Name: Mantenimiento de la diversidad celular del glioblastoma humano ex vivo mediante cultivo de organoides tridimensionales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Aprende a generar organoides de glioblastoma humano ex vivo para estudiar la diversidad celular tumoral y evaluar eficacia de fármacos. Este modelo tridimensional replica el microambiente cancerígeno.

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Nos gustaría agradecer al Dr. Justin Lathia por sus valiosos consejos y apoyo continuo. También agradecemos a Katrina Fife, Lisa Wallace y Maya Camhi por su excelente apoyo técnico.

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</ol>

Los autores no tienen conflictos que revelar.

Los organoides GBM son un método de cultivo complementario a las esferas tradicionales que incluyen mayor heterogeneidad celular y microambiental 4,22,30. Aunque requiere más tiempo y recursos, el cultivo de organoides puede ofrecer información valiosa sobre el comportamiento intratumoral y los mecanismos de resistencia a los medicamentos.
GBM es impulsado por una población de CSC 5,31, y estos métodos fueron desarrollados para permitir el crecimiento continuo y la auto-renovación de esta población de CSC. Se sabe que el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) mejoran el mantenimiento y el crecimiento de las células madre y proporcionan señalización activa del receptor tirosina quinasa (RTK). La formación de poblaciones celulares heterogéneas y microambientes tumorales distintos dentro de los tumores GBM depende del apoyo a los comportamientos de CSC. La selección de un lrECM imita el entorno cerebral rico en laminina y ayuda a las células en cultivo de organoides a autoorganizarse y migrar por invasión. Aunque algunos grupos han establecido el cultivo de organoides sin el uso de un medio enriquecido con lrECM o EGF/FGF24,28, lo que puede ofrecer una manera más eficiente en el tiempo de este método de cultivo y una selección más fuerte de señalización oncogénica para impulsar el crecimiento, estos métodos fueron elegidos para optimizar el entorno de células madre para establecer mejor la heterogeneidad celular de los organoides. Tanto los organoides cerebrales como los organoides GBM han sido elaborados con lrECM en la literatura previamente 21,32,33. Aunque hemos establecido datos sobre las poblaciones tumorales encontradas dentro de los organoides y la variación espacial, se sabe menos sobre las poblaciones no tumorales dentro de los organoides y cuánto tiempo sobreviven de las muestras originales de pacientes. Ciertas tinciones IHQ (como CD45) pueden proporcionar estos datos, y podrían ser un punto interesante de investigación en el futuro con organoides.
Conocer el uso previsto para el cultivo de organoides es importante para seleccionar los métodos apropiados. El establecimiento de organoides a partir de especímenes primarios versus el cultivo de organoides uniformes para experimentos específicos tiene procedimientos ligeramente diferentes. Apreciar cómo los organoides maduran y llenan visualmente el andamio lrECM es importante para poder asignar el tiempo y los recursos adecuados al cultivo de organoides. Las regiones dispersas de células en los organoides se expandirán y crecerán lentamente para llenar la lrECM, lo que puede tomar de 2 a 8 semanas, dependiendo del comportamiento de la muestra. Esta tasa de crecimiento es algo intrínseca a cada espécimen; Se conserva en diferentes lotes de organoides y es bastante consistente con la tasa relativa de crecimiento de la esfera. Los organoides se pueden mantener durante más de 1 año y retener las capacidades de formación de tumores en xenoinjertos en ratones; Sin embargo, se recomienda cultivarlos con un propósito distinto para no desperdiciar recursos de laboratorio (tanto materiales como tiempo)4. El crecimiento de organoides se ha probado en múltiples tamaños y formatos de pozo, y muestra que una placa de 10 cm es el entorno ideal para mantener una viabilidad celular óptima, seguida de una placa de 6 pocillos con tres organoides por pocillo34. Los organoides consumen más medios en comparación con sus contrapartes de cultivo bidimensionales, y el uso de un formato de pozo más pequeño no conduce a un mantenimiento adecuado. Por ejemplo, un pocillo de una placa de formato de 96 pocillos no tiene suficiente espacio o volumen de medios en relación con el tamaño de un organoide para sostener el crecimiento del organoide.
Como establecen los organoides, ser observador es importante para aumentar el éxito. Inicialmente, los organoides consumirán medios lentamente, pero a medida que se vuelven más densos y maduros, consumirán medios más rápidamente. Agregar rojo fenol a los medios puede ayudar a servir como un indicador del consumo de medios. Cuando el medio es más amarillo, puede incitar a ajustar el patrón de alimentación, ya sea para intercambiar un mayor volumen de medios, aumentar la cantidad total de medios en la placa, dividir organoides entre múltiples placas de cultivo celular para mantenerse al día con su crecimiento, o incluso ajustar la línea de tiempo para experimentos. 
En muchos sentidos, los organoides son una forma ineficiente de realizar investigaciones sobre el cáncer. Implican escalas de tiempo largas, y son costosos y requieren muchos recursos en comparación con la cultura de la esfera GBM. Sin embargo, en comparación con los xenoinjertos derivados de pacientes, un método alternativo para recrear la diversidad celular y microambiental, son más sencillos, menos costosos y controlables. La selección de cuándo usar mejor los organoides es importante para los investigadores del cáncer. No pretenden reemplazar la esfera tradicional o el cultivo adherente y no reemplazar los modelos de xenoinjerto. Los organoides pueden, cuando se aplican a la pregunta científica correcta, combinar los beneficios de ambos sistemas y pueden permitirnos observar la biología de las células tumorales que de otro modo permanecerían ocultas. La comunidad científica apenas está empezando a comprender qué oportunidades de aprendizaje ofrecen los organoides, pero está claro que serán una herramienta invaluable en el futuro para comprender la compleja biología del GBM.

