Name: Descubrir la interacción entre las células asesinas naturales y las neuronas nociceptoras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Descubre cómo estudiar la interacción entre células NK y neuronas nociceptoras mediante un sistema de co-cultivo. Este método revela cómo las neuronas modulan la función antitumoral de las células NK en contextos inflamatorios.

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Este trabajo fue apoyado por The New Frontiers in Research Fund (NFRFE201901326), los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (162211, 461274, 461275), la Fundación Canadiense para la Innovación (37439), el programa de la Cátedra de Investigación de Canadá (950-231859), el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (RGPIN-2019-06824) y el Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380).

Los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Montreal (#22053, #22054) aprobaron todos los procedimientos con animales. Consulte la Tabla 1 para obtener una lista de soluciones y su composición y la Tabla de materiales para obtener una lista de materiales , equipos y reactivos utilizados en este protocolo.
1. Aislamiento, cultivo y estimulación de células NK
<ol><li>Generar neurona nociceptora intacta (control de camada; Ratones TRPV1 wt::D TA fl/wt) y ablacionados (TRPV1 cre::D TA fl/wt) cruzando ratones con toxina lox-stop-lox-diftérica (DTA fl/fl) con ratones TRPV1 cre/wt.</li>
	<li>Usando la inhalación deCO2, eutanasia a un ratón de control de compañero de camada ingenuo (TRPV1 wt: :D TAfl / wt).</li>
	<li>Recoger el bazo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 500 μL de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS).</li>
	<li>Homogeneizar el bazo con un mortero.</li>
	<li>Diluir las células con 1 ml de PBS estéril.</li>
	<li>Filtrar la mezcla a través de un filtro celular de 50 μm en un tubo cónico de 15 ml.</li>
	<li>Rellene el volumen (10 ml) con PBS estéril.</li>
	<li>Recoja 10 μL y cuente las células con un hemocitómetro.</li>
	<li>Centrifugar las células (500 × g, 5 min) y retirar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células a una concentración de 108 células/ml en medio suplementado RPMI 1640.</li>
	<li>Siga las instrucciones del fabricante para purificar magnéticamente las células NK del bazo utilizando un kit de aislamiento de células NK de ratón. Confirmar la pureza de las células NK mediante citometría de flujo11.</li>
	<li>Recoja 10 μL y cuente las células con un hemocitómetro.</li>
	<li>Centrifugar las células (500 × g, 5 min) y retirar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células NK en medio de cultivo RPMI 1640 suplementado (que contiene IL-2 e IL-15).</li>
	<li>Cultivo 2 × 106 células NK/ml en una placa de fondo en U de 96 pocillos durante 48 h.</li>
</ol>2. Aislamiento y cultivo de neuronas DRG
<ol><li>A las 24 h anteriores al final de la estimulación de células NK (paso 1.15), cubrir una placa de 96 pocillos con 100 μL/pocillo de laminina (1 ng/ml) e incubar durante 45 min (37 °C).</li>
	<li>Después de la incubación, retire la solución y deje que los pocillos se sequen al aire en un gabinete de bioseguridad.</li>
	<li>Usando la inhalación deCO2, eutanasia la neurona nociceptora intacta (control de compañero de camada; TRPV1wt::D TA fl/wt) o ratones ablacionados (TRPV1cre::D TAfl/wt). NOTA: La inhalación deCO2 es preferible a la dislocación cervical, ya que evita alterar los nervios espinales conectados a la DRG.</li>
	<li>Asegure el mouse en la tabla en posición prona, levante la piel e incise la piel a lo largo de la columna dorsal. Consulte Perner et al. para un video detallado12.</li>
	<li>Cortar la articulación lumbosacra y separar el sacro de la columna lumbar con tijeras.</li>
	<li>Separe la columna vertebral cortando los músculos y las costillas a ambos lados de la columna vertebral en la dirección craneal hasta que se alcance la base del cráneo.</li>
	<li>Usando tijeras, corte la columna vertebral en la articulación atlanto-occipital.</li>
	<li>Eliminar el músculo y el tejido graso de la columna vertebral.</li>
