Name: Lipidómica de escopeta de tejidos de roedores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Aprende lipidómica de escopeta para cuantificar más de 400 lípidos en tejidos de roedores. Este método rápido permite identificar biomarcadores de toxicidad temprana y estudiar mecanismos lipídicos.

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Los autores desean agradecer al equipo de estudio y reconocer especialmente la asistencia técnica y el apoyo de los equipos de bioinvestigación y aerosoles de PMI R&D, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., Singapur, y PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, Suiza. Los autores agradecen a Sam Ansari por gestionar el biobanco y agradecen el apoyo de Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy por editar un borrador del manuscrito.

Todos los autores son empleados de Philip Morris International. Philip Morris International es la única fuente de financiación y patrocinador de este proyecto.

El humo del cigarrillo (SC) es reconocido como un principal factor de riesgo asociado al desarrollo de enfermedades inflamatorias crónicas del pulmón, incluyendo carcinoma pulmonar, bronquitis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)1. Más allá del impacto pulmonar, la exposición al SC juega un papel significativo en el desarrollo de otras enfermedades como la enfermedad arterial coronaria aterosclerótica y la enfermedad vascular periférica1. Las enfermedades cardiovasculares, junto con la EPOC, son la primera y tercera causa de muerte en todo el mundo, respectivamente. Los enfoques de evaluación del riesgo toxicológico se han basado históricamente en el uso de modelos animales como los roedores. Los modelos in vivo de ratas y ratones de cuerpo completo o solo nariz se usan comúnmente para estudiar los efectos a largo plazo de la exposición al CS.
Por ejemplo, generalmente, 6 meses de exposición al humo inducen anomalías histológicas y funcionales en los pulmones murinos que imitan a los de la enfermedad humana, incluyendo enfisema, remodelación de las vías respiratorias e hipertensión pulmonar, aunque los cambios son relativamente leves en comparación con los observados en fumadores humanos a largo plazo2. Tanto en tejidos animales como humanos, los estudios han observado una amplia gama de cambios moleculares en respuesta a la exposición a la CS, incluyendo respuestas al estrés oxidativo, inflamación y cambios estructurales en los tejidos 3,4. No es sorprendente que la exposición a SC también haya sido reportada para tener un impacto de gran alcance en el lipidoma pulmonar, incluyendo efectos sobre los lípidos surfactantes, mediadores de señalización lipídica y lípidos estructurales 4,5,6.
Para caracterizar los cambios lipídicos masivos inducidos por la exposición a largo plazo a SC de los pulmones de ratón, realizamos un análisis de espectrometría de masas de infusión directa rápida y cuantitativa. Después de la introducción del método lipidómico de escopeta en 20057, este método se ha utilizado eficazmente para ampliar nuestro conocimiento sobre el metabolismo celular lipídico 8,9,10 en sistemas modelo como la levadura 11, Caenorhabditis elegans12 y Drosophila melanogaster13, así como en una amplia gama de tipos de muestras de mamíferos como las líneas celulares 14, 15,16 varios humanos17,18 y tejidos de roedores19,20 y fluidos corporales21,22.
En las últimas décadas, los estudios han revelado la complejidad de las respuestas celulares a los cambios ambientales, involucrando miles de proteínas, lípidos y metabolitos interconectados. Esto ha dejado claro que el uso de técnicas analíticas de vanguardia es esencial para obtener una visión en profundidad de las maquinarias moleculares y para descubrir la magnitud total de los impactos fisiológicos exógenos. En este contexto, las huellas dactilares lipídicas exhaustivas y cuantitativas producidas por los enfoques lipidómicos de escopeta pueden aumentar efectivamente nuestro conocimiento sobre el metabolismo celular lipídico 8,9,10.
Con respecto a la exposición a la CS como factor de riesgo para varias enfermedades, los enfoques de evaluación del riesgo toxicológico se han basado históricamente en el uso de modelos animales como los roedores. Shotgun lipidomics MS proporciona una herramienta analítica rápida, sensible y cuantitativa para evaluar la perturbación del lipidoma en numerosos tipos de muestras. La característica única de la lipidómica de escopeta es el análisis automatizado de inyección directa de un extracto lipídico total, enriquecido con estándares internos marcados, sin separación cromatográfica en un instrumento de EM de alta resolución mediante el uso de un nanochip conductor que genera un nanospray de ionización por electrospray (ESI)23.
La información de la relación masa-carga que se adquiere simultáneamente en el modo MS1 proporciona la huella lipídica total de todos los lípidos endógenos intactos. Opcionalmente, el modo MS2/MS3, en el que las moléculas lipídicas originales se fragmentan y analizan, proporciona información estructural adicional. El análisis de datos requiere un software especializado e incluye la deconvolución de espectros y asignaciones de picos en espectros agrupados que conducen a la identificación de lípidos y la elucidación putativa de la estructura química. Además, la cuantificación absoluta se puede realizar mediante la introducción de una mezcla de patrones internos etiquetados que contenga al menos un patrón lipídico por clase de lípidos de interés. En general, con la técnica actual, el análisis de EM que toma unos minutos por muestra puede cubrir la identificación y cuantificación de hasta 800 lípidos de 14 clases de lípidos24 en tejidos de roedores.