El glioblastoma (GBM) es el tumor cerebral primario más común con un pronóstico sombrío de aproximadamente 15 meses desde el diagnóstico1. Los tratamientos que son efectivos en los estudios preclínicos a menudo pueden ser poco efectivos en pacientes 2,3. La respuesta clínica deficiente se atribuye a muchos factores, incluida la heterogeneidad microambiental del GBM y las complejas interacciones intratumorales. Estos pueden ser difíciles de recrear en el entorno de laboratorio con métodos tradicionales de cultivo adherente o de esfera4. La presencia de un subconjunto de células madre cancerosas autorrenovadoras (CSC) dentro del GBM también puede contribuir a esta complejidad 5,6. Las CSC son cruciales para la propagación tumoral y mantienen el crecimiento tumoral al promover la angiogénesis activa, la invasión del cáncer y la resistencia a terapias que incluyen radiación 7,8,9. Las CSC no se distribuyen uniformemente a través de los tumores, sino que se enriquecen dentro de microambientes específicos, incluyendo el nicho perivascular y las regiones perinecróticas, que proporcionan una regulación molecular distinta de sus estados celulares 10,11,12,13,14. Las CSC no son receptoras pasivas de señales microambientales, sino que poseen la capacidad de remodelar sus propios microambientes 7,15,16. El microambiente de una CSC puede promover el mantenimiento del estado de las células madre en respuesta a presiones como la escasez de nutrientes, el pH y la hipoxia17,18,19,20, lo que sugiere la importancia de estas condiciones en un sistema modelo. Por lo tanto, la recapitulación del microambiente celular diverso dentro de los tumores es fundamental para comprender la resistencia terapéutica e identificar nuevas terapias.
La cultura tridimensional ha aumentado en popularidad en los últimos años21,22. Los organoides se han utilizado en otros tipos de cáncer, y el objetivo principal de mantener las células como organoides es permitir el crecimiento de poblaciones celulares heterogéneas (muchas de las cuales normalmente pueden ser superadas en un cultivo de esfera más homogénea) y diversidad espacial, vista como microambientes tumorales regionales con especificidad genética 4,23,24,25,26 . Existen muchos métodos para el cultivo tridimensional de células cancerosas, cada uno de los cuales tiene ventajas y desventajas27,28,29. El cultivo de organoides no pretende ser un reemplazo para el adherente tradicional o el cultivo de esfera. Se utiliza mejor como una técnica complementaria a los métodos bidimensionales cuando hay preguntas específicas donde la interacción entre el microambiente celular y las respuestas de las células tumorales es crítica.
Este artículo describe métodos confiables y repetibles para generar organoides GBM a partir de muestras primarias de pacientes o cultivos derivados de pacientes. Abordamos dos objetivos diferentes para el cultivo de organoides tridimensionales: (1) establecer organoides a partir de tejido primario del paciente, con un potencial de injerto máximo independientemente de la uniformidad, o (2) cultivar organoides uniformes para un uso experimental más cuantitativo. Al establecer una muestra primaria como organoides, no es necesario filtrar por células individuales o contar células, porque mantener el número máximo de células y tipos para establecer el cultivo inicial es una prioridad. Sin embargo, cuando se cultivan organoides para experimentos comparativos, se necesita filtración y recuento de células individuales para garantizar que los organoides replicados sean comparables para la consistencia experimental. Este protocolo detalla cómo establecer cultivos de organoides y crear organoides uniformes, así como métodos refinados para incrustar y preservar organoides y experimentos de cultivo celular estándar, incluida la inmunohistoquímica, la inmunofluorescencia y la evaluación de la viabilidad celular total en organoides GBM.

