Name: Cría masiva y estudios moleculares en insectos plaga tortricidae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Aprenda métodos de cría masiva de insectos tortricidae plaga para estudios moleculares y diferenciación sexual. Estas técnicas permiten extraer ácidos nucleicos para secuenciación de alto rendimiento y avanzar en el manejo integrado de plagas agrícolas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean agradecer el apoyo de las Becas de Investigación para Jóvenes Científicos de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) [Número de subvención 19J13123 y 21J00895].

1. Recolección de insectos y cría masiva
<ol><li>Recolectar insectos tortricidas de los campos siguiendo las Referencias 8,12 publicadas anteriormente. NOTA: Las larvas de H. magnanima y A. honmai se recogen de hojas de té dañadas (Figura 1A); los adultos son atraídos usando luz UV portátil de 4 W (longitud de onda de 365 nm, ver Tabla de Materiales, Figura 1B).</li>
	<li>Recoja las larvas recolectadas (Figura 1C, D) individualmente en una pieza de dieta artificial en una taza de 1/2 oz durante 2-3 semanas hasta la eclosión adulta (Figura 1E, F). Confirmar el sexo de pupas y adultos por rasgos morfológicos (Figura 1G,I).</li>
	<li>Aparea los machos y las hembras en una caja de plástico (30 cm x 20 cm x 5 cm) para ovipositar masas de huevos en un papel de parafina (Figura 1J-L). Coloque una hembra y dos machos en un vaso de plástico de 120 ml con un trozo de papel de parafina para establecer una matrilina. NOTA: Es importante hacer pliegues en el papel de parafina. Para H. magnanima, el papel de parafina debe estar en la parte inferior de la caja. Mientras tanto, para A. honmai, coloque un papel en el techo de la caja para recolectar huevos (Figura 1L) ya que la masa de huevo de H. magnanima oviposit en la parte superior de las hojas de té, pero A. honmai pone huevos en la parte inferior de las hojas8. Los procedimientos también se verificaron en otras especies de tortricidas, y es mejor colocar documentos en ambos lados si la ecología y el comportamiento de las especies objetivo no están aclarados.</li>
	<li>Cortar las masas de huevo (aproximadamente 100-200 huevos por masa de huevo12, Figura 1M) en el papel de parafina con tijeras. Coloque los huevos en una taza de 1/2 oz con papel vertido durante 5-7 días. NOTA: El embrión maduro exhibe una cápsula de espinillas (Figura 1N). Los períodos de embriogénesis se atribuyen de manera diversa a las especies de tortricidas, pero generalmente 5 días después de la oviposición (dpo) para H. magnanima y 4 dpo para A. honmai a 25 ° C con 60% de humedad relativa, 16 h de luz / 8 h ciclos de oscuridad7.</li>
	<li>Guarde las masas de huevo que muestran cápsulas de cabeza negra a 4-8 ° C durante 7 días.</li>
	<li>Cortar ~ 60 g dietas artificiales usando un rallador para la cría en masa. Coloque la masa de huevo llena de embriones maduros en la dieta artificial en rodajas en un recipiente de plástico (23 cm x 16 cm x 8 cm). Coloque papeles de parafina en la masa de huevo con las dietas en rodajas (Figura 10). NOTA: Por debajo del 30% de humedad relativa se considera demasiado seco, mientras que más del 70% es demasiado húmedo. Crear agujeros en la tapa del recipiente de plástico es mejor para permitir una mejor ventilación. Llene los agujeros con algodón para evitar los escapes de pequeñas larvas.</li>
	<li>Para eliminar los contaminantes superficiales de los huevos, remoje la masa de huevo en una solución de formalina al 3% y cloruro de benzalconio al 0,2% durante 5 min, respectivamente12. Para erradicar las bacterias intestinales o intracelulares, utilice una dieta artificial suplementada con 0.05% (p/p) de clorhidrato de tetraciclina o 0.06% (p/p) de rifampicina en lugar de una dieta artificial normal (ver Tabla de Materiales). NOTA: Este paso es opcional. Es importante amasar Silk Mate 2S y 0.05% (p/p) clorhidrato de tetraciclina o 0.06% (p/p) rifampicina de manera equitativa para mayor consistencia.</li>
