Name: Ex Vivo Liberación del péptido relacionado con el gen de la calcitonina del sistema trigémino vascular en roedores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprende a medir la liberación de péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) en el sistema trigémino vascular de roedores mediante un modelo ex vivo. Este método permite evaluar agentes farmacológicos en tres sitios distintos.

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Este trabajo fue financiado por la Fundación Candys.

Todos los procedimientos experimentales y de cuidado de animales se realizaron de acuerdo con la guía de la Comunidad Europea para el cuidado y uso de animales (2010/63/UE). Para demostrar este protocolo se utilizaron ratones machos C57BL/6JBomTac, de 10 semanas de edad, y ratas macho Sprague Dawley, de 10 semanas.
1. Preparación del líquido intersticial sintético
<ol><li>Prepare el líquido intersticial sintético (SIF) de acuerdo con la siguiente receta: 108 mM NaCl, 3.48 mM KCl, 3.50 mM MgSO 4, 26 mM NaHCO3, 11.70 mM NaH 2 PO4, 1.50 mM CaCl2, 9.60 mM Na-gluconato, 5.50 mM glucosa y 7.60 mM sacarosa (ver Tabla de materiales). NOTA: SIF puede variar dependiendo del objetivo de estimulación, por ejemplo, se puede usar una solución libre de calcio cuando se estudian los canales de calcio.</li>
	<li>Ajustar el pH a 7,4 y estabilizar el pH mediante gasificación de carbógeno (5% CO2 y 95%O2)46.</li>
</ol>2. Eutanasia
<ol><li>Anestesiar ratones y ratas adultos con una mezcla de 70% de CO2 y 30% deO2. Decapitar ratones usando un par de tijeras y ratas usando una guillotina (ver Tabla de Materiales). NOTA: Utilice una cepa y una edad que se ajusten al objetivo de la investigación. Tanto hombres como mujeres se pueden utilizar en este modelo.</li>
	<li>Separe la cabeza del cuerpo en el nivel C3-C4 de la médula espinal. NOTA: La eutanasia también se puede realizar con una inyección intraperitoneal de pentobarbital (100-150 mg / kg).</li>
</ol>3. Disección
<ol><li>Prepare el tejido de rata siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Retire la piel y el músculo alrededor de la cabeza y el cuello con un par de tijeras (Figura 1A).</li>
		<li>Use un recortador de huesos y tijeras para separar las mandíbulas inferiores de la cabeza (Figura 1B-C).</li>
		<li>Abra la médula espinal insertando un recortador óseo caudalmente en la parte dorsal de las vértebras y retire la parte dorsal de las vértebras para exponer la médula espinal y el tronco encefálico (Figura 1D).</li>
		<li>Cortar la parte caudal del cráneo por los bordes de los huesos occipital e interparietal para eliminar estas estructuras óseas exponiendo el cerebelo (Figura 1E). NOTA: Es importante no dañar el tronco encefálico y la médula espinal mientras corta y retira las vértebras.</li>
		<li>Aísle el TNC (Sp5C) que corre caudalmente aproximadamente 13-16 mm desde el bregma en cada lado cortando la parte dorsolateral del tronco encefálico con tijeras de resorte. Sumerja el TNC izquierdo y derecho en SIF (Figura 1E-I). NOTA: La descripción corresponde a ratas adultas.</li>
		<li>Corte la cabeza a mediados de la sagitación para dividir el cráneo en dos usando una sierra (Figura 1J-L).</li>
		<li>Retire cuidadosamente el cerebro sin tocar la duramadre unida al cráneo usando una espátula y cortando el nervio trigémino donde ingresa al tronco encefálico (Figura 1M-P).</li>
		<li>Para aislar el TG, córtelo, incluidas sus ramas alrededor de los bordes visuales. Corte la rama mandibular donde entra en el foramen oval. Corte las ramas oftálmicas y maxilares que entran en el cráneo, ya que no se dividen macroscópicamente. Mientras disecciona el TG, retire la duramadre que cubre el TG (Figura 1Q-T).</li>
		<li>Sumerja las mitades craneales y los TG en SIF.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare el tejido del ratón siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Retire la piel y el músculo alrededor de la cabeza y el cuello con tijeras pequeñas (Figura 2A-B).</li>
		<li>Abra la médula espinal insertando un par de tijeras pequeñas caudalmente en la parte dorsal de las vértebras y retire la parte dorsal de las vértebras para exponer la médula espinal y el tronco encefálico (Figura 2C). NOTA: Es importante no dañar la médula espinal mientras se cortan y retiran las vértebras.</li>
		<li>Cortar el cráneo por los bordes de los huesos occipital e interparietal para eliminar estas estructuras óseas que exponen el cerebelo (Figura 2D-F).</li>
		<li>Luego, corte el hueso parietal a mediados de la sagitación y retire el hueso para exponer el cerebro (Figura 2G-I).</li>
		<li>Retire cuidadosamente el cerebelo con una espátula para exponer el tronco encefálico (Figura 2J).</li>
		<li>Aísle la parte del tronco encefálico que contiene TNC usando tijeras de resorte (Figura 2K-N). Sumergir el tronco encefálico con TNC en SIF (Figura 2O).</li>
		<li>Extirpar el cerebro y cortar el nervio trigémino donde entra en el tronco encefálico (Figura 2P-Q).</li>
		<li>Para aislar el TG, córtelo, incluidas sus ramas alrededor de los bordes visuales. Corte la rama mandibular donde entra en el foramen oval. Corte las ramas oftálmicas y maxilares que entran en el cráneo, ya que no se dividen macroscópicamente. Mientras disecciona el TG, retire la duramadre que cubre el TG (Figura 2R-S).</li>