<table><tbody><tr><td>Comprimidos de 3,3-diaminobenzidina (DAB)</td><td>MP Biomedicals</td><td>08980681</td><td>comprimidos de 3,3-diaminobenzidina (DAB) Placas de</td></tr><tr><td>PCR de 96 pocillos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Placas de PCR de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SCR005</td><td>Solución de desprendimiento de células</td></tr><tr><td>Antibiótico-antimicótico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Suplemento antibiótico-antimicótico</td></tr><tr><td>B-27 sin vitamina A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12587001</td><td>Suplemento B-27 sin vitamina A (50x)</td></tr><tr><td>GelCode Reactivo de tinción azul</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>24590</td><td>Reactivo azulado</td></tr><tr><td>Colador de células (70 & micro; m)</td><td>CellTreat Scientific 229483</td><td></td><td>Filtro de células (70 y micro; m)</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>Ensayo de viabilidad celular luminiscente</td></tr><tr><td>Clarificador 2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>7301</td><td>Reactivo clarificante de hematoxilina nuclear</td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>6901</td><td>sustituto de xileno</td></tr><tr><td>Epredia Gill 2 Hematoxilina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>72504</td><td>Hematoxilina</td></tr><tr><td>Glutamina en 0,85% NaCl</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Glutamina en NaCl al 0,85% (200 mM)</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>354234</td><td>Matriz extracelular enriquecida con laminina</td></tr><tr><td>Mini bolígrafo PAP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>008877</td><td>Lápiz de barrera hidrofóbica</td></tr><tr><td>Medio de montaje</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-050-102</td><td>Medio de montaje</td></tr><tr><td>Neurobasal medios menos rojo de fenol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12349015</td><td>Neurobasal medios menos rojo de fenol (500 mL)</td></tr><tr><td>Suero de burro normal (NDS)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Suero de burro normal (NDS)</td></tr><tr><td>Paraformaldehído 4% en PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td>Paraformaldehído 4% en PBS</td></tr><tr><td>Rojo de fenol</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Rojo de fenol (0.5%)</td></tr><tr><td>ProLong Gold Mountant Antidecoloración con DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10144</td><td>Mountant de curado líquido</td></tr><tr><td>Proteína EGF humana recombinante</td><td>R& Sistemas D</td><td>236-EG-01M Proteína</td><td>EGF humana recombinante (250 & g/mL)</td></tr><tr><td>FGF humano recombinante básico</td><td>R& Sistemas</td><td>D 4144-TC-01</td><td>FGF humano recombinante básico (250 &micro; g/mL)</td></tr><tr><td>SignalStain Diluyente de anticuerpo</td><td>Señalización celular</td><td>8112</td><td>Diluyente de anticuerpos</td></tr><tr><td>SignalStain Boost Reactivo de detección de IHC</td><td>Señalización celular</td><td>8114</td><td>Reactivo de detección de inmunohistoquímica</td></tr><tr><td>SignalStain Citrato Solución de desenmascaramiento</td><td>Señalización</td> celular <td>14746</td><td>Solución de desenmascaramiento de citrato</td></tr><tr><td>Hoja de afeitar de un solo filo</td><td>Uline</td><td>H-595B</td><td>Un solo filo cuchilla de afeitar</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td><td>Piruvato de sodio (100 mM)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomolds</td><td>VWR</td><td>25608-916</td><td>Criomoldes desechables</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Temperatura de corte óptima compuesto</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Stain ThermoFisher Scientific</td><td>T10282</td><td>Cell Mancha impermeada (0,4%)</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td>Xileno</td></tr></tbody></table>

