>

identificación de fragmentos de arn resultantes de la degradación enzimática mediante espectrometría de masas maldi-tof

Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry

El ARN es un biopolímero presente en todos los dominios de la vida, y sus interacciones con otras moléculas y / o especies reactivas, por ejemplo, ADN, proteínas, iones, medicamentos y radicales libres, son omnipresentes. Como resultado, el ARN sufre varias reacciones que incluyen su escisión, degradación o modificación, lo que lleva a especies biológicamente relevantes con distintas funciones e implicaciones. Un ejemplo es la oxidación de la guanina a 7,8-dihidro-8-oxoguanina (8-oxoG), que puede ocurrir en presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS). En general, los procedimientos que caracterizan tales productos y transformaciones son en gran medida valiosos para la comunidad científica. Con este fin, la espectrometría de masas de tiempo de vuelo por ionización por láser asistida por matriz (MALDI-TOF) es un método ampliamente utilizado. El presente protocolo describe cómo caracterizar los fragmentos de ARN formados después del tratamiento enzimático. El modelo elegido utiliza una reacción entre el ARN y la exoribonucleasa Xrn-1, donde la digestión enzimática se detiene en los sitios oxidados. Dos secuencias largas de ARN de 20 nucleótidos [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] y [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] se obtuvieron mediante síntesis en fase sólida, cuantificadas por espectroscopia UV-vis, y caracterizadas mediante MALDI-TOF. Las hebras obtenidas fueron entonces (1) 5'-fosforiladas y caracterizadas vía MALDI-TOF; (2) tratado con Xrn-1; (3) filtrado y desalinizado; (4) analizado vía MALDI-TOF. Esta configuración experimental condujo a la identificación inequívoca de los fragmentos asociados con el estancamiento de Xrn-1: [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], y [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Los experimentos descritos se llevaron a cabo con 200 picomoles de ARN (20 pmol utilizados para los análisis MALDI); sin embargo, cantidades más bajas pueden resultar en picos detectables con espectrómetros que utilizan fuentes láser con más potencia que la utilizada en este trabajo. Es importante destacar que la metodología descrita puede generalizarse y potencialmente extenderse a la identificación de productos para otros procesos que involucran ARN y ADN, y puede ayudar en la caracterización / elucidación de otras vías bioquímicas.

Los oligonucleótidos utilizados en este trabajo fueron sintetizados, caracterizados y cuantificados antes de su uso. La concentración de todos los oligonucleótidos se determinó mediante espectroscopia UV-vis registrada a 90 °C para evitar lecturas erróneas derivadas de la posible formación de las estructuras secundarias. La Figura 3 muestra los espectros del modelo de oligonucleótidos de ARN utilizados en este trabajo, tomados a temperatura ambiente y después de aplicar calor.
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MALDI-TOF se utilizó para caracterizar fragmentos obtenidos de la reactividad entre el ARN oxidado y la exoribonucleasa Xrn-1. El presente protocolo describe una metodología que puede aplicarse a otros procesos que involucran ARN y/o ADN.

Identificación de fragmentos de ARN resultantes de la degradación enzimática mediante espectrometría de masas MALDI-TOF

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, ...