		<li>Sumerja los TG en SIF (Figura 2T).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Lavado
<ol><li>Lave las mitades del cráneo, TNC y TG en SIF durante 30 minutos mientras reemplaza el SIF cada 5 minutos a temperatura ambiente. NOTA: Los pasos de lavado se pueden realizar manteniendo el pañuelo en recipientes de plástico con tapa de tul para permitir un fácil intercambio SIF (Figura 3A-B).</li>
	<li>Prepare el tejido de rata siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Transfiera las mitades TNC a tapas de tubos de microcentrífuga separadas con 350 μL de SIF (Figura 3C).</li>
		<li>Transfiera los TG a tapas de tubos de microcentrífuga: un TG por tapa de tubo de microcentrífuga con 350 μL de SIF (Figura 3C).</li>
		<li>Coloque las mitades del cráneo en plataformas hechas de arcilla o una placa de cultivo de 6 pocillos y llene el cráneo con 400 μL de SIF (Figura 3C).</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare el tejido del ratón siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Transfiera el tronco encefálico con TNC a una tapa del tubo de microcentrífuga con 250 μL de SIF (Figura 3D).</li>
		<li>Transfiera los dos TG a una tapa de tubo de microcentrífuga con 250 μL de SIF (Figura 3D). NOTA: Coloque dos TG por tapa del tubo de microcentrífuga cuando use tejido de ratones.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocar cráneos de rata y tapas de tubos de microcentrífuga con tejido de rata y ratón en una incubadora humidificada a 37 °C. Sustituya SIF con una pipeta cada 5 minutos durante 20 minutos. NOTA: Es importante no tocar el tejido al agregar y quitar SIF.</li>
</ol>5. Pruebas de drogas
<ol><li>Determinar los niveles basales de liberación de CGRP.<ol><li>Después del último lavado, añadir 250 μL de SIF a TG y TNC de ratón. Agregue 350 μL a la rata TG y TNC y 400 μL a cada cráneo de rata.</li>
		<li>Después de 10 minutos de incubación, recoger 200 μL de la muestra en un tubo de microcentrífuga y añadir 50 μL de tampón EIA 10x (provisto con el kit de inmunoensayo enzimático CGRP, ver Tabla de materiales) para permitir la medición de la liberación basal de CGRP (paso 6). Deseche el líquido restante. NOTA: El tiempo de incubación debe ser el mismo para todas las muestras.</li>
		<li>Conservar inmediatamente las muestras a -20 °C.</li>
		<li>Después de muestrear los niveles basales de liberación de CGRP, siga uno de los tres métodos: (A) Estimulación única (paso 5.2); (B) Estimulación concentración-respuesta (paso 5.3); y (C) Inhibición de la estimulación (paso 5.4) (Figura 4). NOTA: El compuesto de ensayo y las concentraciones utilizadas dependen del objetivo del estudio.</li>
	</ol></li>
	<li>Realice una sola estimulación siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Añadir el compuesto o vehículo de ensayo al tejido y dejarlo durante 10 min (volumen: 250 μL para TG y TNC de ratón, 350 μL para TG y TNC de rata, y 400 μL para cada cráneo de rata).</li>
		<li>Después de 10 minutos de incubación, recoger 200 μL de la muestra en un tubo de microcentrífuga con 50 μL de tampón EIA 10x. Deseche el líquido restante y almacene inmediatamente las muestras a -20 °C. NOTA: El tiempo de incubación debe ser el mismo para todas las muestras.</li>
	</ol></li>
	<li>Realice la estimulación concentración-respuesta siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Diluir el compuesto o vehículo de ensayo a las concentraciones deseadas. Añadir el compuesto problema en concentraciones crecientes comenzando con la concentración más baja. NOTA: El compuesto de ensayo y las concentraciones utilizadas dependen del objetivo del estudio. Por ejemplo, se utilizó supercinamaldehído de 1 μM, 10 μM y 100 μM para el presente estudio.</li>
		<li>Añadir la concentración más baja (1 μM para el presente estudio) del compuesto problema y el vehículo correspondiente a dos preparaciones tisulares idénticas e incubar durante 10 min (volumen: 250 μL para tejido de ratón, 350 μL para TG y TNC de rata, y 400 μL para cada cráneo de rata).</li>
		<li>Después de 10 minutos de incubación, recoger 200 μL de la muestra en un tubo de microcentrífuga con 50 μL de tampón EIA 10x.</li>
		<li>Desechar el líquido restante y añadir la segunda concentración más baja (10 μM para el presente estudio) al tejido.</li>
		<li>Conservar inmediatamente las muestras a -20 °C.</li>
		<li>Repita este procedimiento con las concentraciones restantes (100 μM para el presente estudio).</li>
	</ol></li>
	<li>Realice la inhibición de la estimulación siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Agregue el bloqueador o vehículo al tejido e incube durante 10 minutos (volumen: 250 μL para tejido de ratón, 350 μL para TG y TNC de rata, y 400 μL para cada cráneo de rata). NOTA: El bloqueador y la concentración utilizada dependen del objetivo del estudio. Por ejemplo, se utilizó glibenclamida de 3 μM para el resultado representativo de la Figura 5.</li>
		<li>Después de 10 minutos de incubación, recoger una muestra de 200 μL en un tubo de microcentrífuga con 50 μL de tampón EIA 10x. Deseche el líquido restante y almacene inmediatamente las muestras a -20 °C.</li>
		<li>Agregue el agonista o agonista + bloqueador (consulte la Tabla de materiales) al tejido e incube durante 10 minutos. NOTA: El agonista, el bloqueador y las concentraciones utilizadas dependen del objetivo del estudio. En el presente estudio, se utilizaron 3 μM de glibenclamida y 1 μM de capsaicina, Figura 5.</li>