mantenimiento de la diversidad celular del glioblastoma humano ex vivo mediante cultivo de organoides tridimensionales

Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture

El glioblastoma (GBM) es el cáncer cerebral maligno primario más común con un pronóstico extremadamente malo. La diversidad celular y molecular intratumoral, así como las interacciones complejas entre microambientes tumorales, pueden hacer que encontrar tratamientos efectivos sea un desafío. Los métodos tradicionales de cultivo adherente o de esfera pueden enmascarar tales complejidades, mientras que el cultivo de organoides tridimensionales puede recapitular gradientes microambientales regionales. Los organoides son un método de cultivo tridimensional de GBM que imita mejor la arquitectura tumoral del paciente, contiene poblaciones celulares fenotípicamente diversas y se puede usar para experimentos de rendimiento medio. Aunque el cultivo de organoides tridimensionales es más laborioso y requiere más tiempo en comparación con el cultivo tradicional, ofrece beneficios únicos y puede servir para cerrar la brecha entre los sistemas actuales in vitro e in vivo . Los organoides se han establecido como herramientas invaluables en el arsenal de los biólogos del cáncer para comprender mejor el comportamiento tumoral y los mecanismos de resistencia, y sus aplicaciones solo continúan creciendo. Aquí, se proporcionan detalles sobre los métodos para generar y mantener organoides GBM. También se describen las instrucciones de cómo realizar la incrustación y seccionamiento de muestras de organoides utilizando técnicas de incrustación de parafina y congeladas, así como recomendaciones para protocolos de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia en secciones de organoides, y medición de la viabilidad total de células organoides.

