Una detección multiplexada de alto rendimiento para diabetes tipo 1, enfermedades celíacas y COVID-19
5 de julio de 2022
En línea con la necesidad urgente de detección de diabetes tipo 1, enfermedad celíaca y enfermedad por coronavirus 2019, desarrollamos un ensayo de electroquimioluminiscencia 6-Plex de alto rendimiento para detectar simultáneamente los cuatro autoanticuerpos de los islotes, los autoanticuerpos de transglutaminasa tisular y los anticuerpos contra el dominio de unión al receptor del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo.
El novedoso ensayo 6-Plex ECL es el primer ensayo multiplex validado y ahora aplicado en un ensayo clínico para el cribado de la población general. Combina simultáneamente seis ensayos de autoanticuerpos adecuados para detectar la diabetes tipo 1, la enfermedad celíaca y COVID-19 en una gran población. En comparación con el ensayo de autoanticuerpos estándar actual, esta técnica puede detectar de manera más eficiente múltiples autoanticuerpos para múltiples enfermedades autoinmunes simultáneamente.
La implicación de esta técnica hará que el cribado a gran escala sea más factible y específico de la enfermedad, lo que conducirá a la predicción temprana de la enfermedad para la prevención y un diagnóstico más preciso para la terapia. Para comenzar, agregue cuatro microlitros de GAD65 biotinilada, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 y proteína antígeno de proinsulina en un tubo que contenga 156 microlitros de BSA al 1% y mezcle con 240 microlitros de los enlazadores conjugados con estreptavidina correspondientes, 1, 2, 3, 8, 9 y 10. Luego, incubar la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Alícuota 160 microlitros de solución de parada en cada tubo e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. Ahora, tome 400 microlitros de la solución de mezcla de cada tubo y combínelos. Agregue cuatro microlitros de GAD65 marcado con rutenio, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 y antígeno de proinsulina a la mezcla.
Luego, agregue 1.6 mililitros de solución de parada y 3.2 mililitros de PBS. Mezcle bien todos los componentes. Y ahora, la solución de antígeno está lista para su uso en el ensayo.
Para una placa de PCR de 96 pocillos, alícuota siete microlitros de suero por pocillo y cubra la placa con una película de sellado. A continuación, precaliente el suero a 56 grados centígrados durante 30 minutos en una máquina de PCR y centrifugue brevemente la placa a 100 veces G durante un minuto. Agregue 63 microlitros de solución de antígeno preparada por pocillo, mezcle con los sueros y cubra la placa de PCR con una lámina de sellado para evitar la luz.
Agite el plato en un agitador a una velocidad de 450 rpm durante dos horas a temperatura ambiente. Y luego, incubar el plato a cuatro grados centígrados durante 18 a 24 horas. Tome un plato 6-Plex del refrigerador de cuatro grados centígrados, permitiendo que el plato alcance la temperatura ambiente.
Luego, agregue 150 microlitros de 3%Blocker A a cada pocillo de la placa 6-Plex. Cubra la placa con papel de aluminio para evitar la luz. Vuelva a colocar el plato en un refrigerador de cuatro grados centígrados e incube durante la noche.
Al final de la incubación, una vez que la placa se retire del refrigerador, retire todo el amortiguador de la placa. Dé palmaditas en el plato en las toallas de papel para que se sequen, y lávelo tres veces con 150 microlitros de tampón de lavado por pocillo cada vez. Seque la placa en la toalla de papel y alícuota 30 microlitros de antígeno sérico incubar de cada pocillo de la placa de PCR de incubación durante la noche en dos pocillos de la placa 6-Plex.
Cubra el plato con papel de aluminio, luego coloque el plato en un agitador de platos y agite a una velocidad de 450 rpm a temperatura ambiente durante una hora. Vierta la solución presente en la placa 6-Plex y lave la placa tres veces con 150 microlitros de tampón de lavado de cloruro de sodio 0.4 M por pocillo. Después de completar el tercer lavado, seque el plato contra la toalla de papel y agregue 150 microlitros de tampón de lectura en cada pocillo.
Los niveles de seis autoanticuerpos para GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA y COVID-19A del ensayo ECL 6-Plex se correlacionaron bien con sus correspondientes seis ensayos ECL únicos y el ensayo de unión radioeléctrica estándar actual. Los valores índice para cada muestra para los seis anticuerpos se calcularon contra los controles positivos y negativos correspondientes. Se observó un valor de índice mayor que el valor de corte, lo que indicó un resultado positivo.
Los autoanticuerpos en suero rompieron el antígeno marcado con rutenio al antígeno biotinilado, formando un complejo con un enlazador específico para construir una plataforma de multiplexación. Esta táctica hace que la detección a gran escala sea más factible y más eficiente en la población general para la diabetes tipo uno y las enfermedades concomitantes, lo que lleva a la predicción temprana y la prevención de las enfermedades.
Descripción general
Este estudio presenta un nuevo ensayo electroquimioluminiscente 6-Plex diseñado para la detección simultánea de autoanticuerpos relacionados con la diabetes tipo 1, la enfermedad celíaca y la COVID-19. El ensayo tiene como objetivo mejorar la eficiencia del cribado a gran escala para estas enfermedades autoinmunes.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Autoinmunidad
- Diagnóstico clínico
- Ensayos de electroquimioluminiscencia
Antecedentes
- La diabetes tipo 1 y la enfermedad celíaca son trastornos autoinmunes que requieren detección temprana.