		<li>Después de 10 minutos de incubación, recoger una muestra de 200 μL en un tubo de microcentrífuga con 50 μL de tampón EIA 10x. Deseche el líquido restante y almacene inmediatamente las muestras a -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Realice un control positivo para el experimento.<ol><li>Cuando sea apropiado, agregue un control positivo (por ejemplo, 1-10 μM de capsaicina, ver Tabla de materiales) al tejido al final del protocolo y recoja una muestra de 200 μL en un tubo de microcentrífuga con 50 μL de tampón EIA 10x después de un período de incubación de 10 min. NOTA: Es ventajoso incluir un control positivo para garantizar que la configuración y los tejidos estén funcionando. La capsaicina 48,49,50 o el estímulo despolarizante del potasio (40-60 mM de KCl)46,47,49 se utilizan rutinariamente para causar la liberación de CGRP del sistema trigéminovascular. 40-60 mM de KCl SIF se preparan como SIF, excepto NaCl se intercambia por KCl sobre una base equimolar.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Análisis de las concentraciones de CGRP
<ol><li>Mida la cantidad de CGRP liberada utilizando un kit de inmunoensayo enzimático (EIA) siguiendo el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Mida la densidad óptica a 410 nm utilizando un fotómetro de placa. Si se utiliza un kit CGRP EIA diferente, mida la densidad óptica en la longitud de onda proporcionada en el protocolo del fabricante. NOTA: Las muestras deben diluirse para que coincidan con la curva estándar.</li>
	<li>Realizar análisis de datos.<ol><li>Presente los datos como concentraciones absolutas o normalícelos a la liberación basal de CGRP del tejido específico.</li>
	</ol></li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método descrito fue desarrollado después de estudios que muestran la importancia de CGRP en la fisiopatología de la migraña. Es muy adecuado para investigar los mecanismos involucrados en la liberación de CGRP del sistema trigémino vascular, que es crucial para la señalización del dolor en la región de la cabeza. La cantidad de CGRP obtenida en este modelo mide directamente la liberación de CGRP de los nervios trigéminos que inervan duramadre, TG y TNC. La cantidad de liberación de CGRP es cuantitativamente mayor 45,54 que la liberación medida en plasma después de la termocoagulación en humanos, la estimulación del trigémino en cat 39,55,56 y durante los ataques de migraña23. Una explicación podría ser que CGRP se diluye y degrada en la sangre54. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la estimulación directa con productos químicos podría ser superior a la activación fisiopatológica. Otras ventajas son que es posible localizar la liberación de tres sitios diferentes dentro del sistema trigémino vascular y que se puede utilizar junto con la manipulación farmacológica y en tejidos de roedores modificados genéticamente.
Últimamente, muchos modelos preclínicos de roedores se centran en la administración sistémica de sustancias y las lecturas posteriores relacionadas con el dolor o la migraña utilizando pruebas de von Frey57,58, muecas59,60,61 o aversión a la luz 62,63,64. Estos métodos son útiles para comprender las propiedades inductoras y analgésicas de diferentes sustancias. Sin embargo, estos enfoques no proporcionan información sobre los tejidos diana específicos involucrados. En el presente método, el sistema trigémino vascular se divide en tres estructuras: duramadre, TG y TNC. Esto permite la exposición local de cada estructura y la evaluación de la ubicación de acción de una sustancia específica. Esto se utilizó en un estudio de 2011, donde se exploró el papel de los canales de calcio dependientes de voltaje en ratas, y se encontró que la inhibición de estos canales era diferente en las tres estructuras de la vía trigémino vascular47. Al diseccionar estructuras del sistema nervioso, la axotomía es inevitable. Se ha demostrado que la axotomía altera la transcripción de varios genes65. Estos cambios transcripcionales son demasiado lentos para afectar los resultados de este método, pero los cambios en la fosforilación no pueden ser excluidos cuando se comparan con situaciones in vivo 46. Aunque los neuropéptidos como CGRP se forman en el soma celular, la liberación y la acción de los neuropéptidos generalmente se encuentran en las terminales nerviosas centrales o periféricas. Por lo tanto, los estudios de neuronas intactas, incluidas las terminales, son interesantes cuando se estudia la liberación de neuropéptidos. Por lo tanto, se han establecido métodos de estudio de cultivos de neuronas de ganglios aislados para servir como modelo de los terminales. Sin embargo, los cultivos celulares neuronales están sujetos a varios problemas, ya que la disociación mecánica puede destruir las neuronas en un cultivo46. El mayor período de tiempo asociado al cultivo de células deja este método sensible a los cambios transcriptómicos debidos a la axotomía y a las condiciones de cultivo65. Además, la adición de factores de crecimiento y el cultivo en recubrimientos superficiales han alterado las propiedades neuronales como transmisor y expresión del receptor66,67,68,69. Estos problemas se evitan cuando se estudian ganglios intactos recién aislados en lugar de cultivos de células neuronales.