	<li>Fije y abra la columna vertebral para extirpar la médula espinal y obtener acceso al DRG. Busque el DRG en los agujeros intervertebrales conectados a la médula espinal a través de la raíz dorsal pero separados de las meninges.</li>
	<li>Coseche los DRG en un tubo cónico de 15 ml lleno de 10 ml de DMEM suplementado con hielo frío.</li>
	<li>Centrifugar la preparación (200 × g, 5 min, temperatura ambiente) y retirar el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 250 μL de PBS que contiene colagenasa IV (1 mg/ml) y dispasa II (2,4 U/ml).</li>
	<li>Incubar el DRG con solución de colagenasa IV/Dispasa II (C/D) (80 min, 37 °C, agitación leve). Al agrupar ganglios de varios ratones, mantener una proporción de 125 μL de solución C / D por ganglio.</li>
	<li>Para inactivar las enzimas, agregue 5 ml de medio DMEM suplementado.</li>
	<li>Centrifugar la solución (200 × g, 5 min) y retirar suavemente el sobrenadante con una pipeta.</li>
	<li>Para evitar la pérdida celular no deseada, deje ~ 100 μL del sobrenadante.</li>
	<li>Agregue 1 ml de medio DMEM suplementado.</li>
	<li>Con una pistola de pipeta y tres pipetas Pasteur de vidrio de tamaños decrecientes, triture suavemente (~10 arriba/abajo por tamaño de pipeta Pasteur) el DRG en una preparación de una sola celda.</li>
	<li>En un gabinete de bioseguridad, diluir la albúmina sérica bovina (BSA) en PBS estéril hasta una concentración final del 15%. Conservar 1 ml de alícuotas a −20 °C.</li>
	<li>Cree un gradiente de BSA en un tubo cónico de 15 ml agregando 2 ml de PBS estéril y dispensando lentamente 1 ml de solución de BSA al 15% en la parte inferior del tubo. Evite interrumpir el gradiente retirando suavemente la pipeta.</li>
	<li>Con una pipeta P200, pipetea lentamente la suspensión de ganglios triturados (que contiene las neuronas) hacia el lado del tubo en el gradiente.</li>
	<li>Centrifugar el gradiente BSA que contiene neuronas (200 × g, 12 min, temperatura ambiente). Ajuste la aceleración y desaceleración de la centrífuga a la velocidad mínima. NOTA: Después de la centrifugación, las neuronas estarán en la parte inferior del tubo, mientras que los restos celulares quedarán atrapados en el gradiente BSA.</li>
	<li>Retire suavemente todo el sobrenadante con una pipeta.</li>
	<li>Resuspender las células en 500 μL de Neurobasal.</li>
	<li>Placa 104 neuronas por pocillo (200 μL de neurobasal/pocillo) en una placa de 96 pocillos de fondo plano recubierta de laminina. NOTA: En promedio, un investigador podrá llenar ~ 8 pocillos por ratón.</li>
	<li>Cultivar las neuronas (37 °C, durante la noche) para permitir la unión.</li>
</ol>3. Cocultivo y citometría de flujo
<ol><li>Retire lentamente el neurobasal del cultivo neuronal.</li>
	<li>Después de 48 h de estimulación con IL-2 e IL-15 (ver pasos 1.14-1.15), resuspender las células NK y añadir 105 células NK/pocillo al cultivo neuronal (placa inferior plana de 96 pocillos). NOTA: En promedio, el investigador podrá llenar ~ 6 pocillos por ratón.</li>
	<li>Cocultivo de las células en MX neurobasal suplementado (37 °C, 48 h).</li>
	<li>Recoger las celdas, lavar con PBS (3x) y centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Desechar el sobrenadante y teñir las células con Viability Dye eFlour-780 (1:1.000, 15 min, 4 °C).</li>
	<li>Recoger las células, lavar con PBS (3x) y centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Bloquear sitios inespecíficos en las células con CD16/32 (1:100, 15 min, 4 °C).</li>
	<li>Recoger las células, lavar con PBS (3x) y centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Tinción (15 min, 4 °C) de las células con BV421 anti-NK-1.1 (1:100), isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-NKp46 (1:100) y ficoeritrina (PE) anti-GM-CSF (1:100).</li>
	<li>Recoger las células, lavar con PBS (3x) y centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Desechar el sobrenadante, resuspender las células en tampón FACS (500 μL) e inmunofenotipar las células NK mediante citometría de flujo11. Consulte la Figura 1A para conocer la estrategia de acceso.</li>
</ol>