	<li>Recoge las pupas del recipiente de plástico y distingue el sexo en función delas 12 características morfológicas (Figura 1G-I). NOTA: Generalmente, los tortricidos presentan 5-6 instars hasta la pupación12. Las larvas de H. magnanima y A. honmai tardan 3 semanas y 2 semanas, respectivamente, después de la eclosión hasta la pupación.</li>
	<li>Coloque 15 machos y 10 hembras en una caja de plástico (30 cm x 20 cm x 5 cm, Figura 1K) para aparearse con 25 ° C, 16 L / 8 D. Recoja los huevos por 5-7 días y repita los pasos 1.4-1.9. para cada generación. NOTA: Si es necesario recolectar masas de huevos recién ovipuestas para su posterior análisis, establezca el inicio y el final del período oscuro, por ejemplo, de 9 a.m. a 5 p.m. En esta condición, H. magnanima y A. honami generalmente oviposit huevos después de 5 h (2 PM).</li>
</ol>2. Separación de huevos y larvas de fraato de masas de huevos para fijación, permeabilización y tinción
<ol><li>Remoje la masa del huevo en 1.000 μL de solución acuosa de hipoclorito de sodio al 1,2% durante 10 min o en 1.000 μL de solución acuosa de hidróxido de potasio al 5 M durante 30 min para separar los huevos.</li>
	<li>Lavar los huevos separados en 1.000 μL de PBSt (137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 0,05% de polioxietileno (20) Sorbitan Monolaurate [Tween-20] pH 7,4, ver Tabla de Materiales) siguiendo el informe publicado anteriormente7.</li>
	<li>Remoje los huevos en una mezcla de 500 μL de 100% de heptano y 500 μL de solución de paraformaldehído-PBSt al 4% (p/v). Mezclar durante 10 min a 1.500 rpm con un mezclador de vórtice.</li>
	<li>Remoje los huevos en una mezcla de 500 μL de 100% de heptano y 500 μL de 100% de metanol. Mezclar durante 10 min a 1.500 rpm.</li>
	<li>Lave los huevos dos veces con 1.000 μL de metanol al 100% y guárdelos a 4 °C en metanol al 100% hasta nuevos experimentos (Figura 2A). NOTA: Los huevos se pueden almacenar durante al menos 1 año a 4 °C.</li>
	<li>Remoje los huevos secuencialmente en 99%, 70%, 50% de etanol y PBSt durante 5 minutos cada uno para hidrofilización después del informe publicado anteriormente7.</li>
	<li>Lave los huevos con PBSt, sumerja los huevos en 1 μg / ml de solución DAPI durante 5 minutos y luego lave los huevos con 1x PBS dos veces. Remoje los huevos en 20 μL de solución de orceína láctico-acética al 1,25% (p/p) (ver Tabla de Materiales)11 para visualizar la heterocromatina hasta que los núcleos exhiban un color rojo brillante (esto varía de 5-60 min) (Figura 2B,C). NOTA: Los períodos de tinción láctico-acético de la orceína dependen de la temperatura y la humedad. Es mejor verificar la tinción adecuada con un microscopio con un aumento de 4x-10x.</li>
	<li>Transfiera los huevos teñidos con una pipeta a un portaobjetos de vidrio. Encierre los huevos teñidos con reactivo antifade (ver Tabla de Materiales) y una cubierta de vidrio7.</li>
	<li>Extraer las larvas de H. magnanima y A. honmai (4-5 días después de la oviposición (dpo)) de las masas de huevos utilizando fórceps (Figura 2D). Bisectar larvas en un portaobjetos de vidrio (Figura 2E).</li>
	<li>Fije cualquier tejido (por ejemplo, ganglio suboesofágico, ganglios torácicos, túbulo malpighiano, etc.) con una mezcla de 1:3 (v/v) 99,7% de ácido acético/100% de metanol durante 5 min. Manche aquellos con 1.25% (p/p) solución de orceína láctico-acética11 hasta que los núcleos estén teñidos (esto puede tomar de 5 a 60 min, dependiendo de la temperatura y la humedad).</li>
	<li>Determinar el sexo de cada espécimen observando la presencia (hembra) o ausencia (macho) de heterocromatina (el cromosoma W, Figura 2F,G) bajo un microscopio. NOTA: El sexo se determina visualizando la cromatina sexual. Cada célula representa la cromatina sexual como un punto en las hembras 11,12, mientras que la porción restante de los tejidos larvales de fraato (no fija) debe sumergirse inmediatamente en tampón de lisis celular12 (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA y 1% SDS, pH 8.0) o reactivos de extracción de ARN que contienen fenol para la extracción de ADN o ARN. Antes de las disecciones, dispensar 20 μL de los reactivos en tubos de PCR de 0,2 ml por adelantado (Figura 3A). Sumergir y almacenar las muestras a -80 °C hasta su posterior extracción. Las muestras se pueden almacenar durante al menos 3 meses, pero es mejor continuar con los experimentos posteriores para evitar la degradación de los ácidos nucleicos.</li>