La Figura 1 muestra el crecimiento temprano de organoides visto a través de microscopía óptica con un aumento de 10x. La Figura 1A muestra la migración e invasión de celdas individuales a través de lrECM en la vista central. Las células continuarán expandiéndose y "colonizando" el lrECM, y aparecerán más densas y eventualmente opacas mediante inspección visual. La Figura 1B muestra varios organoides maduros (a las 7 semanas) sin aumento, en relación con el tamaño de una moneda de diez centavos.
La Figura 2 demuestra la tinción inmunohistoquímica de los organoides GBM para la fosfohistona H3, un marcador de proliferación activa. La mayoría de las células altamente proliferativas se ven en el perímetro del organoide en comparación con el núcleo del organoide. La tinción positiva tendrá una apariencia marrón / cobriza.
La Figura 3 describe el proceso para homogeneizar y medir el número total de células en organoides GBM utilizando un ensayo de viabilidad celular luminiscente específico en 3D. Debido al alto número de células presentes en los organoides GBM, la estructura organoide más grande se homogeneiza inicialmente mediante trituración en reactivo de ensayo luminiscente. Luego, las fracciones del lisado organoide total se cargan en pocillos individuales y se diluyen con un reactivo de ensayo luminiscente adicional antes de la incubación y la lectura en un lector de placas de múltiples pocillos apropiado.
La Figura 4 representa los datos de control DMSO (vehículo común) para organoides. Los datos trazados demuestran consistencia intraorganoide e interorganoide. Los datos de viabilidad luminiscente normalmente se normalizarán a los controles para cada espécimen al generar datos experimentales.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig01.jpg"> Figura 1: Vista a través de un microscopio óptico (10x). (A) Crecimiento temprano de organoides que demuestra la migración/invasión de células GBM a través de la matriz extracelular rica en laminina. (B) Organoides maduros en relación con el tamaño de una moneda de diez centavos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig02.jpg"> Figura 2: Inmunohistoquímica de organoides GBM . (A, B) Organoides GBM que muestran células teñidas con fosfohistona H3 para la proliferación activa. Las barras de escala son de 600 μm y 300 μm para A y B, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig03.jpg"> Figura 3: Protocolo de viabilidad celular luminiscente para organoides. (A) Mover organoides individuales a pequeños tubos de centrífuga y eliminar el exceso de medios. (B) Añadir 500 μL de PBS 1:1 y mezcla de ensayo de viabilidad celular luminiscente a cada tubo y pipetear agresivamente para descomponer el organoide. (C) Añadir 25 μL de esta mezcla de organoides y 75 μL de la misma mezcla de 1:1 PBS y ensayo de viabilidad celular luminiscente a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. (D) Coloque en un agitador durante 2 minutos, seguido de la incubación durante 20 minutos en RT, y luego lea la luminiscencia en un lector de placas. Figura hecha usando BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63745/63745fig04.jpg"> Figura 4: Viabilidad celular. Datos de viabilidad celular para organoides en dimetilsulfóxido (DMSO) al 0,1% para seis réplicas técnicas de cuatro organoides para cuatro muestras de pacientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63745/63745fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componente</td>