<table><tbody><tr><td>Tubos autoblocantes de 1, 5 y 2 ml</td><td>Eppendorf 30120086</td><td>, 30120094</td><td></td></tr><tr><td>perlas de acero inoxidable de 3 mm</td><td>Qiagen</td><td>69997</td><td></td></tr><tr><td>4.1 y micro; m chip de boquilla</td><td>Advion</td><td>HD-D-384</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>45754-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amonio</td><td>Honeywell</td><td>14267-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830-500G</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina estándar, 2 mg/mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>&nbsp; 23209</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Honeywell</td><td>33065-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650498-1L</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Honeywell</td><td>34856-1L</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de etilo</td><td>Honeywell</td><td>33211</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR Placas de 96 pocillos</td><td>Sigma</td><td>M9686</td><td></td></tr><tr><td>Heptano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34873-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A461</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456</td><td></td></tr><tr><td>Plasma agrupado para ratones</td><td>BioIvt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratón Estándar SPLASH</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>330710X</td><td>Estándar interno</td></tr><tr><td>Nunc 96 Placas transparentes de pozo de fondo plano</td><td>VWR</td><td>62409-068</td><td></td></tr><tr><td>Espátula de plástico</td><td>Sigma</td><td>Z560049-300EA</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bradford 1x Reactivo de colorante</td><td>BioRad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>Diluyente de suero</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5197</td><td></td></tr><tr><td>Equipo/software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoPrep CP02 instrumento de impacto</td><td>Covaris</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Martillo magnético</td></tr><tr><td>Centrífuga 5427R</td><td>Eppendorf</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>centrífuga</td></tr><tr><td>ChipSoft 8.3</td><td>Advion Biosciences</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Software para configurar el método y la adquisición en el robot Triversa nanomate</td></tr><tr><td>LipidXplorer 1.2.8.1</td><td>N/A</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Software para identificar lípidos</td></tr><tr><td>Pico por pico</td><td>SpectroSwiss</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Software para convertir datos .raw de MS a formato .mzml</td></tr><tr><td>ProteoWizard</td><td>ProteoWizard</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Software alternativo (código abierto) para convertir .raw datos de MS a formato .mzml</td></tr><tr><td>Q-Exactive MS</td><td>Thermo Fisher</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Espectrómetro de masas orbitrap de alta resolución</td></tr><tr><td>Lisador de tejidos Qiagen II</td><td>Qiagen</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Lisador de tejidos</td></tr><tr><td>SpeedVac SPD140DDA</td><td>Thermo Fisher</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Concentrador de vacío</td></tr><tr><td>Tecan Infinite M nano plus</td><td>Tecan</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Lector de placas</td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Termomezclador</td></tr><tr><td>TriVersa Nanomate</td><td>Advion Biosciences</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Nanofuente de infusión directa</td></tr><tr><td>Xcalibur 4.3</td><td>Thermo Scientific</td><td>.&nbsp; &nbsp;</td><td>Software para configurar el método y la adquisición en el Q-Exactive MS</td></tr></tbody></table>