<ol><li>Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+dorsal+root+ganglia+and+primary+sensory+neurons+for+the+treatment+of+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).</li>
<li>Baral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptor+sensory+neurons+suppress+neutrophil+and+gammadelta+T+cell+responses+in+bacterial+lung+infections+and+lethal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia.</a> Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).</li>
<li>Binshtok, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptors+are+interleukin-1beta+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nociceptors are interleukin-1beta sensors.</a> Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).</li>
<li>Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-immune+regulation+of+mucosal+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuro-immune regulation of mucosal physiology.</a> Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).</li>
<li>Samad, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-mediated+induction+of+Cox-2+in+the+CNS+contributes+to+inflammatory+pain+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity.</a> Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).</li>
<li>Godinho-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-entrained+and+brain-tuned+circadian+circuits+regulate+ILC3s+and+gut+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis.</a> Nature. 574, 254-258 (2019).</li>
<li>Talbot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding-dependent+VIP+neuron-ILC3+circuit+regulates+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier.</a> Nature. 579, 575-580 (2020).</li>
<li>Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ligands+for+the+NKG2D+activating+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor.</a> Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).</li>
<li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+or+adaptive+immunity%3F+The+example+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331, 44-49 (2011).</li>
<li>Davies, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Killer+Cells+Degenerate+Intact+Sensory+Afferents+following+Nerve+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury.</a> Cell. 176, 716-728 (2019).</li>
<li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2, 100333(2021).</li>
<li>Goswami, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+mouse+TRPV1-lineage+neurons+revealed+by+RNA-Seq+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis.</a> Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).</li>
<li>Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1-lineage+neurons+are+required+for+thermal+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation.</a> EMBO J. 30, 582-593 (2011).</li>
<li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+natural+killer+cell+functions+by+capsaicin+through+a+direct+and+TRPV1-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism.</a> Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Davies et al.11 encontraron que las neuronas lesionadas regulan al alza la RAE1. A través del contacto célula-célula, las células NK que expresan NKG2D fueron capaces de identificar y eliminar las neuronas RAE1+ , que a su vez limitan el dolor crónico11. Dado que las células NK también expresan varios receptores de neuropéptidos, y que esos neuropéptidos son conocidos por sus capacidades inmunomoduladoras, parece cada vez más importante estudiar la inter...