La espectrometría de masas ha sido ampliamente adoptada para diversas aplicaciones. La metodología de este artículo proporciona la caracterización inequívoca de fragmentos de ARN obtenidos a partir de un proceso enzimático in vitro. Las ventajas de esta técnica incluyen que se obtiene el pico de hierro de la molécula, que los experimentos se pueden llevar a cabo con pequeñas cantidades de material para aplicaciones in vitro y que el protocolo se puede lograr con un entrenamiento mínimo.La metodología descrita se puede aplicar ampliamente para estudiar procesos que involucran ADN, ARN o proteínas. Los ejemplos incluyen transformaciones bioquímicas como información cruzada, identificación de modificaciones químicas u otras interacciones y reactividad de biopolímeros. Una dificultad puede ocurrir por la accesibilidad a un espectrómetro MALDI o a las instalaciones centrales que ofrecen este servicio.Otro aspecto es establecer el límite de detección que puede ser mayor o menor dependiendo del instrumento. Para comenzar, encienda el espectrofotómetro UV-Vis, luego haga clic en el icono PerkinElmer UV WinLab para abrir la ventana de control de operación del instrumento. Encienda el espectrofotómetro del controlador de temperatura Peltier con el interruptor situado a la derecha del instrumento y haga clic en Scan-Lambda 365, presente en Métodos base.Se abrirá otra pantalla y se le pedirá al usuario que se asegure de que los soportes de las celdas estén vacíos. Haga clic en Aceptar y permita que el instrumento realice las comprobaciones del sistema. Ahora, ajuste los parámetros de escaneo seleccionando Recopilación de datos.En la nueva ventana, en Configuración de escaneo, cambie el inicio a 350 nanómetros y el final a 215 nanómetros. Activa el Peltier seleccionando el plus a la izquierda del accesorio. Luego haga clic en Multiple Cell Peltier, cambie los grados de temperatura Celsius a 25 y haga clic en Peltier On.Navegue a la pestaña de información de muestra e ingrese el número de muestras, nombres y posición de celda deseados.Haga clic en Autozero e inserte la cubeta que contiene la solución de fondo. Haga clic en Inicio e inserte la cubeta en la celda deseada y asegúrese de que la ventana de la cubeta esté orientada paralelamente a la cara frontal del instrumento. Ahora, haga clic en Aceptar para comenzar el primer escaneo a 25 grados centígrados.Para mediciones a temperaturas más altas, haga clic en Multiple Cell Peltier, cambie la temperatura a la temperatura de muestra deseada y repita el escaneo. Haga clic en Archivo, Exportar y elija la ubicación del archivo deseado y seleccione XY Data para obtener un archivo de texto. Para realizar la fosforilación de 5'de ARN, prepare una solución en un tubo de micro centrífuga de 0,6 microlitros agregando agua libre de RNasa de 33,5 microlitros, cinco microlitros de solución A, seis microlitos de trifosfato de adenosina milimolar de 10 milimolares, una microlita de solución acuosa de ARN micromolar y 4,5 microlitros de polinucleótido quinasa y mezcle la solución suavemente.Incubar la mezcla de reacción a 37 grados centígrados durante 45 minutos colocándola en un baño de agua. Luego inactivando la enzima colocando el tubo de reacción en un bloque de calor, precalentado a 65 grados centígrados durante 10 minutos. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente para producir una solución final de ARN fosforilado de 5'.Después de la incubación, use 50 microlitros de esta solución, agregue cinco microlitros de solución B y cinco microlitros de solución de 1-fetomole de Xrn-1 para realizar la hidrólisis de ARN. Incubar el tubo de reacción a temperatura ambiente durante dos horas. Transfiera esta mezcla de reacción a un dispositivo centrífugo del tamaño de un poro de 10 kilodalton y filtre las enzimas centrifugando durante 10 minutos a 700 veces G.Transfiera el filtrado a un tubo centrífugo de 0,6 mililitros.Luego, agregue 20 microlitros de agua libre de RNasa para lavar el ARN residual en el tubo centrífugo, seguido de centrifugación. Finalmente, combine este filtrado con el filtrado resultante obtenido previamente por centrifugación en un dispositivo centrífugo de 10 kilodaltons del tamaño de un poro, y congele la solución a cero grados Celsius o envíela para su análisis. Para desalinizar y concentrar la muestra, utilice puntas de pipeta C18 de intercambio catiónico disponibles comercialmente cargadas con un lecho de medios de cromatografía C18 en su extremo.Para esto, coloque la punta de pipeta de 10 microlitros sobre una pipeta de 10 microlitros y lave esta punta dos veces con una solución acuosa de acetilnilo al 50%. Deseche los volúmenes utilizados en un tubo de desecho separado cada vez y equilibre la punta C18 con 10 microlitros de solución de ácido trifluoroacético acuoso al 0,1% dos veces. Retire manualmente la punta C18 de la pipeta y asegúrela en una pipeta de 200 microlitros que contenga una punta de pipeta P200.Luego sumerja la punta C18 en la solución resultante preparada durante la hidrólisis de oligonucleótidos de ARN por Xrn-1 y aspire liberar la solución a través de la punta C18 10 veces. Ahora, separe la punta C18 de la pipeta P200, colóquela en una pipeta de 10 microlitros y lave la punta C18 con una solución acuosa de solución de ácido trifluoroacético al 0,1% dos veces. Deseche los volúmenes usados en un tubo de desecho separado cada vez.Lave la punta C18 con agua libre de RNasa de 10 microlitros dos veces. Para detectar en la placa MALDI, eluya el oligonucleótido de ARN de la punta C18 sumergiendo la muestra en la matriz deseada y dispensando la solución de nuevo en el tubo 10 veces. Pipetee esta solución en dos puntos separados de un microlitro cada uno en la placa y permita que los puntos se sequen al aire.La concentración de ARN utilizada en este trabajo se determinó mediante espectroscopia UV-Visible registrada a 90 grados centígrados para evitar lecturas erróneas derivadas de la formación potencial de las estructuras secundarias. La secuencia general de eventos incluyó dos partes. Uno, la eficiente fosforilación 5' del ARN, evidenciada por la aparición de un solo pico correspondiente al producto esperado.Y dos, el fragmento de estancamiento que surge del tratamiento de la mezcla de muestra con Xrn-1. Los mismos resultados se obtuvieron utilizando una secuencia diferente que contenía dos lesiones oxidativas. Los cambios potenciales a considerar incluyen la eliminación del uso del dispositivo de filtrado o la consideración de diferentes matrices para el manchado MALDI.Por ejemplo, ácido sinapínico o ácido picolínico. Los fragmentos de ARN se obtuvieron a partir de un proceso enzimático. Este proceso se estableció mediante el acoplamiento maldi, el análisis electroforético, la síntesis en fase sólida y el dicroísmo circular.El protocolo descrito tiene un potencial para ser utilizado en diversos campos, desde la investigación en las ciencias químicas hasta las aplicaciones en el campo biomédico.

identification-rna-fragments-resulting-from-enzymatic-degradation

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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