lipidómica de escopeta de tejidos de roedores

Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

Los lípidos juegan un papel vital como componentes esenciales de todas las células procariotas y eucariotas. Las constantes mejoras tecnológicas en la espectrometría de masas han hecho de la lipidómica una poderosa herramienta analítica para monitorear las composiciones de lipidomas tisulares en estados homeostáticos y de enfermedad. Este documento presenta un protocolo paso a paso para un método de análisis de lípidos de escopeta que admite la detección y cuantificación simultáneas de unos pocos cientos de especies de lípidos moleculares en diferentes muestras de tejidos y biofluidos a alto rendimiento. Este método aprovecha la inyección directa automatizada de nanoflujo de un extracto lipídico total enriquecido con estándares internos marcados sin separación cromatográfica en un instrumento de espectrometría de masas de alta resolución. A partir de cantidades inferiores a microgramos de tejido de roedores, el análisis de EM toma 10 minutos por muestra y cubre hasta 400 lípidos de 14 clases de lípidos en tejido pulmonar de ratón. El método presentado aquí es muy adecuado para estudiar los mecanismos de la enfermedad e identificar y cuantificar biomarcadores que indican toxicidad temprana o efectos beneficiosos dentro de los tejidos de roedores.

Aquí, como resultados representativos, presentamos datos que ilustran cómo se puede utilizar la lipidómica de escopeta para estudiar los efectos del SC en los pulmones de ratones. El protocolo de análisis de lípidos de escopeta se aplicó con éxito para un estudio in vivo para el análisis comparativo de dos grupos de muestras: tejidos pulmonares disecados de nueve ratones hembra Apoe−/− expuestos a SC (grupo 3R4F; control positivo) y un número igual de ratones mantenidos en condiciones de aire fresco (grupo simulado) como control negativo recogido a los 3 meses, Puntos de tiempo de exposición de 4 meses y 6 meses. Los animales se mantuvieron bajo aire fresco filtrado y acondicionado a 22 °C ± 2 °C de temperatura y 55% ± 15% de humedad y se alimentaron con una dieta de pellets irradiados con rayos gamma. El régimen de luz se mantuvo a las 12 h por día. Se alojaron hasta ocho ratones por cada jaula. Los cigarrillos de referencia 3R4F para el tratamiento de exposición se compraron a la Universidad de Kentucky para generar el aerosol 3R4F CS (600 μg de partículas totales de aerosol TPM / L) para una concentración de exposición objetivo equivalente a 28 μg de nicotina / L.CS el humo de los cigarrillos 3R4F se produjo utilizando máquinas de fumar rotativas de 30 puertos según Phillips et al.27 . Según el Protocolo de Tabaquismo Intensivo de Health Canada, se aplicaron 55 ml de volumen de inhalación, una inhalación por cada 30 s y un bloqueo del 100% de los orificios de ventilación a los cigarrillos 3R4F para proporcionar una exposición suficiente. Todos los detalles adicionales sobre el diseño del estudio han sido reportados previamente27,28.
En general, se identificaron y cuantificaron ~ 400 especies de lípidos moleculares de las 14 clases de lípidos más abundantes (Figura 3). La concentración total normalizada de lípidos por clase fue ligeramente elevada para las clases de lípidos PE, PEO, PC, PCO, PI y PG, y se observó cierta regulación a la baja para los lípidos SM, LPE y PA (Figura 3A), mientras que no se observaron diferencias para TAGs y PS. Curiosamente, se han reportado niveles elevados de PCO y lípidos plasmalógenos PEO en el grupo CS en células inflamatorias29 . Una de las funciones intracelulares de los lípidos plasmalógenos es la actividad antioxidante. Bajo exposición a especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno (RNS), se reportó oxidación selectiva de plasmalógenos en comparación con fosfolípidos diacil30. El enlace enil-éter en la estructura química de los plasmalógenos es sensible al ataque radical sobre el estrés oxidativo31. Los principales productos del ataque radical son ácidos eicosatetraenoicos hidroxilados, fosfolípidos de 2-monoacilglicerol, pentadecanol, ácidos fórmicos, α-hidroxialdehídos de varias longitudes de cadena, 1-formil-2-araquidonoilglicerofosfolípido y lisofosfolípidos.
Estos resultados muestran que, entre las características moleculares basadas en la fórmula molecular total, 100-120 compuestos se vieron significativamente afectados por la exposición a CS (Figura 3D). La deconvolución detallada de la información de fragmentación MS2 y la normalización de las intensidades de señal del fragmento permitieron la definición aproximada de la cantidad total de cada ácido graso conjugado (FA) representado en cada clase lipídica (Figura 3E) y la comparación de estos datos entre los grupos expuestos y control. Se observó una clara disminución tanto en los FA completamente saturados como en los que tienen solo unas pocas insaturaciones, principalmente en el contexto de los lisolípidos. En contraste, los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) en la composición de las clases de fosfolípidos PC, PE y PG se elevaron en el grupo CS para todos los puntos temporales. Los casos extremos de PC y PG conjugados con eicosapentanoico (EPA) y ácido docosahexaenoico (DHA) se detectaron exclusivamente en el grupo de exposición a 3R4F CS (Figura 3E, color rojo).