Microscopía intravital de fluorescencia de campo ancho de la microcirculación pulmonar en la lesión pulmonar aguda experimental utilizando un sistema de imágenes estabilizado por vacío

Este protocolo describe en detalle, la preparación quirúrgica y el uso de un sistema estabilizado al vacío para obtener imágenes de la adhesión de leucocitos pulmonares y la perfusión capilar in vivo. La principal ventaja de esta técnica es que permite imágenes intravitales estables de alta resolución del pulmón reflejado intacto con un trauma físico mínimo. Para comenzar, prepare la ventana de imágenes administrando una capa delgada de grasa al vacío en la parte superior del anillo exterior mientras evita la contaminación del canal de vacío.

Coloque un resbalón de cubierta de vidrio limpio de 8 milímetros en la ventana y presione suavemente hacia abajo para crear un sello. Conecte la ventana de imágenes a una bomba de vacío equipada con un manómetro digital y capaz de proporcionar de 50 a 60 milímetros de succión constante de mercurio. Pase una longitud de cable de fibra óptica a través de una cánula endotraqueal de calibre 20 y sumerja la punta en lidocaína HCL.

Después de la anestesia, inserte un otoscopio modificado, de modo que los incisivos superiores encajen dentro del espacio en el espéculo. Ajuste el endoscopio y la posición de la lengua hasta que la epiglotis y las cuerdas vocales sean claramente visibles. Inserte el cable de fibra óptica a través del espacio en el espéculo y use pequeños movimientos circulares para pasar el cable entre las cuerdas vocales, luego use el cable de fibra óptica como guía, deslice suavemente la cánula en la tráquea para intubar el mouse.

Después de comenzar la ventilación con isoflurano al 1,5%, confirme la profundidad de la anestesia mediante la prueba del reflejo del pedal. Asegure la cánula al hocico con cinta médica. Use cinta adhesiva para asegurar la pata delantera derecha a la almohadilla térmica en la posición de las nueve en punto y extienda la pata trasera izquierda caudalmente y asegúrela en la posición de las seis en punto.

Usando una cinta de tela, estire ligeramente la pata delantera izquierda hasta la posición de las 12 en punto y asegure el otro extremo de la cinta hasta la parte superior de la plataforma de microscopía intravital, luego aplique una sonda de temperatura rectal y un oxímetro de pulso de pata para monitorear los signos vitales durante todo el experimento. Para preparar al ratón para la cirugía, esterilice el tórax y el abdomen con una toallita con alcohol al 70% y aplique una capa ligera de aceite mineral para humedecer el cabello en el lado izquierdo del ratón. Haga una pequeña incisión cerca de la parte inferior de la caja torácica para exponer la capa muscular subyacente, luego extienda la incisión inicial y use la disección contundente para exponer la caja torácica.

Usando fórceps hemostáticos, agarre el tejido epitelial y adiposo diseccionado y colóquelo fuera del área quirúrgica. Para etiquetar fluorescentemente los leucocitos y el flujo sanguíneo, administre un bolo de 2,5 mililitros por kilogramo de rodamina 6G y FITC-albúmina a través de la vena de la cola. Usando pinzas dentadas, agarre la costilla inmediatamente inferior a la posición de la base del pulmón en la inspiración final.

Retraiga ligeramente los fórceps para alejar la costilla del pulmón y luego corte la costilla para inducir un neumotórax. Extienda la incisión lateralmente en ambas direcciones, teniendo cuidado de no tocar el pulmón. Agarre la siguiente costilla más alta con fórceps romos y retraiga ligeramente para permitir que el pulmón se caiga lejos de la pared torácica.

Si el pulmón no se desprende, presione la pared torácica ligeramente contra el pulmón para hacer que el pulmón se adhiera a la pleura subyacente y, por lo tanto, se caiga más fácilmente. Continúe la incisión original eventualmente hasta el esternón y cranealmente hasta que el ápice del pulmón esté expuesto. Use aplicadores de algodón y gasas para atenuar cualquier sangrado que surja.