</ol>3. Extracciones de ADN y ARN de larvas de fraato determinadas por sexo
<ol><li>Agrupar 12 larvas de fraato macho o hembra determinadas por sexo (embrión de 5 dpo) y agregar tampón de lisis celular o reactivos de extracción de ARN (ver paso 2.11 y Tabla de materiales) en un tubo de 1.5 ml. NOTA: Siga los pasos 3.2-3.7 para la extracción de ADN y los pasos 3.8-3.11 para la extracción de ARN.</li>
	<li>Homogeneizar los tejidos en 600 μL del tampón de lisis celular (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA y 1% SDS, pH 8.0), y centrifugar las muestras a 10.000 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante (500 μL) con una pipeta e incubar a 50 °C con 1,5 μL de Proteinasa K (20 mg/ml, ver Tabla de Materiales) durante 5 h en un bloque térmico.</li>
	<li>Tratar las muestras con 1,0 μL de 10 mg/ml de solución de RNasa (ver Tabla de Materiales) a 37 °C durante 30 min.</li>
	<li>Añadir 200 μL de solución de precipitación de proteínas (ver Tabla de Materiales) a los tubos7, seguido de una centrífuga a 17.000 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Mezclar el sobrenadante (500 μL) con 500 μL de isopropanol al 100%, y luego centrifugar a 20.400 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Lave el ADN peletizado dos veces con 1.000 μL de etanol al 70%. Luego, seque al aire (5-10 min a temperatura ambiente), disuelva el ADN en 30 μL de tampón Tris-Cl de 10 mM (pH 8.5).</li>
	<li>Homogeneizar los tejidos en 600 μL de reactivos de extracción de ARN y añadir 240 μL de agua destilada ultrapura al tubo. Centrifugar los tubos a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Mezclar el sobrenadante (600 μL) con 600 μL de isopropanol al 100% y transferir la mezcla a una columna de espín de sílice (ver Tabla de Materiales). Centrifugar los tubos a 17.900 x g durante 1 min a 4 °C.</li>
	<li>Lavar la columna con 750 μL de etanol al 70% y centrifugar la columna dos veces a 17.900 x g durante 1 min cada una a 4 °C.</li>
	<li>Cargue 15 μL de agua destilada ultrapura a la columna. Centrifugar los tubos a 17.900 x g durante 1 min a 4 °C para eludir el ARN.</li>
	<li>Calcule y verifique la calidad y cantidad de ADN y ARN utilizando un espectrofotómetro basado en UV. Evaluar la pureza de los ácidos nucleicos utilizando las proporciones A260/A280 (ácidos nucleicos/proteína) y A260/A230 (ácidos nucleicos/sales y otros contaminantes)13. NOTA: Para la extracción de ARN, se siguió el procedimiento12 previamente publicado, que resultó en contaminación por fenol (Tabla 1). El ADN y el ARN extraídos de un solo embrión o larvas de fraato producen muestras de baja cantidad y baja calidad. Típicamente, la extracción de ADN de 12 larvas de fraato produce 100-600 ng, mientras que la extracción de ARN utilizando el método actual genera 900-1,500 ng, como se muestra en la Tabla 1. NOTA: Los pasos 3.13-3.15 son opcionales para ensayos adicionales de secuenciaciones de alto rendimiento.</li>
	<li>Calcule las cantidades de ADN y ARN utilizando un espectrofotómetro basado en fluorescencia. NOTA: Se calculó la relación entre las cantidades de ARN (concentración basada en UV (ng/μL)/concentración basada en fluorescencia (ng/μL)) para evaluar la calidad para su posterior aplicación experimental. Por ejemplo, cuando las concentraciones basadas en UV y fluorescencia son de 80 ng/uL y 60 ng/uL, respectivamente, la relación será de 1,5 (80/60). Por lo general, las proporciones inferiores a 1,5 indican una pureza suficiente para aplicaciones posteriores que utilizan secuenciación de alto rendimiento13.</li>
	<li>Analizar la calidad del ARN mediante electroforesis de microchip14.</li>
	<li>Utilice los ARN calificados para preparar la biblioteca de ARN utilizando un kit de preparación de la biblioteca de ARN (consulte la Tabla de materiales). Secuenciar las bibliotecas utilizando una plataforma adecuada para las bibliotecas preparadas.</li>
</ol>