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig01.jpg"> Figura 1: Diseño de la placa para la distribución de muestras en el ensayo de Bradford. Las muestras en blanco y estándar se colocan por triplicado en las columnas 1-3; Las muestras desconocidas se colocan por duplicado en las columnas 4-11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig02.jpg"> Figura 2: Diseño de placas de la placa de microtitulación de 96 pocillos para análisis de espectrometría de masas de escopeta. La distribución de muestras en blanco, estándar, desconocidas y de control de calidad para su adquisición en el modo de ionización positiva se mapea en el lado izquierdo de la placa (columnas 1-6); Todas las muestras para el modo de ionización negativa se colocan a la derecha (columnas 7-12). Abreviaturas: pos = positivo; QC = control de calidad; neg = negativo; TB = total en blanco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig03.jpg"> Figura 3: Análisis lipidómico de escopeta de pulmones de ratón expuestos al humo del cigarrillo. Los ratones Apoe−/− fueron expuestos a CS del cigarrillo de referencia 3R4F o aire fresco (simulado). A) Concentraciones de clase lipídica y número de especies lipídicas por clase. Para cada clase, el número de especies lipídicas cuantificadas se indica entre paréntesis. Media e intervalos de confianza del 95% para cada clase de lípidos, por separado para cada tipo de exposición (agregados a lo largo de tres puntos temporales). (B) Gráficos de volcanes que muestran el tamaño del efecto (cambio log2 veces) y la significación (-log10 valor p ajustado por FDR) de las especies lipídicas cuantificadas para la comparación 3R4F CS versus simulada en los tres puntos temporales. Los lípidos significativamente elevados están marcados en amarillo; Los lípidos significativamente disminuidos se marcan en cian (valor de p ajustado por FDR &lt; 0,05). (C) Abundancia diferencial de las 25 especies lipídicas con los mayores cambios absolutos medios en el pliegue. Los cambios en el pliegue log2 para la comparación 3R4F CS versus simulado están codificados por colores, y se indica significación estadística: *: valor de p ajustado por FDR &lt; 0.01; X: El valor de p ajustado por FDR &lt; 0,05. (D) Gráficos de comparación. Los coeficientes de correlación para las comparaciones de cambio de pliegue están codificados por colores, y se indica el número de lípidos diferencialmente abundantes compartidos (números totales en los márgenes). Los gráficos circulares muestran el porcentaje de lípidos diferencialmente abundantes compartidos con la misma dirección de cambio (signo FC). El asterisco indica una superposición significativa de los lípidos diferencialmente abundantes. (E) Abundancia diferencial de AF conjugados por clase lipídica. Mapa de calor como en el panel C para ácidos grasos conjugados con diferencias significativas de abundancia entre 3R4F y exposición simulada en los tres puntos de tiempo (valor de p ajustado por FDR &lt; 0.05). La cantidad de cada ácido graso por clase lipídica se estimó en función de las intensidades MS2 de los fragmentos de ácidos grasos. Abreviaturas: CS = humo de cigarrillo; FDR = tasa de descubrimiento falso; FC = cambio de pliegue; FA = ácidos grasos; PC = fosfatidilcolina; PS = fosfatidilserina; TAG = triacilglicerol; SM = esfingomielina; PEO = fosfatidiletanolamina plasmalógena; PE = fosfatidiletanolamina; PG = fosfatidilglicerol; IP = fosfatidilinositol; DAG = diacilglicerol; SE = ésteres de esteroles/colesterilos; PCO = fosfatidilcolina plasmalógena; LPC = liso fosfatidilcolina; LPE = liso fosfatidiletanolamina; PA = ácido fosfatídico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Concentración final de BSA (mg/ml)</td>
			<td>Solución de BSA a 2 mg/ml (μL)</td>
			<td>Tampón bicarbonato de amonio (μL)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>62.5</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>25</td>
			<td>75</td>
		</tr><tr><td>0.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>87.5</td>
		</tr><tr><td>0.125</td>
			<td>12.5</td>
			<td>187.5</td>
		</tr><tr><td>0.0625</td>
			<td>50 de solución de 0,125 mg/ml</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Esquema de dilución del patrón interno BSA para la curva de calibración para el ensayo Bradford. Abreviatura: BSA = albúmina sérica bovina.
Información complementaria: Archivos MFQL utilizados para la identificación de lípidos LipidXplorer. El paquete .zip consta de los archivos MFQL individuales requeridos, cada uno nombrado siguiendo este patrón: <abreviatura de clase lip>_<modo de ionizaci>_MS2.mfql (por ejemplo, PE_neg_MS2.mfql). Los nombres de archivo para la identificación estándar interna etiquetada incluyen la etiqueta D7(D9) en la <abreviatura lip> (por ejemplo, PED7_neg_MS2.mfql). Estos archivos MFQL se utilizan para verificar la cantidad de deuterio en el estándar interno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/-_Supplementary%20Information%20JoVE%20Review.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a></abreviatura></modo></abreviatura>