Un desafío con el método de liberación de CGRP ex vivo es la disección precisa del tejido requerida para obtener resultados reproducibles. La disección especialmente precisa del TNC es un desafío, ya que se trata de una estructura dentro del tronco encefálico sin bordes visibles. Además, la duramadre es frágil, y la extracción del cerebro debe llevarse a cabo con cuidado para garantizar una estructura intacta. Estos obstáculos pueden resultar en un tamaño de tejido variable y, por lo tanto, niveles basales y de CGRP inducidos por estimulación. Sin embargo, esta variación puede explicarse por la normalización a la liberación basal de CGRP. También debe tenerse en cuenta que al aislar el TNC de ratones, se aísla toda la parte inferior del tronco encefálico y no la parte más específica que contiene TNC como se hace en ratas. En general, puede ser una ventaja utilizar tejido de rata, ya que esto permite medir la liberación de CGRP de la duramadre y una disección más precisa del TNC. Además, el tamaño del tejido también permite el uso de una rata como control del vehículo, ya que una rata da como resultado dos mitades craneales, dos TG y dos TNC donde una pieza del tejido se utiliza para la estimulación de sustancias y la otra para el vehículo. Cuando se usan ratones, se necesitan dos animales para un experimento, ya que ambos TG se agrupan en una muestra, y los TNC se diseccionan como un tronco encefálico. Por lo tanto, dos TG y un tronco encefálico se utilizan para la estimulación de sustancias, y dos TG y un tronco encefálico de otro ratón se utilizan para el control del vehículo. Esto resulta en el uso del doble de ratones en comparación con las ratas para obtener el mismo número de réplicas. Para reducir el número de ratones utilizados, se ha sugerido un método para medir la liberación de CGRP de las rebanadas del tronco encefálico49. Es una ventaja que el método haya sido modificado para permitir el uso de ratones. Esto permite el uso de muchas cepas de ratones transgénicos ya disponibles, una herramienta útil para estudiar, por ejemplo, las vías de señalización. Se debe incluir un control positivo al final de un experimento para garantizar que el tejido utilizado en el experimento pueda liberar CGRP. El control positivo podría ser el agonista capsaicina TRPV1 o el estímulo despolarizante de potasio (KCl), que se ha encontrado que libera CGRP del sistema trigémino vascular tanto en ratones como en ratas 46,47,48,49,50. Además, el método también ha sido adaptado para medir la liberación de otros péptidos relevantes como el péptido activador de la adenilato ciclasa hipofisaria (PACAP), otro péptido de gran interés dentro de la investigación de la migraña70.
El método proporciona una herramienta útil para investigar la liberación de CGRP de tejidos diana específicos en ratas y ratones. Es un método relativamente rápido que evita los problemas asociados con el cultivo de neuronas. El protocolo del método puede modificarse fácilmente para estudiar la relación concentración-respuesta o la inhibición de una respuesta por diversos compuestos farmacológicos. El método de liberación de CGRP ex vivo es uno de los varios métodos preclínicos útiles para estudiar el papel de CGRP y otros mecanismos relacionados con la liberación de CGRP en la fisiopatología de la migraña.

La migraña es un trastorno neurológico que, según la OMS, se estima que afecta a más de 1.000 millones de personas y es una de las principales causas de discapacidad en todo el mundo1. Por lo tanto, la migraña tiene un impacto significativo tanto en los pacientes como en la sociedad. A pesar del reciente éxito clínico de los fármacos antagonizantes CGRP, una gran proporción de pacientes necesita mejores opciones de tratamiento 2,3,4,5. Se requiere la elucidación de la fisiopatología de la migraña que conduzca a nuevos tratamientos efectivos. La señalización dentro del sistema trigémino vascular constituido por las meninges, los ganglios del trigémino (TG) y el núcleo trigémino caudal (TNC) es central para la fisiopatología de la migraña 6,7.
El péptido relacionado con el gen de la calcitonina del neuropéptido de 37 aminoácidos (CGRP) se descubrió por primera vez a principios de la década de 1980 cuando Amara y sus colaboradores demostraron que la transcripción primaria de ARN del gen de la calcitonina podría procesarse para dar ARNm que codifica CGRP además de calcitonina 8,9. La investigación posterior sugirió un vínculo con la fisiopatología de la migraña10. CGRP es un neurotransmisor con potentes propiedades vasodilatadoras 11,12,13,14,15,16,1 7, y está ampliamente distribuido en el sistema nervioso central y periférico 13,14,18,19,20,21,22 . La participación de CGRP en la migraña fue subrayada con el descubrimiento de un aumento de los niveles de CGRP en la circulación extracerebral durante los ataques de migraña en humanos23, y que la infusión de CGRP causa dolor similar a la migraña en pacientes24. Dos años más tarde, se publicó el primer estudio de prueba de concepto de la efectividad del antagonista de CGRP olcegepant en el tratamiento de la migraña25.