<ol><li>Gaston, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+magnitude+of+global+insect+species+richness%5BTitle%5D)+AND+%22Conservation+Biology%22%5BJournal%5D)">The magnitude of global insect species richness.</a> Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).</li>
<li>Pogue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+world+revision+of+the+genus+Spodoptera+Guen%C3%A9e+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Memoirs+of+the+American+Entomological+Society%22%5BJournal%5D)">A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1(2002).</li>
<li>Matsuura, H., Naito, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+cold-hardiness+and+overwintering+of+Spodoptera+litura+F.+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29%3A+VI.+Possible+overwintering+areas+predicted+from+meteorological+data+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Entomology+and+Zoology%22%5BJournal%5D)">Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan.</a> Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).</li>
<li>Mita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+construction+of+an+EST+database+for+Bombyx+mori+and+its+application%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The construction of an EST database for Bombyx mori and its application.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).</li>
<li>Kawamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-quality+genome+assembly+of+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).</li>
<li>Fukui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+masculinizing+function+of+the+Ostrinia+furnacalis+Masculinizer+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).</li>
<li>Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+disperse+eggs+from+lepidopteran+scale-like+egg+masses+and+to+observe+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Entomological+Science%22%5BJournal%5D)">A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis.</a> Entomological Science. 25 (1), 12497(2022).</li>
<li>vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avander+Geest%2C+LP+%22Tortricid+pests%3A+their+biology%2C+natural+enemies+and+control%22">Tortricid pests: their biology, natural enemies and control</a>. , Elsevier Science Publishers. Amsterdam. (1991).</li>
<li>Kiuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+female-specific+piRNA+is+the+primary+determiner+of+sex+in+the+silkworm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm.</a> Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).</li>
<li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).</li>
<li>Kageyama, D., Traut, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+sex-specific+effects+of+Wolbachia+and+interference+with+the+sex+determination+of+its+host+Ostrinia+scapulalis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%22%5BJournal%5D)">Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis.</a> Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).</li>
<li>Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+male-killing+and+nonmale-killing+Wolbachia+strains+in+the+oriental+tea+tortrix+Homona+magnanima%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima.</a> Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).</li>
<li>Schalamun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+MinION%3A+An+example+of+how+to+establish+long-read+sequencing+in+a+laboratory+using+challenging+plant+tissue+from+Eucalyptus+pauciflora%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora.</a> Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).</li>
<li>Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+does+insect+RNA+look+degraded%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Why does insect RNA look degraded.</a> Journal of Insect Science. 10 (1), 159(2010).</li>
<li>Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+inbreeding+in+Mimulus+guttatus+on+tolerance+to+herbivory+in+natural+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology%22%5BJournal%5D)">Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments.</a> Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).</li>
<li>Saccheri, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbreeding+and+extinction+in+a+butterfly+metapopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation.</a> Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).</li>
<li>Crnokrak, P., Roff, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbreeding+depression+in+the+wild%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Inbreeding depression in the wild.</a> Heredity. 83 (3), 260-270 (1999).</li>
<li>Keller, L. F., Waller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbreeding+effects+in+wild+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Inbreeding effects in wild populations.</a> Trends in Ecology & Evolution. 17 (5), 230-241 (2002).</li>
<li>Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eggshell+of+Drosophila+melanogaster.+I.+Fine+structure+of+the+layers+and+regions+of+the+wild-type+eggshell%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell.</a> Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).</li>
<li>Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+male-killing+Wolbachia+carries+a+feminizing+factor+and+is+associated+with+degradation+of+the+sex-determining+system+of+its+host%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Letters%22%5BJournal%5D)">A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host.</a> Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Tortricid comprende varias plagas agrícolas y forestales; el presente estudio presentó métodos para criar tortrix a lo largo de generaciones, observar la embriogénesis y el sexo de los insectos, y realizar análisis moleculares utilizando embriones maduros.
Uno de los obstáculos para el estudio de insectos plaga es establecer métodos de cría. Especialmente, la endogamia a veces afecta negativamente la aptitud de la especie. La reducción de la aptitud física por la consanguínea, llamada depresió...