La lipidómica basada en espectrometría de masas de escopeta ofrece una instantánea cuantitativa sensible de un amplio espectro de clases de lípidos simultáneamente en una sola medición de varios tejidos de roedores.

Lipidómica de escopeta de tejidos de roedores

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

El protocolo presentado permite cuantificar una amplia gama de lípidos en tejido animal. Es una herramienta fácil para estudiar los mecanismos lipídicos y también para identificar biomarcadores que indican toxicidad temprana en modelos animales. El método ofrece un perfil cuantitativo de más de 400 lípidos moleculares en 14 clases diferentes de lípidos en una amplia variedad de matrices de muestra con un tiempo de tendencia de 10 minutos por muestra.Para comenzar, diluir la centrífuga alícuota 1 sobrenadante dos veces la concentración con tampón de bicarbonato de amonio. Después de preparar la curva estándar de albúmina sérica bovina, haga un vórtice de los tubos estándar y centrifugue los tubos a 18, 200 g durante 15 segundos a temperatura ambiente. De los tubos estándar preparados previamente, transfiera 6 microlitros cada uno de los espacios en blanco, los estándares y las muestras a una placa de fondo plano de 96 pocillos.A continuación, agregue 250 microlitros del reactivo Bradford a cada pocillo usando una pipeta multicanal y mezcle. Después de incubar durante 5 minutos, mida la absorbancia a una longitud de onda de 595 nanómetros utilizando un lector de placas. Prepare tubos de 2 mililitros con 100 microlitros de solución de bicarbonato de amonio en cada tubo del blanco total en blanco y del blanco estándar interno y mantenga todas las muestras en hielo.Preparar muestras de control de calidad, considerando que se coloca una muestra de control de calidad entre cada conjunto de 10 muestras. Agregue 10 microlitros de plasma humano agrupado a tubos de 2 mililitros, luego ingrese 10 microlitros de solución estándar interna en todas las muestras de estudio y control de calidad y en blanco estándar interno. Agregue 300 microlitros de mezcla de metanol butanol a menos 20 grados centígrados a cada muestra y agite a 450 g durante 10 minutos a temperatura ambiente en el termomezclador.A continuación, agregue 300 microlitros de mezcla de acetato de etilo de heptano y agite a 450 g durante 10 minutos a temperatura ambiente en el termomezclador, luego agregue 300 microlitros de mezcla de ácido ascético al 1% y agite durante 5 minutos a 450 g a temperatura ambiente en el termomezclador. Centrifugar a 2, 800 g durante 5 minutos a temperatura ambiente y transferir 360 microlitros de la fase superior a un nuevo tubo autoblocante de 2 mililitros etiquetado como 2. Después de agregar 320 microlitros de acetato de etilo de heptano al tubo de fase acuosa etiquetado como 1, agitar a 450 g durante 5 minutos a temperatura ambiente en el termomezclador, luego centrifugar a 2, 800 g durante 5 minutos a temperatura ambiente como se demostró anteriormente.Transfiera 320 microlitros de la fase superior y combínelos con la fracción del paso anterior en el tubo 2. Del mismo modo, agregue 250 microlitros de acetato de etilo de heptano a la fase acuosa en el tubo 1 y agite a 450 g durante 5 minutos a temperatura ambiente en el termomezclador. Nuevamente, centrifugar a 2, 800 g durante 5 minutos a temperatura ambiente, luego transferir 200 microlitros de la fase superior y combinarlo con las fracciones de los pasos anteriores en el tubo 2.Evaporar a sequedad a 35 grados centígrados en un concentrador de vacío y volver a disolver en 300 microlitros de solución de mezcla MS. Vortex cada tubo durante 5 segundos para asegurarse de que todo se disuelva y centrifugar a 18, 200 g durante 5 minutos a 4 grados centígrados. Transfiera una alícuota de 50 microlitros a la placa de microlitros para el análisis del modo de ionización positiva y diluya con 50 microlitros de solución de mezcla MS.Nuevamente, diluya con 80 microlitros de mezcla MS y transfiera una alícuota de 20 microlitros a la placa MTP para el análisis del modo de ionización negativa. Envuelva la placa con papel de aluminio y manténgala a 4 grados centígrados antes del análisis. Calibre un MS tanto en modo positivo como negativo de acuerdo con las instrucciones del fabricante 5 días o menos antes del análisis.Instale la nanofuente de infusión directa por adelantado, asegurándose de que esté correctamente alineada contra el capilar de transferencia del MS y un chip de boquilla de 4.1 micrómetros en el soporte del chip, luego verifique los parámetros de infusión positiva y negativa correspondientes a una presión de gas de 1.25 psi, voltaje de fuente de 1.1 kilovoltios, 