CGRP es abundante en el sistema trigémino vascular como se demuestra en el TG 21,26, fibras nerviosas sensoriales que inervan la duramadre27,28,29, y TNC30. En el sistema trigémino vascular, CGRP se encuentra en las neuronas de tamaño pequeño a mediano del TG, en fibras C no mielinizadas, y se expresa en casi el 50% de la población neuronal del TG. El receptor CGRP se expresa principalmente en neuronas más grandes y se encuentra en fibras Aδ mielinizadas31,32. CGRP se libera de las neuronas tras la estimulación química o eléctrica33,34. Los estudios de las vías que conducen a la liberación de CGRP y la ubicación de esta activación son cruciales para comprender la fisiopatología de la migraña. A lo largo de las últimas 5 décadas, los estudios preclínicos han contribuido a adquirir un amplio conocimiento sobre la señalización relacionada con la migraña y han contribuido al desarrollo de nuevos tratamientos35. Muchos métodos que consideran la participación vascular y neurogénica se han modificado y aplicado en la investigación de la migraña. Se pueden mencionar modelos in vivo e in vitro de respuestas arteriales a compuestos biológicos o tratamientos farmacológicos17,36,37 y estimulación nerviosa eléctrica38,39. Además, las neuronas activadas en el TNC pueden ser detectadas por la expresión de c-Fos 40,41,42 y los registros electrofisiológicos en esta área 43,44. Ambos métodos miden las señales nociceptivas transmitidas al cerebro desde la cabeza, por ejemplo, duramadre. El uso de un solo modelo preclínico no presenta la imagen completa de la fisiopatología de la migraña. Por lo tanto, es importante combinar diferentes modelos que cubran tantos aspectos de la fisiopatología de la migraña como sea posible. El desarrollo continuo de nuevos modelos cubrirá varios aspectos de los mecanismos de la migraña, y con el tiempo se descubrirá el misterio de la fisiopatología de la migraña.
Aquí, se presenta un protocolo detallado del método de liberación de CGRP, realizado ex vivo en TG y TNC aislados de ratones después de la estimulación química. La liberación de CGRP también se puede estudiar en la duramadre de ratas. Así, en el protocolo experimental para ratas, la duramadre se describe junto con TG y TNC. La base para el método de liberación de CGRP se describió por primera vez en 1999, donde Ebersberger y sus colaboradores realizaron una investigación pionera y encontraron que CGRP se liberó de la duramadre después de la estimulación química y eléctrica de aferentes durales en ratas45. Más tarde, este enfoque se extendió a la liberación CGRP del TG46 y el TNC47. Posteriormente, el método se modificó para aplicarse a TG y TNC en ratones. Hasta ahora, la liberación de CGRP de la duramadre ha sido un desafío en ratones.

<table><tbody><tr><td>placa de cultivo de 6 pocillos</td><td>NUNC</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Merck</td><td>1.02382.1000</td><td>Para tampón SIF</td></tr><tr><td>Tapones para envases de plástico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>536617</td><td></td></tr><tr><td>Capsaicina</td><td>Merck</td><td>M2028</td><td></td></tr><tr><td>CGRP kits</td><td>AH Diagnostics</td><td>A05482.96</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Strandm&oslash; llen</td><td>4.6</td><td>Para la gasificación de carbogen de SIF</td></tr><tr><td>Recortadora de huesos delicados</td><td>Fine Science Tools</td><td>16109-14</td><td></td></tr><tr><td>Glibenclamida</td><td>Tocris</td><td>911</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Merck</td><td>G7021</td><td>Para tampón SIF</td></tr><tr><td>Guillotina para ratas</td><td>Scandidact</td><td>NS-802</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado</td><td>Merck</td><td>M5921</td><td>Para tampón SIF</td></tr><tr><td>Microcenrifuge tubos + tapas/tapones</td><td>VWR</td><td>700-5239</td><td></td></tr><tr><td>Mini sierra para metales</td><td>BAHCO</td><td>208</td><td></td></tr><tr><td>O2</td><td>Strandm&oslash; llen</td><td>4.5</td><td>Para la gasificación de carbógenos de SIF</td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Glostrup pharmacy</td><td>NA</td><td>Fórmula magistral</td></tr><tr><td>Envases de plástico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>536455</td><td></td></tr><tr><td>Fotómetro de placa - Infinite M200</td><td>Tecan</td><td>NA</td><td>Infinite M200 está descatalogado. Un Infinite 200 PRO está disponible en Tecan. Software: SW Magellan v.6.3</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Merck</td><td>P9333</td><td>Para tampón SIF</td></tr><tr><td>Tijera</td><td>Allgaier Instruments</td><td>307-156-170</td><td></td></tr><tr><td>Tijera pequeña</td><td>Allgaier Instruments</td><td>04-520-115</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Merck</td><td>S6014</td><td>Para tampón SIF</td></tr><tr><td>Cloruro de</td> <td>sodioMerck</td><td>S9888</td><td>Para tampón SIF</td></tr><tr><td>Dihidrógeno fosfato de sodio monohidratado</td><td>Merck</td><td>1.06346.1000</td><td>Para tampón SIF</td></tr><tr><td>Gluconato de sodio</td><td>Merck</td><td>S2054</td><td>Para tampón SIF</td></tr><tr><td>Espátula</td><td>Bochem Lab Supply</td><td>3018</td><td></td></tr><tr><td>Tijera</td> de <td>resorte Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Merck</td><td>84097</td><td>para Tampón SIF</td></tr><tr><td>Supercinamaldehído</td><td>Merck</td><td>S3322</td><td></td></tr><tr><td>Tul (telas)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Comprado en la tienda de telas local</td></tr></tbody></table>

ex vivo liberación del péptido relacionado con el gen de la calcitonina del sistema trigémino vascular en roedores

Ex Vivo Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from the Trigeminovascular System in Rodents

El péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) se descubrió por primera vez en la década de 1980 como una variante de empalme del gen de la calcitonina. Desde su descubrimiento, su papel en la fisiopatología de la migraña ha sido bien establecido, primero por sus potentes propiedades vasodilatadoras y posteriormente por su presencia y función como neurotransmisor en el sistema trigémino vascular sensorial. La capacidad de provocar migrañas de CGRP dio apoyo a la industria farmacéutica para desarrollar anticuerpos monoclonales y antagonistas que inhiben el efecto de CGRP. Un nuevo paradigma de tratamiento ha demostrado ser eficaz en el tratamiento profiláctico de la migraña. Una de las herramientas útiles para comprender mejor los mecanismos de la migraña es el modelo ex vivo de liberación de CGRP del sistema trigémino vascular. Es un método relativamente simple que se puede utilizar con diversas herramientas farmacológicas para lograr conocimientos para desarrollar nuevos tratamientos efectivos para la migraña. El presente protocolo describe un modelo de liberación de CGRP y la técnica para cuantificar el efecto de los agentes farmacológicos sobre la cantidad de CGRP liberado por el sistema trigémino vascular en roedores. Se proporciona un procedimiento que describe el enfoque experimental desde la eutanasia hasta la medición de los niveles de proteínas. Se describe en detalle el aislamiento esencial del ganglio trigémino y el núcleo caudal trigémino de ratones y ratas y la preparación de la duramadre de rata. Además, se presentan resultados representativos de ambas especies (ratas y ratones). La técnica es una herramienta clave para investigar los mecanismos moleculares implicados en la fisiopatología de la migraña mediante el uso de diversos compuestos farmacológicos y animales modificados genéticamente.