Los insectos lepidópteros representan más del 10% de todas las especies vivas descritas1, y ciertas especies de taxones causan graves daños a las plantas y graves pérdidas agrícolas 2,3. Aunque se han desarrollado estudios moleculares y genéticos utilizando modelos de insectos como el gusano de seda Bombyx mori 4,5, los insectos plaga siguen sin ser investigados, en parte debido a las dificultades para la cría y manipulación 6,7. Por lo tanto, los estudios y técnicas fundamentales son necesarios para comprender la biología de tales insectos plaga no modelo.
Los Tortricidae (Lepidoptera), comúnmente conocidos como tortrix o polillas de las hojas, comprenden muchas plagas agrícolas y forestales8. De los taxones de insectos, la tortrix oriental del té Homona magnanima Diakonoff y la tortrix de frutas de verano Adoxophyes honmai Yasuda son plagas polífagas graves que se sabe que dañan los árboles de té en el este de Asia7. Las dos especies ponen racimos de huevos planos y ovalados (o masas de huevos) que consisten en huevos delgados, blandos y frágiles cubiertos por secreciones maternas. Aunque las etapas de embriogénesis son cruciales para el desarrollo de insectos y las determinaciones del sexo9, las estructuras de los huevos impiden que un análisis más detallado comprenda la biología de los insectos. Es importante superar las dificultades para un mayor estudio de las plagas que oviponen una masa de huevos tan compleja.
Aquí, para comprender la biología de los tortricidos, se han desarrollado métodos para la cría en masa, observaciones y estudios moleculares utilizando A. honmai y H. magnanima. En primer lugar, los métodos de cría en masa mantienen a ambos tortricidos más de 100 generaciones por endogámicos. La separación de los huevos de la masa de huevo concatenada similar a una escama facilitó la observación de la embriogénesis de los tortricidos utilizando disolventes alcalinos y orgánicos previamente desarrollados a partir de técnicas utilizadas en moscas10. Además, el presente estudio estableció la discriminación sexual de embriones pequeños mediante el desarrollo de métodos de tinción de la cromatina sexual de hembras lepidópteras utilizando orceína láctico-acética11. Mediante la combinación de estos métodos, se extrajeron ácidos nucleicos de alta calidad y cantidad de embriones determinados por sexo, lo que de otro modo sería difícil de establecer6. El ARN extraído se utilizó para la secuenciación de próxima generación. Colectivamente, los métodos presentados aquí se aplican a otros insectos lepidópteros y otros taxones de insectos.