Los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales se originan en los ganglios de la raíz dorsal (DRG). Los DRG se encuentran en el sistema nervioso periférico (SNP), entre el asta dorsal de la médula espinal y las terminales nerviosas periféricas. La naturaleza pseudo-unipolar de las neuronas DRG permite la transferencia de información de la rama periférica, que inerva el tejido diana, a la rama central, que lleva la información somatosensorial a la médula espinal1. Utilizando receptores de canales iónicos especializados, las neuronas de primer orden detectan las amenazas planteadas por patógenos, alérgenos y contaminantes2, lo que lleva a la afluencia de cationes (Na+,Ca2+) y a la generación de un potencial de acción 3,4,5.
Estas neuronas también envían potencial de acción antidrómica hacia la periferia, donde se había producido la detección inicial del peligro, lo que conduce a la liberación local de neuropéptidos 1,4. Por lo tanto, las neuronas nociceptoras sirven como un mecanismo de protección, alertando al huésped sobre el peligro ambiental 4,5,6,7.
Para comunicarse con las neuronas de segundo orden, los nociceptores liberan varios neurotransmisores (por ejemplo, glutamato) y neuropéptidos (por ejemplo, péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), sustancia P (SP) y péptido intestinal vasoactivo (VIP))6,7. Estos péptidos actúan sobre los capilares y promueven la extravasación plasmática, el edema y la afluencia local y la modulación de las células inmunes 2,4,7.
Los sistemas somatosensorial e inmune utilizan un sistema de comunicación compartido compuesto de citoquinas y neuropéptidos, y sus respectivos receptores afines4. Si bien esta comunicación bidireccional ayuda a proteger del peligro y preservar la homeostasis, también puede contribuir a la fisiopatología de la enfermedad4.
Las células NK se clasifican como células linfoides innatas y están especializadas para eliminar las células infectadas por virus. La función de las células NK está gobernada por un equilibrio de receptores estimulantes e inhibitorios, incluido el receptor activador NKG2D8. El ligando endógeno de NKG2D, ácido retinoico inducible temprano1 (RAE1), es expresado por células sometidas a estrés como tumorigénesis e infección 8,9.
Investigaciones recientes han demostrado que la lesión de los nervios periféricos impulsa a las neuronas sensoriales a expresar moléculas desadaptativas como la estatina 2 (STMN2) y la RAE1. Por lo tanto, a través del contacto célula-célula, las células NK que expresan NKG2D se activaron mediante la interacción con las neuronas que expresan RAE1. A su vez, las células NK fueron capaces de eliminar las neuronas nociceptoras lesionadas y la hipersensibilidad al dolor contundente normalmente asociada con la lesión nerviosa10. Además del eje NKG2D-RAE1, las células NK expresan los receptores afines para varios mediadores producidos por nociceptores. Por lo tanto, es posible que estos mediadores modulen la actividad de las células NK. Este artículo presenta un método de cocultivo para investigar la biología de la interacción neurona-célula NK nociceptora. Este enfoque ayudará a avanzar en la comprensión de cómo las neuronas nociceptoras modulan las respuestas inmunitarias innatas de las células a lesiones, infecciones o neoplasias malignas.

<table><tbody><tr><td>Anti-ratón CD16/32</td><td>Laboratorio Jackson Nº</td> de <td>cat: 017769</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Laboratorio Jackson</td><td>Nº de gato: 009669</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA) grado de cultivo</td><td>World Precision Instruments</td><td>Nº de cat: 504167</td><td></td></tr><tr><td>BV421 anti-ratón NK-1.1</td><td>Fisher Scientific</td><td>Nº de gato: 12430112</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células (50 &mu; m)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat n.º: A3160702</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa IV</td><td>Fisher</td><td>Scientific Cat n.º: 15140148</td><td></td></tr><tr><td>Dipteria toxinfl/fl</td><td>Fisher</td><td>Scientific Cat n.º: SH3057402</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa II</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat n.º: 13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat n.º: 07-200-95</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mouse NK Kit de aislamiento de células</td><td>Sigma</td><td>Nº de gato: CLS2595</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>Nº de gato: C0130</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>Sigma</td><td>Nº de gato: 04942078001</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>Nº de gato: 806552</td><td></td></tr><tr><td>FITC antiratón NKp46</td><td>Sigma</td><td>Nº de gato: L2020</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos de fondo plano</td><td>Sigma</td><td>Nº de cat: 03690</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur de vidrio</td><td>Sigma</td><td>Nº de cat: 470236-274</td><td></td></tr><tr><td>Factor neurotrófico derivado de líneas celulares gliales (GDNF)</td><td>VWR</td><td>Nº de cat: 02-0131</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Cedarlán</td><td>Nº de cat: 03-50/31</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>Nº de cat: A14867-01</td><td></td></tr><tr><td>Ratón IL-15 recombinante</td><td>Gibco</td><td>Nº de cat: 22400-089</td><td></td></tr><tr><td>Ratón recombinante IL-2</td><td>Gibco</td><td>Nº de cat: 21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento nervioso (NGF)</td><td>Life Technologies</td><td>Nº de cat: 13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Medios neurobasales</td><td>PeproTech</td><td>Nº de cat: 450-51-10</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-ratón GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>Nº de cat: 212-12</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina y Estreptomicina</td><td>PeproTech</td><td>Nº de cat: 210-15</td><td></td></tr><tr>Tecnología de <td>células madre</td><td>Mortles</td><td>Nº de cat: 19855</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Biolegend</td><td>Nº de gato:</td><td>108732 Clon PK136</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medios</td><td>Biolegend</td><td>Nº de gato:</td><td>137606 Clon 29A1.4</td></tr><tr><td>TRPV1Cre</td><td>Biolegend</td><td>Nº de gato: 505406</td><td>Clon MP1-22E9</td></tr><tr><td>Pinzas y herramientas de disección.</td><td>Biolegend</td><td>Nº de cat: 65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos con fondo en U</td><td>Biolegend</td><td>Nº de gato: 101319</td><td></td></tr><tr><td>Tinte de viabilidad eFlour-780</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

descubrir la interacción entre las células asesinas naturales y las neuronas nociceptoras

Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons

Las neuronas somatosensoriales han evolucionado para detectar estímulos nocivos y activar reflejos defensivos. Al compartir medios de comunicación, las neuronas nociceptoras también sintonizan las defensas del huésped al controlar la actividad del sistema inmunológico. La comunicación entre estos sistemas es principalmente adaptativa, ayudando a proteger la homeostasis, también puede conducir a, o promover, la aparición de enfermedades crónicas. Ambos sistemas coevolucionaron para permitir dicha interacción local, como se encuentra en los tejidos linfoides primarios y secundarios y la mucosa. Estudios recientes han demostrado que los nociceptores detectan y responden directamente a antígenos extraños, citoquinas derivadas de células inmunes y microbios.
La activación de los nociceptores no solo produce hipersensibilidad al dolor y picazón, sino que también reduce el umbral de disparo del nociceptor, lo que lleva a la liberación local de neuropéptidos. Los péptidos que son producidos por, y liberados de, los terminales periféricos de los nociceptores pueden bloquear la quimiotaxis y la polarización de los linfocitos, controlando la localización, la duración y el tipo de inflamación. La evidencia reciente muestra que las neuronas sensoriales interactúan con las células inmunes innatas a través del contacto célula-célula, por ejemplo, involucrando receptores del grupo 2D (NKG2D) en células asesinas naturales (NK).
Dado que las células NK expresan los receptores afines para varios mediadores producidos por nociceptores, es concebible que los nociceptores utilicen neuropéptidos para controlar la actividad de las células NK. Aquí, ideamos un método de cocultivo para estudiar las interacciones neuronal-célula NK nociceptor en un plato. Usando este enfoque, encontramos que las neuronas nociceptoras lumbares disminuyen la expresión de citoquinas de las células NK. En general, tal método reduccionista podría ser útil para estudiar cómo las neuronas inervantes de tumores controlan la función anticancerígena de las células NK y cómo las células NK controlan la eliminación de las neuronas lesionadas.

Las células NK se purificaron magnéticamente a partir de esplenocitos de ratones de control de camada (TRPV1 wt: :D TAfl / wt) y estimulados (48 h) con IL-2 e IL-15. Las células NK se cultivaron solas o cocultivadas con neuronas DRG recolectadas de la neurona nociceptora intacta (control de compañero de camada; TRPV1wt::D TA fl/wt) o ratones ablacionados (TRPV1cre::D TAfl/wt). Luego, las células se expusieron al agonista capsaicina TRPV1 (1 μM) o su vehícu...

Las neuronas nociceptoras y las células NK interactúan activamente en un contexto inflamatorio. Un enfoque de co-cultura permite estudiar esta interacción.

Descubrir la interacción entre las células asesinas naturales y las neuronas nociceptoras

Somatosensory neurons have evolved to detect noxious stimuli and activate defensive reflexes. By sharing means of communication, nociceptor neurons also ...