Esta técnica es una herramienta para investigar los mecanismos moleculares relacionados con CGRP involucrados en la migraña. Tiene la ventaja de evaluar la liberación de CGRP de diferentes niveles del sistema trigémino vascular y se puede aplicar tanto en ratones y ratas de tipo salvaje como transgénicos en combinación con varios compuestos farmacológicos. Aquí se presentan experimentos de concentración-respuesta y bloqueo de ratas y resultados de concentración-respuesta de ratones de tipo salvaje y transgénicos.
El método de liberación de CGRP se utilizó para estudiar el efecto del inhibidor del canal KATP glibenclamida sobre la liberación de CGRP de TG y duramadre en ratas alodinánicas espontáneas del trigémino (STA). Primero, la concentración óptima de capsaicina se encontró utilizando un diseño de estudio de concentración-respuesta. La exposición a la capsaicina indujo una liberación significativa de CGRP de la duramadre y TG en comparación con el vehículo (Figura 5). En la duramadre, la liberación máxima de CGRP se encontró a 1 μM de capsaicina, y en TG, la liberación máxima de CGRP se encontró a 10 μM de capsaicina (Figura 5A-B). Sobre la base de los experimentos de concentración-respuesta, se utilizaron 1 μM de capsaicina y 3 μM de glibenclamida para los experimentos de bloqueo. La glibenclamida no mostró ningún efecto sobre la liberación basal de CGRP de duramadre (P = 0,441) y TG (P = 0,881) cuando se analizó con un ANOVA51 unidireccional. La glibenclamida redujo significativamente la liberación de CGRP inducida por capsaicina en la duramadre en un 40% (P = 0,031) y TG en un 39% (P = 0,003) en comparación con la capsaicina con el vehículo cuando se analizó con un ANOVA unidireccional (Figura 5C-D)51.
En ratones, el protocolo se utilizó para examinar la participación del canal iónico anquirina 1 (TRPA1) potencial receptor transitorio en un modelo de migraña de ratón GTN, donde la hipersensibilidad inducida por GTN dependía completamente de los canales TRPA1. Se encontró que el supercinamaldehído agonista TRPA1 (SCA) libera CGRP de manera dependiente de la dosis del TG con 1 μM, 10 μM y 100 μM de SCA, lo que resulta en un aumento del 9% (P = 0.23), 51% (P = 0.011) y 69% (P = 0.0097) en la liberación de CGRP en comparación con el vehículo, respectivamente cuando se analizó con ANOVA de dos vías. Esta liberación estuvo ausente en TG de ratones nulos Trpa1 donde la exposición a 1 μM, 10 μM y 100 μM de SCA resultó en un cambio del 11% (P &gt; 0.99), -13% (P &gt; 0.99) y 9% (P = 0.97) en la liberación de CGRP en comparación con el vehículo, respectivamente cuando se analizó con ANOVA de dos vías. La estimulación posterior con 10 μM de capsaicina (control positivo) muestra que todas las muestras de tejido podrían liberar CGRP (Figura 6)50.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig01.jpg"> Figura 1: Disección paso a paso de tejido de ratas. Los detalles (A-T) se proporcionan en la sección de protocolo (paso 3.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig02.jpg"> Figura 2: Disección paso a paso del tejido de ratones. Los detalles (A-T) se proporcionan en la sección de protocolo (paso 3.2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig03.jpg"> Figura 3: Lavado e incubación de tejido de roedores. (A-B) Tejido recién aislado en recipientes de plástico con SIF. Los contenedores están cubiertos con tul para permitir un fácil cambio de SIF. (C) Tejido de rata - Dos mitades del cráneo con duramadre que cubre los revestimientos internos del cráneo colocadas en una placa de cultivo de 6 pocillos. El núcleo caudal trigémino derecho e izquierdo en tapas separadas del tubo de microcentrífuga (fila superior de tapas). Los dos ganglios del trigémino en tapas individuales del tubo de microcentrífuga (fila inferior de párpados). (D) Tejido de ratón - El núcleo del trigémino caudalis que contiene parte del tronco encefálico en una tapa separada del tubo de microcentrífuga (parte superior). Dos ganglios del trigémino de ratón están en una tapa del tubo de microcentrífuga (abajo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig04.jpg"> Figura 4: Diseños de estudio para la liberación de CGRP. Tres protocolos diferentes para realizar experimentos de liberación CGRP. Los medicamentos deben diluirse en líquido intersticial sintético (SIF). (A) Estimulación única. (B) Estimulación concentración-respuesta. (C) Inhibición de una estimulación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig05.jpg"> Figura 5: La glibenclamida inhibe la liberación de CGRP inducida por capsaicina de la duramadre de rata y el ganglio trigémino. Los niveles de CGRP del ganglio trigémino y la duramadre aislados de ratas alodinánicas espontáneas del trigémino (STA) hembras (215-318 g) originalmente obtenidas de la Universidad Thomas Jefferson52 se midieron con kits comerciales de EIA CGRP humanos. (A-B) Liberación de CGRP de (A) duramadre y (B) ganglio trigémino después de aumentar las concentraciones de capsaicina (10 nM, 100 nM, 1 μM y 10 