<table><tbody><tr><td>1/2 onza taza</td><td>de FP CHUPA</td><td>CP070009</td><td>la cría de insectos; https://www.askul.co.jp/p/6010417/</td></tr> 1<tr><td>/2 onza de tapa de taza</td><td>FP CHUPA</td><td>CP070011</td><td>la cría de insectos; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether</td></tr><tr><td>ácido acético al 99.7%</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japón</td><td>36289</td><td>fijación; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>no se muestra</td><td>Cuantificación de ácidos nucleicos; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument</td></tr><tr><td>Agilent RNA6000 nano kit Agilent</td><td>Technologies</td><td>5067-1511</td><td>Cuantificación de ácidos nucleicos; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG .pdf</td></tr><tr><td>solución de cloruro de benzalconio</td><td>Nihon Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>No.4987123116046</td><td>esterilización; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html</td></tr><tr><td>Algodón</td><td>AOUME</td><td>8-1611-02</td><td>cría de insectos; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1</td></tr><tr><td>solución DAPI</td><td>Dojindo, Tokio, Japón</td><td>340-07971</td><td>tinciones; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/</td></tr> <tr><td>Fosfato de hidrógeno disódico</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html</td></tr><tr><td>dsDNA HS kit de cuantificación</td><td>Invitrogen</td><td>Q33231</td><td>Cuantificación de ácidos nucleicos; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230</td></tr><tr><td>Econospin RNA II columna</td><td>Epoch Life Science Inc.</td><td>EP-11201</td><td>Extracción de ARN; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japón</td><td>4.98748E + 12</td><td>fijación; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html</td></tr><tr><td>Etilendiamina-N,N,N',N'-ácido tetraacético Sal tetrasódica tetrahidratado (4NA)</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Tampón de lisis celular (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html</td></tr><tr><td>Papel glassine</td><td>HEIKO</td><td>2100010</td><td>la cría de insectos; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla&amp; utm_medium=cpc& utm_source= Bloque</td></tr><tr><td>de calor Adw WSC-2620 PowerBLOCK</td><td>ATTO, Tokio, Japón</td><td>4002620</td><td>incubación; https://www.attoeng.site/</td></tr> <tr><td>heptano</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japón</td><td>4.98748E+12</td><td>fijación;</td></tr><tr><td>https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html INSECTA LF</td><td>Nosan Co., Ltd</td><td>no se muestra</td><td>Dieta artificial; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm</td></tr><tr><td>ISOGENII</td><td>Nippon Gene</td><td>311-07361 Extracción de</td><td>ARN;</td></tr><tr><td>https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html isopropanol</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>extracción de ácidos nucleicos; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html</td></tr><tr><td>ácido láctico</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Tinciones;</td></tr><tr><td>https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html metanol</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japón</td><td>4.98748E+12</td><td>fijación;</td></tr><tr><td>https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html MSV-3500 vórtice</td><td>Biosan</td><td>BS-010210-TAK</td><td>Mezclador Voltex; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/</td></tr><tr><td>Nano fotómetro NP 80</td><td>Implen</td><td>no se muestra</td><td>Cuantificación de ácidos nucleicos; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/</td></tr> <tr><td>Paquete natural</td><td>amplio Inomata químico</td><td>1859</td><td>cría de insectos; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3% 82%A4%E3%83%89</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Kit de preparación de la biblioteca para la preparación de la biblioteca Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7770S</td><td>;</td></tr><tr><td>https://www.nebj.jp/products/detail/2039 orceína</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Tinciones; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>160-16061</td><td>fijación; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html</td></tr><tr><td>Polioxietileno(20) Monolaurato de sorbitán</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html</td></tr><tr><td>Luz negra UV portátil (4W, longitud de onda de 365nm)</td><td>Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japón</td><td>no se muestra</td><td>Colección de insectos; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>KCl;</td></tr><tr><td>https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html Fosfato de dihidrógeno de potasio</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Invitrogen, MA, EE. UU</td>. <td>P36965</td><td>antidecoloración; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965</td></tr><tr><td>Proteinasa K Solution</td><td>Merck</td><td>71049-4CN</td><td>Extracción de ADN; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049</td></tr><tr><td>solución de precipitación de proteínas</td><td>Qiagen</td><td>158912</td><td>extracción de ADN; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC</td></tr><tr><td>Qubit V4</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td>Cuantificación de ácidos nucleicos;</td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 rifampicina</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japón</td><td>4.98748E+12</td><td>Esterilización; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html</td></tr><tr><td>Kit de cuantificación de ARN HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32855</td><td>Cuantificación de ácidos nucleicos; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852</td></tr><tr><td>solución de ARNasa</td><td>Nippon Gene</td><td>313-01461 Extracción de</td><td>ARN; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html</td></tr><tr><td>Silk Mate 2S</td><td>Nosan Co., Ltd</td><td>no se muestra</td><td>Dieta artificial; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>NaCl;</td></tr><tr><td>https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html sulfato de dodecilo sódico</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Tampón de lisis celular (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html</td></tr><tr><td>solución acuosa de hipoclorito de sodio</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japón</td><td>4.98748E+12</td><td>separación de huevos; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html</td></tr><tr><td>Clorhidrato de tetraciclina</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japón</td><td>4.98748E+12</td><td>Esterilización; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Tampón de lisis celular; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html</td></tr><tr><td>agua destilada ultrapura</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td>extracción de ARN; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015</td></tr></tbody></table>