5 microlitros de volumen de inyección de muestra, cierre de contacto de salida Rel1 durante 2,5 segundos, 5 minutos de tiempo de entrega, enfriamiento de la placa a 4 grados centígrados, luego configure el controlador de temperatura y cree una nueva placa. Para el modo positivo, verifique y ajuste el software que el método MS esté configurado con una temperatura capilar de 250 grados centígrados y el nivel de RF de la lente S a 65.0. En el software Xcalibur, abra el método positivo y verifique que la adquisición de MS de escaneo completo esté configurada de cero a 1 minuto en el rango de 550 a 1, 000 m / z a una resolución de 140, 000 con control de ganancia automatizado de 1 millón y tiempo máximo de inyección de 50 milisegundos.Aplique una masa de bloqueo de 680.48022. Compruebe que el método de adquisición MS/MS independiente de los datos está configurado entre el intervalo de tiempo de 1 y 5 minutos a una resolución de 17.500 con una primera masa fija de 250 m/z. Compruebe que el control de ganancia automatizado para MS2 esté configurado en 100, 000 y un tiempo máximo de inyección en 64 milisegundos, una energía de colisión de 20 NCE, la ventana de aislamiento a 1 m / z y que se use una lista de masa de inclusión de 398 a 1, 100 m / z con un paso de masa de 1 Dalton.Para la adquisición en modo negativo, compruebe en el software de ajuste que el método MS está configurado con la temperatura capilar a 250 grados centígrados en el nivel de RF de lente S a 65.0 en el archivo de sintonización MS. A continuación, en el software Xcalibur, verifique que el modo de adquisición de escaneo completo esté configurado de cero a 1 minuto con una resolución de 140, 000 que cubra el rango de 400 a 940 m / z, control de ganancia automatizado de 1 millón, tiempo máximo de inyección de 200 milisegundos y una masa de bloqueo de 526.46262. Compruebe que la adquisición MS2 en modo DIA se configura entre 1 y 5 minutos de la carrera a una resolución de 17.500 con una primera masa fija de 150 m/z, control de ganancia automatizado de 100.000, 64 milisegundos de tiempo máximo de inyección y 35 NCE de energía de colisión utilizando la lista de masas de inclusión de 400 a 940 con un paso de masa de 1 Dalton.Cree la cola de secuencia de análisis en el software Xcalibur en modo positivo y actívelo, luego cree la secuencia en el software ChipSoft e inicie el análisis mientras espera que la adquisición de la muestra se active mediante una señal de cierre de contacto proveniente del robot de infusión directa para cada muestra. Cuando se complete el análisis de modo positivo, cree la cola de secuencia de análisis en el software Xcalibur en modo negativo y actívelo, luego cree la secuencia en el software ChipSoft e inicie el análisis mientras espera que la adquisición de la muestra se active mediante una señal de cierre de contacto proveniente del robot de infusión directa para cada muestra. Se identificó y cuantificó la concentración total normalizada de lípidos a partir de las 14 clases de lípidos más abundantes, que fue ligeramente elevada para las clases de lípidos PE, PEO, PC, PCO, PI y PG y se observó cierta regulación a la baja para los lípidos SM, LPE y PA.Si bien no se pudo ver ninguna diferencia para TAGs y PS. Estos resultados también muestran que, entre las características moleculares basadas en la fórmula molecular total, de 100 a 120 compuestos se vieron significativamente afectados por la exposición al humo del cigarrillo. La deconvolución de la fragmentación MS2 y la normalización de las intensidades de señal del fragmento permitieron la definición aproximada de la cantidad total de cada ácido graso conjugado representado en cada vidrio lipídico y la comparación de estos datos entre los grupos expuestos y control. Se observó una disminución en los ácidos grasos totalmente saturados y pocos insaturados, mientras que los ácidos grasos poliinsaturados en la composición de las clases de fosfolípidos PC, PE y PG se elevaron en el grupo de humo de cigarrillo para todos los puntos temporales.Los casos extremos de PC y PG conjugados con ácido eicosapentaenoico y docosahexaenoico se detectaron exclusivamente en el grupo de exposición a 3R4F CS. El pipeteo de la muestra y la muestra de control de calidad debe hacerse con puntas de banda baja y ser precisas, lo que significa que las puntas deben verificarse entre cada muestra. El pipeteo de la solución estándar interna es crítico y debe ser preciso.La solución de 1 a 1 diclorometano metanol debe manejarse con cuidado y se debe usar un no plastificante que contenga puntas para evitar que haya polímeros plásticos en las muestras. Las puntas deben cambiarse entre cada muestra.