			<td>Cantidad</td>
		</tr><tr><td>Medio neurobasal menos rojo fenol</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr><tr><td>Suplemento B-27 menos vitamina A (50x)</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td>Antibiótico-antimicótico (100x)</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Pirugranato de sodio (100 mM)</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Glutamina en NaCl al 0,85% (200 mM)</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>FGF humano recombinante básico (250 μg/mL)</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>Proteína EFG humana recombinante (250 μg/mL)</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr><tr><td>Rojo fenol</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Formulación del medio neurobasal completo (NBMc)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reactivo</td>
			<td>Hora</td>
		</tr><tr><td>50% Etanol</td>
			<td>3 minutos</td>
		</tr><tr><td>75% Etanol</td>
			<td>3 minutos</td>
		</tr><tr><td>95% Etanol</td>
			<td>3 minutos</td>
		</tr><tr><td>95% Etanol</td>
			<td>4 minutos</td>
		</tr><tr><td>100% Etanol</td>
			<td>2 minutos</td>
		</tr><tr><td>100% Etanol</td>
			<td>3 minutos</td>
		</tr><tr><td>100% Etanol</td>
			<td>4 minutos</td>
		</tr><tr><td>Sustituto de xileno</td>
			<td>2 minutos</td>
		</tr><tr><td>Sustituto de xileno</td>
			<td>3 minutos</td>
		</tr><tr><td>Sustituto de xileno</td>
			<td>4 minutos</td>
		</tr><tr><td>Parafina</td>
			<td>15 minutos</td>
		</tr><tr><td>Parafina</td>
			<td>15 minutos</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Calendario de procesamiento para organoides pequeños (menos de 3 mm de diámetro)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reactivo</td>
			<td>Hora</td>
		</tr><tr><td>50% Etanol</td>
			<td>6 minutos</td>
		</tr><tr><td>75% Etanol</td>
			<td>6 minutos</td>
		</tr><tr><td>95% Etanol</td>
			<td>5 minutos</td>
		</tr><tr><td>95% Etanol</td>
			<td>8 minutos</td>
		</tr><tr><td>100% Etanol</td>
			<td>5 minutos</td>
		</tr><tr><td>100% Etanol</td>
			<td>5 minutos</td>
		</tr><tr><td>100% Etanol</td>
			<td>8 minutos</td>
		</tr><tr><td>Sustituto de xileno</td>
			<td>5 minutos</td>
		</tr><tr><td>Sustituto de xileno</td>
			<td>5 minutos</td>
		</tr><tr><td>Sustituto de xileno</td>
			<td>8 minutos</td>
		</tr><tr><td>Parafina</td>
			<td>30 minutos</td>
		</tr><tr><td>Parafina</td>
			<td>30 minutos</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 3: Calendario de procesamiento para organoides grandes (más de 3 mm de diámetro)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reactivo</td>
			<td>Hora</td>
		</tr><tr><td>Hematoxilina</td>
			<td>2 minutos</td>
		</tr><tr><td>Corriendo diH2O</td>
			<td>2 minutos</td>
		</tr><tr><td>Reactivo clarificante de hematoxilina nuclear</td>
			<td>1 minuto</td>
		</tr><tr><td>Corriendo diH2O</td>
			<td>1 minuto</td>
		</tr><tr><td>Reactivo de azulado</td>
			<td>1 minuto</td>
		</tr><tr><td>Corriendo diH2O</td>
			<td>2 minutos</td>
		</tr><tr><td>70% etanol</td>
			<td>1 minuto</td>
		</tr><tr><td>100% etanol</td>
			<td>1 minuto</td>
		</tr><tr><td>100% etanol</td>
			<td>1 minuto</td>
		</tr><tr><td>Sustituto de xileno</td>
			<td>2 minutos</td>
		</tr><tr><td>Sustituto de xileno</td>
			<td>2 minutos</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 4: Contratinción de hematoxilina