μM) (n = 4). Los datos se presentan como puntos individuales y se analizaron con ANOVA bidireccional. p &lt; 0,0001 (C-D) Niveles de CGRP liberados de (C) duramadre y (D) ganglio del trigémino después de 10 min de exposición al vehículo, 3 μM de glibenclamida (glib), 1 μM de capsaicina y 1 μM de capsaicina + 3 μM de glib (n = 6-11). Los datos se presentan como puntos individuales y valores medios y se analizaron con ANOVA unidireccional. *en comparación con el vehículo. #capsaicina en comparación con capsaicina + glib. #P &lt; 0.05, ** y ##P &lt; 0.01, ****P &lt; 0.0001. Los análisis fueron seguidos con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. Se utilizó un nivel significativo de α = 0,05 para todas las pruebas. Esta cifra ha sido modificada de Christensen et al. 51. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig06.jpg"> Figura 6: La exposición a SCA da como resultado la liberación de CGRP dependiente de TRPA1 del ganglio trigémino del ratón. Los niveles de CGRP liberados del ganglio trigémino aislado de WT y Trpa1 nulo (Trpa1tm1/Dpc)53 ratones machos (8-10 semanas) se midieron con kits de EIA CGRP de rata después de la exposición a supercinamaldehído (SCA) a 1 μM, 10 μM y 100 μM y capsaicina a 10 μM como control positivo (n = 6). Los datos de cada ratón se presentan como puntos individuales, y las barras indican los valores medios. Estadística: La comparación entre SCA y vehículo en cada concentración y entre control basal y positivo se realizó con un ANOVA repetido de dos vías. Un nivel significativo de α = 0,05. *P &lt; 0,05, **P &lt; 0,01. Esta cifra ha sido modificada de Christensen et al. 50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El presente protocolo describe el modelo de liberación de péptidos relacionados con el gen de la calcitonina (CGRP) ex vivo y la estrategia para cuantificar el efecto de los agentes farmacológicos sobre la cantidad de CGRP liberada por el sistema trigémino vascular en roedores.

Ex Vivo Liberación del péptido relacionado con el gen de la calcitonina del sistema trigémino vascular en roedores

Calcitonin gene-related peptide (CGRP) was first discovered in the 1980s as a splice variant from the calcitonin gene. Since its discovery, its role in ...

Este método es una herramienta para investigar los mecanismos implicados en la liberación de CGRP del sistema vascular del trigémino. La principal ventaja de este método es la capacidad de dividir el sistema vascular del trigémino en tres sitios diferentes y evaluar la liberación del CGRP dentro de cada sitio distinto. Demostrando el procedimiento seremos yo y Inger Jansen-Olesen, una científica senior de nuestro grupo.Para comenzar, prepare el tejido de rata eliminando la piel y el músculo alrededor de la cabeza y el cuello con tijeras. Luego, use un recortador de huesos y un par de tijeras para separar las mandíbulas inferiores de la cabeza. Ahora exponga la médula espinal y el tronco encefálico insertando un recortador óseo caudalmente en la parte dorsal de las vértebras y retírela.Luego cortar la parte caudal del cráneo por los bordes de los huesos occipital e interparietal para eliminar estas estructuras óseas, exponiendo el cerebelo. Para aislar el TNC que corre caudalmente aproximadamente de 13 a 16 milímetros de la bregma en cada lado, corte la parte dorsolateral del tronco encefálico con tijeras de resorte. Esto es seguido por la inmersión del TNC del lado izquierdo y derecho en SIF.A continuación, corta la cabeza a mitad de la manga para dividir el cráneo en dos usando una sierra. Ahora retire cuidadosamente el cerebro sin tocar la duramadre unida al cráneo con una espátula. Para aislar el TG, córtelo incluyendo sus ramas alrededor de los bordes visuales con la rama mandibular entrando en el foramen oval y las ramas oftálmicas y maxilares entrando en el cráneo.Luego sumerja las mitades del cráneo y los TG en SIF. Para preparar el tejido del ratón, retire la piel y el músculo alrededor de la cabeza y el cuello con tijeras. Ahora exponga la médula espinal y el tronco encefálico insertando un par de tijeras caudalmente en la parte dorsal de las vértebras y retírela.Luego corte la parte caudal del cráneo por los bordes de los huesos occipital e interparietal para eliminar estas estructuras óseas exponiendo el cerebelo. Cortar el hueso parietal midsaggitally y retirar el hueso para exponer el cerebro. Retire con cuidado el cerebelo para exponer el tronco encefálico con una espátula.Aísle el TNC que contiene parte del tronco encefálico con tijeras de resorte, seguido de sumergir el tronco encefálico en SIF. Ahora retire cuidadosamente el cerebro con una espátula y corte el nervio trigémino donde entra en el tronco encefálico. Para aislar el TG, córtelo incluyendo sus ramas alrededor de los bordes visuales con la rama mandibular donde entra en el foramen oval y las ramas oftálmicas y maxilares que entran en el cráneo.A continuación, sumerja los TG en SIF. Para facilitar el intercambio de SIF, agregue una tapa de peaje a los