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Investigación

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El protocolo descrito proporciona un análisis proteómico cuantitativo optimizado de muestras de tejido utilizando dos enfoques: cuantificación basada en etiquetas y sin etiquetas. Los enfoques basados en etiquetas tienen la ventaja de una cuantificación más precisa de las proteínas, mientras que un enfoque sin etiquetas es más rentable y se utiliza para analizar cientos de muestras de una cohorte.

Flujo de trabajo integral de proteómica de escopeta basada en espectrometría de masas de muestras de tejido

Este documento proporciona tres ensayos fáciles y accesibles para evaluar el metabolismo de los lípidos en ratones.

Evaluación de la capacidad de manejo de lípidos de todo el cuerpo en ratones

Se proporciona un protocolo detallado y tres scripts de Python para operar un sistema robótico de manejo de líquidos de código abierto para realizar la preparación semiautomatizada de muestras de proteínas para experimentos de espectrometría de masas, que cubren la eliminación de detergentes, la digestión de proteínas y los pasos de desalinización de péptidos.

Procesamiento de muestras de proteómica de escopeta automatizado por un robot de laboratorio de código abierto

El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía detallada sobre la preparación adecuada de la muestra para el análisis de lípidos y metabolitos en tejidos pequeños, como el cerebro de Drosophila , utilizando imágenes de espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI).

Preparación de muestras para el análisis rápido de lípidos en el cerebro de Drosophila utilizando imágenes de espectrometría de masas de desorción / ionización láser asistidas por matriz

La lipólisis de triglicéridos en los adipocitos es un proceso metabólico importante que resulta en la liberación de ácidos grasos libres y glicerol. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para medir la lipólisis basal y estimulada en adipocitos y tejido adiposo ex vivo de ratones.

Medición de la tasa de lipólisis en tejido adiposo murino ex vivo y preadipocitos primarios diferenciados in vitro

En este artículo, describimos un protocolo para utilizar la ecografía cuatridimensional in vivo y la espectrometría de masas ex vivo para evaluar las alteraciones biomecánicas y biomoleculares en el sistema cardiovascular murino. Esta técnica se aplica para analizar el remodelado cardíaco en el infarto de miocardio inducido quirúrgicamente y los cambios vasculares en animales envejecidos.

Estudio multimodal de la remodelación cardiovascular murina: ecografía cuatridimensional y espectrometría de masas

Se describe un método de transferencia de Northern modificado para la medición de N 6 -methyladenosine (m 6 A) las modificaciones en el ARN. El método actual puede detectar modificaciones en diversos ARN y controles en virtud de diversos diseños experimentales.

Un método para medir el ARN<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Modificaciones en células y tejidos

Aprende lipidómica de escopeta para cuantificar más de 400 lípidos en tejidos de roedores. Este método rápido permite identificar biomarcadores de toxicidad temprana y estudiar mecanismos lipídicos.

Lipidómica de escopeta de tejidos de roedores

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