Una detección multiplexada de alto rendimiento para diabetes tipo 1, enfermedades celíacas y COVID-19

En línea con la necesidad urgente de detección de diabetes tipo 1, enfermedad celíaca y enfermedad por coronavirus 2019, desarrollamos un ensayo de electroquimioluminiscencia 6-Plex de alto rendimiento para detectar simultáneamente los cuatro autoanticuerpos de los islotes, los autoanticuerpos de transglutaminasa tisular y los anticuerpos contra el dominio de unión al receptor del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo.

El novedoso ensayo 6-Plex ECL es el primer ensayo multiplex validado y ahora aplicado en un ensayo clínico para el cribado de la población general. Combina simultáneamente seis ensayos de autoanticuerpos adecuados para detectar la diabetes tipo 1, la enfermedad celíaca y COVID-19 en una gran población. En comparación con el ensayo de autoanticuerpos estándar actual, esta técnica puede detectar de manera más eficiente múltiples autoanticuerpos para múltiples enfermedades autoinmunes simultáneamente.

La implicación de esta técnica hará que el cribado a gran escala sea más factible y específico de la enfermedad, lo que conducirá a la predicción temprana de la enfermedad para la prevención y un diagnóstico más preciso para la terapia. Para comenzar, agregue cuatro microlitros de GAD65 biotinilada, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 y proteína antígeno de proinsulina en un tubo que contenga 156 microlitros de BSA al 1% y mezcle con 240 microlitros de los enlazadores conjugados con estreptavidina correspondientes, 1, 2, 3, 8, 9 y 10. Luego, incubar la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Alícuota 160 microlitros de solución de parada en cada tubo e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. Ahora, tome 400 microlitros de la solución de mezcla de cada tubo y combínelos. Agregue cuatro microlitros de GAD65 marcado con rutenio, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 y antígeno de proinsulina a la mezcla.

Luego, agregue 1.6 mililitros de solución de parada y 3.2 mililitros de PBS. Mezcle bien todos los componentes. Y ahora, la solución de antígeno está lista para su uso en el ensayo.

Para una placa de PCR de 96 pocillos, alícuota siete microlitros de suero por pocillo y cubra la placa con una película de sellado. A continuación, precaliente el suero a 56 grados centígrados durante 30 minutos en una máquina de PCR y centrifugue brevemente la placa a 100 veces G durante un minuto. Agregue 63 microlitros de solución de antígeno preparada por pocillo, mezcle con los sueros y cubra la placa de PCR con una lámina de sellado para evitar la luz.

Agite el plato en un agitador a una velocidad de 450 rpm durante dos horas a temperatura ambiente. Y luego, incubar el plato a cuatro grados centígrados durante 18 a 24 horas. Tome un plato 6-Plex del refrigerador de cuatro grados centígrados, permitiendo que el plato alcance la temperatura ambiente.

Luego, agregue 150 microlitros de 3%Blocker A a cada pocillo de la placa 6-Plex. Cubra la placa con papel de aluminio para evitar la luz. Vuelva a colocar el plato en un refrigerador de cuatro grados centígrados e incube durante la noche.

Al final de la incubación, una vez que la placa se retire del refrigerador, retire todo el amortiguador de la placa. Dé palmaditas en el plato en las toallas de papel para que se sequen, y lávelo tres veces con 150 microlitros de tampón de lavado por pocillo cada vez. Seque la placa en la toalla de papel y alícuota 30 microlitros de antígeno sérico incubar de cada pocillo de la placa de PCR de incubación durante la noche en dos pocillos de la placa 6-Plex.

Cubra el plato con papel de aluminio, luego coloque el plato en un agitador de platos y agite a una velocidad de 450 rpm a temperatura ambiente durante una hora. Vierta la solución presente en la placa 6-Plex y lave la placa tres veces con 150 microlitros de tampón de lavado de cloruro de sodio 0.4 M por pocillo. Después de completar el tercer lavado, seque el plato contra la toalla de papel y agregue 150 microlitros de tampón de lectura en cada pocillo.

Los niveles de seis autoanticuerpos para GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA y COVID-19A del ensayo ECL 6-Plex se correlacionaron bien con sus correspondientes seis ensayos ECL únicos y el ensayo de unión radioeléctrica estándar actual. Los valores índice para cada muestra para los seis anticuerpos se calcularon contra los controles positivos y negativos correspondientes. Se observó un valor de índice mayor que el valor de corte, lo que indicó un resultado positivo.

Los autoanticuerpos en suero rompieron el antígeno marcado con rutenio al antígeno biotinilado, formando un complejo con un enlazador específico para construir una plataforma de multiplexación. Esta táctica hace que la detección a gran escala sea más factible y más eficiente en la población general para la diabetes tipo uno y las enfermedades concomitantes, lo que lleva a la predicción temprana y la prevención de las enfermedades.