Aquí, describimos un método para generar organoides de glioblastoma (GBM) a partir de muestras primarias de pacientes o cultivos celulares derivados de pacientes y mantenerlos hasta la madurez. Estos organoides GBM contienen poblaciones celulares fenotípicamente diversas y recrean microambientes tumorales ex vivo.

Mantenimiento de la diversidad celular del glioblastoma humano ex vivo mediante cultivo de organoides tridimensionales

Glioblastoma (GBM) is the most commonly occurring primary malignant brain cancer with an extremely poor prognosis. Intra-tumoral cellular and molecular ...

Encontrar tratamientos para el glioblastoma es un desafío debido a la diversidad celular que existe en los tumores y las interacciones entre diversos microambientes. Los organoides pueden ayudar a recrear parte de esa diversidad espacial, y podemos usar esto para comprender mejor la biología de los tumores. Mientras que los métodos tradicionales de cultivo celular tienden a producir poblaciones homogéneas de células tumorales, los organoides pueden imitar mejor la diversidad molecular y celular del glioblastoma y modelar mejor las interacciones intratumorales.Los organoides se pueden utilizar para investigar la eficacia de los fármacos y los mecanismos de resistencia. La resistencia a las terapias clínicas sólo puede aparecer en organoides y no en la cultura de la esfera tradicional, reflejando la realidad clínica de esta enfermedad. Los organoides pueden ayudar a demostrar los efectos regionales de las quimioterapias.Se pueden utilizar para descubrir nuevas terapias específicas de nicho, y también pueden actuar como una herramienta predictiva para la medicina personalizada en el futuro. Algunos materiales utilizados para crear organoides son sensibles a la temperatura, y descuidar mantener estos materiales a su temperatura adecuada puede llevar a dificultades para crear o mantener organoides. Comience a preparar los moldes organoides bajo una campana de cultivo quitando el papel encerado de la hoja de parafilm y colocándolo entre dos placas estériles de reacción en cadena de polimerasa de 96 pocillos o PCR.Asegúrese de que el interior del parafilm esté limpio. Aplique una presión uniforme a la placa superior para formar pequeños hoyuelos de dos milímetros de profundidad en la parapelícula sin crear agujeros. Separe las placas.El parafilm con hoyuelos se pegará a la placa superior. Luego coloque la placa superior en hielo seco durante 30 segundos. Use pinzas estériles para extraer el parafilm de la placa superior con un movimiento rápido.El parafilm congelado es más fácil de eliminar. Coloque el molde de parafilm completo en una placa de cultivo celular estéril de 10 centímetros cubierta. Para preparar la suspensión unicelular a partir de glioblastoma o cultivo adherente de GBM, retire los medios usados de la placa.Luego agregue dos mililitros de solución de desprendimiento celular a temperatura ambiente a la placa e incube la placa a 37 grados durante tres minutos. Después de confirmar el desprendimiento celular de la placa bajo el microscopio, agregue ocho mililitros de medio neurobasal completo, o medio NBMc, para neutralizar la solución de desprendimiento celular. Colar la suspensión a través de un solo filtro de células de 70 micras.Haga girar las celdas a 120 veces G durante cinco minutos. Luego retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un mililitro de NBMc. Cuente las células de la suspensión de una sola celda usando una mancha impermeable de celda.Para hacer organoides a partir de una suspensión de una sola célula, agregue una cantidad adecuada de matriz extracelular rica en laminina, o lrECM, en un pequeño tubo de centrífuga en un cubo de hielo o bloque frío. Prepare una mezcla celular que contenga 20, 000 células por organoide. Mezcle bien la mezcla de suspensión celular lrECM para evitar que las células se sedimenten, lo que daría lugar a una formación de organoides no uniforme.A continuación, pipetear cuidadosamente 20 microlitros de la mezcla en un molde de parafilm para formar una gota similar a una perla. Asegúrese de enfriar la punta de la pipeta cada dos o tres organoides para evitar la polimerización lrECM. Una vez que el número deseado de organoides se pipetea en el molde de parafilm en una placa de cultivo de 10 centímetros, incubar los organoides a 37 grados centígrados durante una o dos horas en una incubadora de cultivo celular.Después de que los organoides se solidifiquen, enjuague suavemente los organoides del molde de parafilm con medio NBMc usando una punta P1000 y recójalos en una nueva placa de cultivo de 10 centímetros que contenga 20 mililitros de NBMc. Coloque la placa de cultivo en una incubadora sin agitar durante cuatro días. Después de cuatro días, reemplace el medio en la placa.Para hacer esto, coloque un pedazo de papel oscuro debajo de la placa de cultivo celular. Incline el plato y espere 20 segundos. A medida que los organoides se asienten completamente en el fondo del plato, retire lentamente el medio con una pipeta de vidrio de gran apertura.Después de agregar nuevos medios, coloque la placa en la incubadora en un agitador orbital a 80 RPM e intercambie los medios cada dos o tres días a partir de entonces. El crecimiento del organoide se observó mediante microscopía óptica. En la vista central, el crecimiento temprano de organoides mostró migración e invasión unicelular a través de lrECM.Los organoides maduros a las siete semanas eran relativos al tamaño de una moneda de diez centavos. La tinción inmunohistoquímica de los organoides GBM con fosfohistona H3 reveló células altamente proliferativas con una apariencia marrón o púrpura en el perímetro organoide en comparación con el núcleo. Los datos de viabilidad celular para organoides en 0,1% DMSO demostraron consistencia intraorganoide e interorganoide.Preste atención a la biomasa organoide y la acidificación de los medios. Si los organoides atraviesan los medios demasiado rápido, asegúrese de intercambiar los medios con más frecuencia o dividir los organoides entre placas adicionales. Los organoides maduros se pueden usar para experimentos con terapias o incrustados y seccionados para su uso con inmunohistoquímica o inmunofluorescencia.Los organoides disociados se pueden utilizar para el análisis de FACS. Estos organoides se utilizaron recientemente en la detección funcional tridimensional para descubrir objetivos esenciales en nichos de células madre cancerosas espacialmente distintos. También estamos utilizando estos modelos para priorizar diferentes medicamentos y terapias antes de las pruebas in vivo.

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