Ex Vivo Liberación del péptido relacionado con el gen de la calcitonina del sistema trigémino vascular en roedores

El presente protocolo describe el modelo de liberación de péptidos relacionados con el gen de la calcitonina (CGRP) ex vivo y la estrategia para cuantificar el efecto de los agentes farmacológicos sobre la cantidad de CGRP liberada por el sistema trigémino vascular en roedores.

Este método es una herramienta para investigar los mecanismos implicados en la liberación de CGRP del sistema vascular del trigémino. La principal ventaja de este método es la capacidad de dividir el sistema vascular del trigémino en tres sitios diferentes y evaluar la liberación del CGRP dentro de cada sitio distinto. Demostrando el procedimiento seremos yo y Inger Jansen-Olesen, una científica senior de nuestro grupo.

Para comenzar, prepare el tejido de rata eliminando la piel y el músculo alrededor de la cabeza y el cuello con tijeras. Luego, use un recortador de huesos y un par de tijeras para separar las mandíbulas inferiores de la cabeza. Ahora exponga la médula espinal y el tronco encefálico insertando un recortador óseo caudalmente en la parte dorsal de las vértebras y retírela.

Luego cortar la parte caudal del cráneo por los bordes de los huesos occipital e interparietal para eliminar estas estructuras óseas, exponiendo el cerebelo. Para aislar el TNC que corre caudalmente aproximadamente de 13 a 16 milímetros de la bregma en cada lado, corte la parte dorsolateral del tronco encefálico con tijeras de resorte. Esto es seguido por la inmersión del TNC del lado izquierdo y derecho en SIF.

A continuación, corta la cabeza a mitad de la manga para dividir el cráneo en dos usando una sierra. Ahora retire cuidadosamente el cerebro sin tocar la duramadre unida al cráneo con una espátula. Para aislar el TG, córtelo incluyendo sus ramas alrededor de los bordes visuales con la rama mandibular entrando en el foramen oval y las ramas oftálmicas y maxilares entrando en el cráneo.

Luego sumerja las mitades del cráneo y los TG en SIF. Para preparar el tejido del ratón, retire la piel y el músculo alrededor de la cabeza y el cuello con tijeras. Ahora exponga la médula espinal y el tronco encefálico insertando un par de tijeras caudalmente en la parte dorsal de las vértebras y retírela.

Luego corte la parte caudal del cráneo por los bordes de los huesos occipital e interparietal para eliminar estas estructuras óseas exponiendo el cerebelo. Cortar el hueso parietal midsaggitally y retirar el hueso para exponer el cerebro. Retire con cuidado el cerebelo para exponer el tronco encefálico con una espátula.

Aísle el TNC que contiene parte del tronco encefálico con tijeras de resorte, seguido de sumergir el tronco encefálico en SIF. Ahora retire cuidadosamente el cerebro con una espátula y corte el nervio trigémino donde entra en el tronco encefálico. Para aislar el TG, córtelo incluyendo sus ramas alrededor de los bordes visuales con la rama mandibular donde entra en el foramen oval y las ramas oftálmicas y maxilares que entran en el cráneo.

A continuación, sumerja los TG en SIF. Para facilitar el intercambio de SIF, agregue una tapa de peaje a los recipientes de plástico y comience a lavar el tejido de rata y ratón en SIF durante 30 minutos reemplazando SIF cada cinco minutos. Después de 30 minutos de lavado a temperatura ambiente, transfiera las mitades TNC de rata y los TG de rata a tapas de tubo de microcentrífuga separadas con 350 microlitros de SIF.

Transfiera el tronco encefálico del ratón con TNC a una tapa de tubo de microcentrífuga con 250 microlitros de SIF. Finalmente, transfiera los dos TG de ratón a una tapa de tubo de microcentrífuga con 250 microlitros de SIF. Coloque las mitades del cráneo de rata en una placa de cultivo de seis pocillos y llene el cráneo con 400 microlitros de SIF.

Coloque cráneos de ratas en tapas de tubos de microcentrífuga con tejido de rata y ratón en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados. Reemplace SIF con una pipeta cada cinco minutos durante 20 minutos sin tocar el tejido. Prepare tubos de microcentrífuga para la recolección de muestras mediante el etiquetado apropiado.

Luego agregue 50 microlitros de tampón EIA de 10 resistencia a cada tubo de microcentrífuga. A continuación, prepare la solución compuesta de ensayo y la solución del vehículo diluyendo en SIF para todas las concentraciones. Después del último lavado, agregue 250 microlitros de SIF a TG y TNC de ratón, 350 microlitros de SIF a TG y TNC de rata, y 400 microlitros de SIF a cada cráneo de rata.

Después de 10 minutos de incubación, recoja 200 microlitros de la muestra en un tubo de microcentrífuga premarcado con 50 microlitros de tampón EIA de 10 resistencias para permitir la medición de la liberación basal de CGRP. Deseche el líquido restante y almacene inmediatamente las muestras a menos 20 grados centígrados. Añadir el compuesto de ensayo en el vehículo correspondiente en concentraciones crecientes, comenzando con la concentración más baja, e incubar durante 10 minutos.

Después de 10 minutos de incubación, recoja 200 microlitros de la muestra en un tubo de microcentrífuga preetiquetado con 50 microlitros de tampón EIA de 10 fuerzas. Deseche el líquido restante y agregue la segunda concentración más baja al tejido. Almacene inmediatamente las muestras a menos 20 grados centígrados y repita este procedimiento con la concentración restante.

Para realizar un control positivo para el experimento, agregue el control positivo al tejido al final del protocolo. Después de un período de incubación de 10 minutos, recoja una muestra de 200 microlitros en un tubo de microcentrífuga con 50 microlitros de tampón EIA de 10 fuerzas. Las concentraciones de CGRP liberadas en las muestras recolectadas se miden utilizando un kit EIA mientras se siguen las instrucciones del fabricante proporcionadas con el kit EIA.

En la rata, la exposición a la capsaicina indujo una liberación significativa de CGRP de la duramadre y TG en comparación con el vehículo. En la duramadre, la liberación máxima de CGRP se encontró en un micromolar de capsaicina. Y en TG, la liberación máxima de CGRP se encontró en 10 micromolares de capsaicina.

Cuando se analiza con un ANOVA unidireccional, la glibenclamida no muestra ningún efecto sobre la liberación basal de CGRP de la duramadre y la TG. La glibenclamida redujo significativamente la liberación de CGRP inducida por capsaicina en la duramadre en un 40% y la TG en un 39% en comparación con la capsaicina con el vehículo cuando se analizó con un ANOVA unidireccional. Se encontró que el potencial transitorio del receptor Ankyrin-1 agonista super cinamaldehído libera CGRP de una manera dependiente de la concentración del TG con 1, 10 y 100 micromolares de súper cinamaldehído, lo que resulta en un aumento del 9% 52% y 69% en la liberación de CGRP en comparación con el vehículo, respectivamente, cuando se analizó con ANOVA de dos vías. El aumento de la liberación de CGRP estuvo ausente en TG del potencial transitorio del receptor Ankyrin-1 knockout ratones donde la exposición a 1, 10 y 100 micromolares de súper cinamaldehído resultó en 11% menos 13% y 9% de cambio en la liberación de CGRP en comparación con el vehículo, respectivamente, cuando se analizó con ANOVA de dos vías.

Es importante tener cuidado de no tocar el tejido durante la recolección de muestras y ser preciso al cronometrar el tiempo de incubación para todas las muestras. Si se dispone de kits ELISA adecuados, es posible aplicar este procedimiento para medir la liberación de otros péptidos presentes en el sistema vascular del trigémino.