- La COVID-19 ha introducido nuevos desafíos en el cribado de enfermedades autoinmunes.
- Los métodos actuales de cribado suelen ser ineficientes y consumen mucho tiempo.
- Los ensayos multiplex pueden mejorar las capacidades de cribado al permitir la detección simultánea de múltiples anticuerpos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un ensayo de alto rendimiento para la detección simultánea de múltiples autoanticuerpos.
- Validar el ensayo para su uso en ensayos clínicos.
- Facilitar la predicción y prevención temprana de enfermedades.
Métodos Utilizados
- Preparación de soluciones de antígenos utilizando proteínas biotiniladas y marcadas con rutenio.
- Incubación de muestras de suero con soluciones de antígenos preparadas.
- Uso de una placa de PCR de 96 pocillos para el procesamiento de muestras.
- Correlación de los resultados con ensayos estándar para validar el enfoque multiplex.
Resultados principales
- El ensayo ECL de 6 plexes demostró una fuerte correlación con los ensayos tradicionales individuales.
- Los valores de índice indicaron resultados positivos para autoanticuerpos en muestras de suero.
- El ensayo permite un cribado eficiente de múltiples enfermedades autoinmunes.
- Los resultados respaldan la factibilidad del cribado poblacional a gran escala.
Conclusiones
- El ensayo ECL de 6 plex es una herramienta prometedora para la detección temprana de enfermedades autoinmunes.
- Este método mejora la eficiencia de los procesos de cribado.
- Tiene potencial para mejorar los resultados en pacientes mediante la intervención temprana.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El ensayo ECL validado de 6 plex permite la detección multiplex de alto rendimiento de autoanticuerpos para la diabetes tipo 1, la enfermedad celíaca y la COVID-19, atendiendo la necesidad de cribado poblacional eficiente y específico para cada enfermedad. Esta plataforma mejora la confianza predictiva en el punto de inflexión más temprano del continuo desde el descubrimiento hasta el diagnóstico, apoyando decisiones de cartera ajustadas al riesgo en la investigación de enfermedades autoinmunitarias e infecciosas. Su adopción como herramienta principal de cribado demuestra un impacto a nivel empresarial en los flujos de trabajo traslacionales y preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación simultánea de múltiples dianas autoinmunes y virales en un solo formato de ensayo.
- Mejora la reducción del riesgo biológico al distinguir perfiles de autoanticuerpos específicos de la enfermedad.
- Apoya la confianza predictiva para estrategias de predicción y prevención temprana de enfermedades.
- Facilita la selección de carteras al proporcionar lecturas cuantitativas multiplexadas para la validación de dianas.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Prepara sistemas multiplex validados para cribados posteriores y flujos de trabajo de biomarcadores.
- Normaliza las condiciones del ensayo para garantizar la reproducibilidad y la comparabilidad cuantitativa entre muestras.
- Permite el cribado escalable y de alto rendimiento con requisitos mínimos de volumen de suero.
- Posibilita la evaluación confiable de los efectos de compuestos o intervenciones sobre múltiples biomarcadores relevantes para la enfermedad.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con estrategias de biomarcadores relevantes para enfermedades, garantizando continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación clínica.
- Proporciona resultados cuantitativos que orientan decisiones de avance ajustadas al riesgo en fases preclínicas.
- Mejora la reducción predictiva de riesgos al correlacionar perfiles multiplexados de autoanticuerpos con el inicio y progresión de la enfermedad.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo ECL 6-Plex se integra en la interfaz entre el descubrimiento temprano, la identificación de fármacos prometedores y la investigación traslacional, permitiendo una progresión fluida desde la prueba de hipótesis hasta la validación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya pruebas sólidas de hipótesis y la clarificación de vías mediante la detección multiplexada de autoanticuerpos.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles adecuados para entornos de selección de alto rendimiento.
- Análisis: Ofrece valores de índice y puntos de decisión basados en umbrales para la comparación entre condiciones y el análisis estadístico.
- Investigación Traslacional: Conecta el descubrimiento con la validación clínica al alinear la detección de biomarcadores con puntos finales relevantes a la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable y escalable para futuras iniciativas de selección multiplexada.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en investigaciones tempranas de enfermedades autoinmunitarias e infecciosas.
- Valor operativo: Optimiza los flujos de trabajo mediante la estandarización, la reproducibilidad y la escalabilidad de alto rendimiento.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance o interrupción del desarrollo y una gestión eficiente del portafolio al proporcionar datos multiplexados y accionables.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de candidatos basándose en evidencia robusta y multiplexada de biomarcadores.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el desarrollo de inmunoensayos multiplexados y en la detección mediante electroquimioluminiscencia.
- Exige acceso a instrumentación especializada para lecturas ECL y manejo de placas de alto rendimiento.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de ensayo y las canalizaciones de análisis de datos.
- Puede requerir adaptación para su uso con diferentes tipos de muestras o modelos de enfermedad conforme evolucionen las necesidades del portafolio.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de una validación rigurosa frente a ensayos uniplexados y de unión radiomarcados ya establecidos.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Create Linker‐Coupled Antigen Solution
2:36
Preparation of Antigen Labeled Serum and the 6‐Plex Plate
3:54
Serum/Antigen Incubates Transfer into the 6‐Plex Plate
4:42
Washing the 6‐Plex Plate and Reading Buffer Addition
5:11
Results: Comparison of Antibody Levels Study Between the Single and the 6‐Plex ECL Assay
5:59
Conclusion