cría masiva y estudios moleculares en insectos plaga tortricidae

Mass-Rearing and Molecular Studies in Tortricidae Pest Insects

Tortricidae (Lepidoptera), comúnmente conocidos como polillas tortrix o leafroller, comprende muchas plagas agrícolas y forestales, que causan graves pérdidas agrícolas. Para comprender la biología de tales polillas plaga, las técnicas fundamentales han tenido una gran demanda. Aquí, los métodos para la cría en masa, las observaciones y los estudios moleculares se desarrollan utilizando dos tortrix de té, Homona magnanima y Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Los insectos fueron criados en masa con una dieta artificial en rodajas y mantenidos por endogamia durante más de 100 generaciones teniendo en cuenta sus características biológicas. Los insectos tienen varios dimorfismos sexuales; por lo tanto, es difícil distinguir el sexo durante las etapas de desarrollo, que han impedido los ensayos posteriores. El presente trabajo destacó que el sexo de las larvas de tortricidas podría determinarse mediante la observación de testículos o tinción de orceína láctico-acética para visualizar el cromosoma W específico de la hembra. Además, utilizando los métodos de determinación del sexo, el presente estudio permitió la extracción de ácido nucleico de embriones determinados por sexo y la aplicación hacia la secuenciación de alto rendimiento. Estos consejos son aplicables para otros insectos plaga y facilitarán más estudios morfológicos y genéticos.

Establecimiento de líneas de acogida y su mantenimiento La viabilidad de las larvas recolectadas en el campo se atribuye de manera diferente a la ubicación del campo, las estaciones y las condiciones de cría (por ejemplo, el 90% de la viabilidad en Taiwán, Taoyuan, como se muestra en Arai et al.12). Aproximadamente el 30%-50% de los pares generarán la próxima generación como de costumbre. Para H. magnanima y A. honmai, las matrilinas se han mantenido mediante ...

El presente protocolo describe el método de cría de insectos plaga tortricidas en los laboratorios. Los procedimientos para distinguir el sexo de los insectos y extraer ácidos nucleicos para la secuenciación de alto rendimiento se establecen utilizando dos plagas tortricidas.

Cría masiva y estudios moleculares en insectos plaga tortricidae

Tortricidae (Lepidoptera), commonly known as tortrix or leafroller moths, comprises many agricultural and forestry pests, which cause serious agricultural ...

Presentamos masas fundamentales, pero altamente demandadas para la cría en masa, observaciones y estudios moleculares utilizando masas Tortrix de plagas serias, para estudiar su biología. Hasta ahora, la estructura de los huevos de insectos ha impedido un análisis más detallado. Cabe destacar que permitimos el estudio de óvulos delgados, blandos y frágiles cubiertos por la secreción materna.Se espera que existan técnicas simples aplicables para futuras investigaciones sobre la tortrix, probando otros insectos y otros taxones. Comience colocando una hembra y dos machos en un vaso de plástico de 120 mililitros con un trozo de papel de parafina para establecer una línea Matra. Cortar aproximadamente 60 gramos de dietas artificiales usando un rallador para la cría en masa.Coloque la masa de huevo llena de embriones maduros en la dieta artificial en rodajas en un recipiente de plástico. Coloque papeles de parafina en la masa de huevo con las dietas en rodajas. Coloque 15 machos y 10 hembras en una caja de plástico para aparearse a 25 grados centígrados.Recolecte huevos cada cinco a siete días y repita los pasos de cría masiva para cada generación. Remoje la masa de huevo en 1000 microli

mass-rearing-and-molecular-studies-in-tortricidae-pest-insects

Research

Investigación

JoVE Journal

Environment

Entorno

Para lograr la supresión de la población de Aedes aegypti utilizando el sistema RIDL® (Liberación de Insectos Portadores de un Letal Dominante), es necesario liberar un gran número de mosquitos machos. Esto requiere el uso de técnicas y tecnología de cría masiva para proporcionar sistemas confiables para obtener el máximo número de mosquitos machos de alta calidad.

