Mantenimiento de la diversidad celular del glioblastoma humano ex vivo mediante cultivo de organoides tridimensionales

Encontrar tratamientos para el glioblastoma es un desafío debido a la diversidad celular que existe en los tumores y las interacciones entre diversos microambientes. Los organoides pueden ayudar a recrear parte de esa diversidad espacial, y podemos usar esto para comprender mejor la biología de los tumores. Mientras que los métodos tradicionales de cultivo celular tienden a producir poblaciones homogéneas de células tumorales, los organoides pueden imitar mejor la diversidad molecular y celular del glioblastoma y modelar mejor las interacciones intratumorales.

Los organoides se pueden utilizar para investigar la eficacia de los fármacos y los mecanismos de resistencia. La resistencia a las terapias clínicas sólo puede aparecer en organoides y no en la cultura de la esfera tradicional, reflejando la realidad clínica de esta enfermedad. Los organoides pueden ayudar a demostrar los efectos regionales de las quimioterapias.

Se pueden utilizar para descubrir nuevas terapias específicas de nicho, y también pueden actuar como una herramienta predictiva para la medicina personalizada en el futuro. Algunos materiales utilizados para crear organoides son sensibles a la temperatura, y descuidar mantener estos materiales a su temperatura adecuada puede llevar a dificultades para crear o mantener organoides. Comience a preparar los moldes organoides bajo una campana de cultivo quitando el papel encerado de la hoja de parafilm y colocándolo entre dos placas estériles de reacción en cadena de polimerasa de 96 pocillos o PCR.

Asegúrese de que el interior del parafilm esté limpio. Aplique una presión uniforme a la placa superior para formar pequeños hoyuelos de dos milímetros de profundidad en la parapelícula sin crear agujeros. Separe las placas.

El parafilm con hoyuelos se pegará a la placa superior. Luego coloque la placa superior en hielo seco durante 30 segundos. Use pinzas estériles para extraer el parafilm de la placa superior con un movimiento rápido.

El parafilm congelado es más fácil de eliminar. Coloque el molde de parafilm completo en una placa de cultivo celular estéril de 10 centímetros cubierta. Para preparar la suspensión unicelular a partir de glioblastoma o cultivo adherente de GBM, retire los medios usados de la placa.

Luego agregue dos mililitros de solución de desprendimiento celular a temperatura ambiente a la placa e incube la placa a 37 grados durante tres minutos. Después de confirmar el desprendimiento celular de la placa bajo el microscopio, agregue ocho mililitros de medio neurobasal completo, o medio NBMc, para neutralizar la solución de desprendimiento celular. Colar la suspensión a través de un solo filtro de células de 70 micras.

Haga girar las celdas a 120 veces G durante cinco minutos. Luego retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un mililitro de NBMc. Cuente las células de la suspensión de una sola celda usando una mancha impermeable de celda.

Para hacer organoides a partir de una suspensión de una sola célula, agregue una cantidad adecuada de matriz extracelular rica en laminina, o lrECM, en un pequeño tubo de centrífuga en un cubo de hielo o bloque frío. Prepare una mezcla celular que contenga 20, 000 células por organoide. Mezcle bien la mezcla de suspensión celular lrECM para evitar que las células se sedimenten, lo que daría lugar a una formación de organoides no uniforme.

A continuación, pipetear cuidadosamente 20 microlitros de la mezcla en un molde de parafilm para formar una gota similar a una perla. Asegúrese de enfriar la punta de la pipeta cada dos o tres organoides para evitar la polimerización lrECM. Una vez que el número deseado de organoides se pipetea en el molde de parafilm en una placa de cultivo de 10 centímetros, incubar los organoides a 37 grados centígrados durante una o dos horas en una incubadora de cultivo celular.

Después de que los organoides se solidifiquen, enjuague suavemente los organoides del molde de parafilm con medio NBMc usando una punta P1000 y recójalos en una nueva placa de cultivo de 10 centímetros que contenga 20 mililitros de NBMc. Coloque la placa de cultivo en una incubadora sin agitar durante cuatro días. Después de cuatro días, reemplace el medio en la placa.

Para hacer esto, coloque un pedazo de papel oscuro debajo de la placa de cultivo celular. Incline el plato y espere 20 segundos. A medida que los organoides se asienten completamente en el fondo del plato, retire lentamente el medio con una pipeta de vidrio de gran apertura.

Después de agregar nuevos medios, coloque la placa en la incubadora en un agitador orbital a 80 RPM e intercambie los medios cada dos o tres días a partir de entonces. El crecimiento del organoide se observó mediante microscopía óptica. En la vista central, el crecimiento temprano de organoides mostró migración e invasión unicelular a través de lrECM.

Los organoides maduros a las siete semanas eran relativos al tamaño de una moneda de diez centavos. La tinción inmunohistoquímica de los organoides GBM con fosfohistona H3 reveló células altamente proliferativas con una apariencia marrón o púrpura en el perímetro organoide en comparación con el núcleo. Los datos de viabilidad celular para organoides en 0,1% DMSO demostraron consistencia intraorganoide e interorganoide.

Preste atención a la biomasa organoide y la acidificación de los medios. Si los organoides atraviesan los medios demasiado rápido, asegúrese de intercambiar los medios con más frecuencia o dividir los organoides entre placas adicionales. Los organoides maduros se pueden usar para experimentos con terapias o incrustados y seccionados para su uso con inmunohistoquímica o inmunofluorescencia.

Los organoides disociados se pueden utilizar para el análisis de FACS. Estos organoides se utilizaron recientemente en la detección funcional tridimensional para descubrir objetivos esenciales en nichos de células madre cancerosas espacialmente distintos. También estamos utilizando estos modelos para priorizar diferentes medicamentos y terapias antes de las pruebas in vivo.