recipientes de plástico y comience a lavar el tejido de rata y ratón en SIF durante 30 minutos reemplazando SIF cada cinco minutos. Después de 30 minutos de lavado a temperatura ambiente, transfiera las mitades TNC de rata y los TG de rata a tapas de tubo de microcentrífuga separadas con 350 microlitros de SIF.Transfiera el tronco encefálico del ratón con TNC a una tapa de tubo de microcentrífuga con 250 microlitros de SIF. Finalmente, transfiera los dos TG de ratón a una tapa de tubo de microcentrífuga con 250 microlitros de SIF. Coloque las mitades del cráneo de rata en una placa de cultivo de seis pocillos y llene el cráneo con 400 microlitros de SIF.Coloque cráneos de ratas en tapas de tubos de microcentrífuga con tejido de rata y ratón en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados. Reemplace SIF con una pipeta cada cinco minutos durante 20 minutos sin tocar el tejido. Prepare tubos de microcentrífuga para la recolección de muestras mediante el etiquetado apropiado.Luego agregue 50 microlitros de tampón EIA de 10 resistencia a cada tubo de microcentrífuga. A continuación, prepare la solución compuesta de ensayo y la solución del vehículo diluyendo en SIF para todas las concentraciones. Después del último lavado, agregue 250 microlitros de SIF a TG y TNC de ratón, 350 microlitros de SIF a TG y TNC de rata, y 400 microlitros de SIF a cada cráneo de rata.Después de 10 minutos de incubación, recoja 200 microlitros de la muestra en un tubo de microcentrífuga premarcado con 50 microlitros de tampón EIA de 10 resistencias para permitir la medición de la liberación basal de CGRP. Deseche el líquido restante y almacene inmediatamente las muestras a menos 20 grados centígrados. Añadir el compuesto de ensayo en el vehículo correspondiente en concentraciones crecientes, comenzando con la concentración más baja, e incubar durante 10 minutos.Después de 10 minutos de incubación, recoja 200 microlitros de la muestra en un tubo de microcentrífuga preetiquetado con 50 microlitros de tampón EIA de 10 fuerzas. Deseche el líquido restante y agregue la segunda concentración más baja al tejido. Almacene inmediatamente las muestras a menos 20 grados centígrados y repita este procedimiento con la concentración restante.Para realizar un control positivo para el experimento, agregue el control positivo al tejido al final del protocolo. Después de un período de incubación de 10 minutos, recoja una muestra de 200 microlitros en un tubo de microcentrífuga con 50 microlitros de tampón EIA de 10 fuerzas. Las concentraciones de CGRP liberadas en las muestras recolectadas se miden utilizando un kit EIA mientras se siguen las instrucciones del fabricante proporcionadas con el kit EIA.En la rata, la exposición a la capsaicina indujo una liberación significativa de CGRP de la duramadre y TG en comparación con el vehículo. En la duramadre, la liberación máxima de CGRP se encontró en un micromolar de capsaicina. Y en TG, la liberación máxima de CGRP se encontró en 10 micromolares de capsaicina.Cuando se analiza con un ANOVA unidireccional, la glibenclamida no muestra ningún efecto sobre la liberación basal de CGRP de la duramadre y la TG. La glibenclamida redujo significativamente la liberación de CGRP inducida por capsaicina en la duramadre en un 40% y la TG en un 39% en comparación con la capsaicina con el vehículo cuando se analizó con un ANOVA unidireccional. Se encontró que el potencial transitorio del receptor Ankyrin-1 agonista super cinamaldehído libera CGRP de una manera dependiente de la concentración del TG con 1, 10 y 100 micromolares de súper cinamaldehído, lo que resulta en un aumento del 9% 52% y 69% en la liberación de CGRP en comparación con el vehículo, respectivamente, cuando se analizó con ANOVA de dos vías. El aumento de la liberación de CGRP estuvo ausente en TG del potencial transitorio del receptor Ankyrin-1 knockout ratones donde la exposición a 1, 10 y 100 micromolares de súper cinamaldehído resultó en 11% menos 13% y 9% de cambio en la liberación de CGRP en comparación con el vehículo, respectivamente, cuando se analizó con ANOVA de dos vías.Es importante tener cuidado de no tocar el tejido durante la recolección de muestras y ser preciso al cronometrar el tiempo de incubación para todas las muestras. Si se dispone de kits ELISA adecuados, es posible aplicar este procedimiento para medir la liberación de otros péptidos presentes en el sistema vascular del trigémino.

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Fuente: Shannonhouse, J., et al. Imágenes de calcio in vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios de raíz dorsal intactos. J. Vis. Exp. (2023). El video muestra una técnica de imagen de calcio in vivo para monitorear la actividad neuronal en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) de un ratón transgénico. Las neuronas DRG expresan un indicador de calcio que aumenta la intensidad de la fluorescencia al unirse al calcio. Los estímulos...

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