Producción masiva de Aedes aegypti genéticamente modificados para liberaciones de campo en Brasil

Los protocolos para la preparación eficaz de las muestras homogéneas de la araña roja, la infestación de plantas experimentales y la evaluación de daños en las plantas, como se requiere para los estudios de interacción planta-plaga se desarrollaron.

Aplicación de descubierto en dos de Spider Mite<em&gt; Tetranychus urticae</em&gt; Estudios interacción planta-plaga

A continuación, presentamos los protocolos para la crianza de un escarabajo intermedia de gérmenes, Dermestes maculatus (D. maculatus) en el laboratorio. También compartimos protocolos para RNAi embrionario y de los padres y los métodos para el análisis de los fenotipos de embriones para estudiar la función de genes en esta especie.

La cría y el doble-stranded RNA mediada gen desmontables en el Hide Escarabajo, Dermestes maculatus

Imágenes de la morfogénesis de los embriones de insectos con microscopía de fluorescencia basada en la hoja de luz se ha convertido en estado de la técnica. Este protocolo describe y compara tres técnicas de montaje adecuadas para los embriones Tribolium castaneum, introduce dos nuevos líneas transgénicas medida muy adecuado para imágenes en vivo, discute los controles de calidad esenciales e indica limitaciones experimentales actuales.

Microscopía de fluorescencia de vida o fijadas y teñidas a base de hoja de luz<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Los embriones

Tablas de vida permiten la cuantificación de las fuentes y las tasas de mortalidad en las poblaciones de insectos y contribuyen a comprender, predecir y manipulación dinámica de la población en los agroecosistemas. Se presentan métodos de realización y análisis de tablas de vida de cohorte basado en el campo para un insecto con estadios inmaduros sésiles.

Metodología para el desarrollo de tablas de vida para los insectos sésiles en el campo de la mosca blanca, Bemisia tabaci, en algodón como un modelo de sistema de

Proporcionamos un protocolo detallado para la cría, microinjección de huevos y para el apareamiento eficiente del firebrat Thermobia domestica para generar y mantener cepas mutantes después de la edición del genoma.

Microinyección de óvulos y apareamiento eficiente para la edición del genoma en la thermobia doméstica de firebrat

Aquí se presenta un protocolo de microinyección embrionaria de Helicoverpa armigera (Hübner) e identificación de mutantes knockout creado por la edición del genoma CRISPR / Cas9. Los insectos mutantes permiten una mayor investigación de la función génica y la interacción entre diferentes genes in vivo.

Microinyección embrionaria e identificación de mutantes knockout de Helicoverpa armigera editada por el genoma CRISPR/Cas9 (Hübner)

Este documento describe métodos básicos para estandarizar factores importantes como la densidad, la disponibilidad de alimento, la fuente de hidratación y los controles ambientales para la cría a largo plazo de cultivos de laboratorio del grillo comestible, Gryllus bimaculatus.

Mantenimiento de cultivos de laboratorio de Gryllus bimaculatus, un modelo versátil de ortópteros para la agricultura de insectos y la fisiología de invertebrados

El protocolo demuestra un método de disección simple y fácil, adecuado para insectos hembra migratorios de tipo silvestre capturados con trampas de reflectores. Esta técnica puede aclarar significativamente la misma especie comparando ambos tejidos reproductivos, es decir, el saco de apareamiento y el desarrollo ovárico de insectos hembra de tipo salvaje.

Disección y clasificación del desarrollo ovárico en insectos hembra de tipo silvestre

En este trabajo se presenta un protocolo para la obtención de hongos entomopatógenos a partir de un barrenador forestal de la madera y una forma sustitutiva de evaluar sus actividades entomopatógenas utilizando un insecto modelo de coleóptero. Este método es eficiente y conveniente para explorar recursos fúngicos entomopatógenos de plagas de insectos perforadores de madera en bosques naturales.

Aislamiento, identificación conductual y evaluación de la patogenicidad de hongos entomopatógenos de un barrenador forestal

Aprenda métodos de cría masiva de insectos tortricidae plaga para estudios moleculares y diferenciación sexual. Estas técnicas permiten extraer ácidos nucleicos para secuenciación de alto rendimiento y avanzar en el manejo integrado de plagas agrícolas.

Cría masiva y estudios moleculares en insectos plaga tortricidae

Explorar más videos