Levante la caja torácica para exponer los vasos sanguíneos intercostales en el aspecto dorsal de la cavidad torácica, teniendo cuidado de no dañar el pulmón, cauterice el vaso intercostal más inferior cerca de la columna vertebral y luego corte la costilla contigua. Moverse cranealmente, y eventualmente, usar un patrón repetido de cauterización y corte para extirpar una porción de aproximadamente uno por dos centímetros de la caja torácica. Para prepararse para la obtención de imágenes, transfiera la plataforma de microscopía intravital a la etapa del microscopio y coloque la ventana de imágenes directamente sobre el pulmón expuesto.

Use el micromanipulador para bajar cuidadosamente la ventana de imágenes hasta que se adhiera y estabilice la superficie pulmonar. Para visualizar la microcirculación pulmonar, utilice un microscopio de fluorescencia de campo amplio equipado con un objetivo 20x y conjuntos de filtros ESTÁNDAR FITC y Rhodamine. Utilice una cámara CCD en blanco y negro para grabar los vídeos con un contraste óptimo.

Usando el conjunto de filtros FITC, identifique un lugar pulmonar basado en el patrón convergente del flujo sanguíneo y grabe un video de 30 segundos con el lugar enfocado, luego repita la grabación en el mismo campo de visión usando el conjunto de filtros de rodamina para visualizar leucocitos. Para localizar una arteria pulmonar, use el conjunto de filtros FITC para identificar un vaso con un patrón divergente de flujo sanguíneo y grabe un video de 30 segundos. Repita la grabación en el mismo campo de visión utilizando el conjunto de filtros de rodamina para visualizar los leucocitos.

Para localizar las regiones capilares de interés, utilice el conjunto de filtros FITC para identificar un área de alvéolos y capilares no intersectados por vasos más grandes y grabe un video de 30 segundos. Repita la grabación en el mismo campo de visión utilizando el conjunto de filtros de rodamina para visualizar los leucocitos. Este video muestra imágenes FITC del flujo sanguíneo dentro de un lugar pulmonar como lo indica la flecha verde.

Las imágenes de rodamina permiten la visualización de leucocitos en el mismo lugar con dos leucocitos adherentes indicados por las flechas rojas. Estos métodos también se aplicaron para visualizar los mismos fenómenos y las arterias pulmonares y las regiones capilares de interés. Para demostrar la cuantificación de los parámetros microcirculatorios, los ratones fueron tratados con LPS intranasal para inducir inflamación pulmonar.

El tráfico de leucocitos en lugares pulmonares se muestra aquí con áreas delineadas que representan las regiones endoteliales analizadas en ratones ingenuos y tratados con LPS. La adhesión y el laminado de leucocitos aumentaron en ratones tratados con LPS. El tráfico de leucocitos en las arterias pulmonares se muestra aquí con áreas delineadas que representan las regiones endoteliales analizadas en ratones ingenuos y tratados con LPS.

La adhesión leucocitaria fue mayor en ratones tratados con LPS. Esta figura muestra la adhesión de leucocitos dentro de los capilares pulmonares en ratones ingenuos y tratados con LPS. Se demostró que la adhesión leucocitaria era mayor en ratones tratados con LPS versus naïve.

Esta figura muestra la perfusión de capilares pulmonares en ratones ingenuos y tratados con LPS. Se demostró que la densidad capilar funcional era menor en ratones tratados con LPS versus naïve. Hay muchos aspectos desafiantes de este protocolo.

Optimizar el posicionamiento del ratón en la plataforma es un paso simple que puede hacer que los pasos quirúrgicos y de imágenes sean mucho más reproducibles. Este procedimiento es adaptable a una amplia gama de parámetros de estudio y enfoques de microscopía. Por lo tanto, debe facilitar una mayor investigación de la microcirculación pulmonar tanto en estados sanos como enfermos.