Dado que la neurona nociceptora secreta varios neuropéptidos y que las células NK expresan el receptor para estos neuropéptidos, decidimos idear un método de cocultivo para estudiar la interacción entre la célula NK y las neuronas nociceptoras. Tal método reduccionista podría ser útil para estudiar cómo la neurona nociceptora controla la función antitumoral de las células NK, y también podría ser interesante estudiar cómo las células NK controlan la eliminación de las neuronas lesionadas. Demostrando el procedimiento estará Ali Ahmadi, un ex estudiante de maestría de mi laboratorio.Para comenzar el aislamiento y cultivo de células asesinas naturales o NK, recolecte el bazo de ratón en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros que contenga 500 microlitros de PBS estéril, luego homogeneice el bazo usando un mortero. A continuación, diluya las células con un mililitro de PBS estéril y filtre la mezcla a través de un filtro de células de 50 micras en un tubo cónico de 50 mililitros. Rellene el volumen de homogeneización filtrada a 10 mililitros utilizando PBS estéril.Cuente las células en 10 microlitros del homogeneizado diluido usando un hemocitómetro. Centrifugar las células restantes durante cinco minutos a 500 G y retirar el sobrenadante. Luego resuspenda las células de 10 a octavas células por mililitro en medio RPMI 1640 suplementado.Purificar magnéticamente las células NK del bazo utilizando un kit de aislamiento de células NK de ratón y confirmar la pureza de las células NK mediante citometría de flujo. Contar las células con un hemocitómetro, seguido de centrifugación a los cinco minutos a 500 G, luego retirar el sobrenadante. Para estimular las células NK granuladas, resuspender estas células en medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con IL-2 e IL-15.Cultivo dos veces de 10 a la sexta células NK por mililitro en una placa de fondo en U de 96 pocillos durante 48 horas. 24 horas antes de la estimulación de las células NK, cubra la placa de 96 pocillos con 100 microlitros por pocillo de laminina e incube durante 45 minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, retire la solución y deje que los pocillos se sequen al aire en el gabinete de bioseguridad.A continuación, asegure el ratón sacrificado en el tablero en una posición prona. Levante la piel e incise la piel a lo largo de la columna dorsal. Cortar la articulación lumbosacra y separar el sacro de la columna lumbar con tijeras.Luego separe la columna vertebral cortando los músculos y las costillas en ambos lados en la dirección craneal hasta que se alcance la base del cráneo. Use tijeras para cortar la columna vertebral en la articulación atlantooccipital. A continuación, retire el músculo y el tejido graso de la columna vertebral.Fije y abra la columna vertebral para extirpar la médula espinal antes de obtener acceso al ganglio de la raíz dorsal o DRG en los agujeros intervertebrales conectados a la médula espinal a través de la raíz dorsal. A continuación, coseche los DRG en un tubo cónico de 15 mililitros lleno de 10 mililitros de DMEM suplementado con hielo frío. A continuación, centrifugar la preparación durante cinco minutos a 200 g a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante.Agregue 250 microlitros de PBS que contengan un miligramo por mililitro de colagenasa IV y 2.4 unidades por mililitro de dispasa II.Incubar este DRG con solución de colagenasa-dispasa durante 80 minutos con agitación suave. Para inactivar las enzimas, añadir cinco mililitros de medio DMEM suplementado y centrifugar la solución a 200 G.Después de cinco minutos, retire suavemente el sobrenadante con una pipeta y deje alrededor de 100 microlitros del sobrenadante para evitar la pérdida celular no deseada. A continuación, agregue un mililitro de medio DMEM suplementado a las celdas y use una pistola de pipetas y tres pipetas Pasteur de vidrio de tamaños decrecientes para triturar suavemente el DRG en una sola preparación de celda.Mientras trabaja en un gabinete de bioseguridad, diluya la albúmina sérica bovina o BSA en PBS estéril a una concentración final del 15% y almacene alícuotas de un mililitro a menos 20 grados centígrados. Para crear un gradiente de BSA en un tubo cónico de 15 mililitros, agregue dos mililitros de PBS estéril y luego dispense lentamente un mililitro de solución de BSA al 15% en el fondo del tubo. Evite interrumpir el gradiente retirando suavemente la pipeta.Con una pipeta P200, agregue la suspensión de ganglios triturados que contiene las neuronas en el lado del tubo en el gradiente. A continuación, ajuste la aceleración y la desaceleración como mínimo para centrifugar la neurona que contiene el gradiente BSA durante 12 minutos a 200 G.Después de la centrifugación, retire todo el sobrenadante con una pipeta y resuspenda las células en 500 microlitros de Neurobasal. Placa 10, 000 neuronas por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo plano recubierta de laminina.Para permitir la unión de las neuronas, incubar la placa de 96 pocillos durante la noche a 37 grados centígrados. Para comenzar el co-cultivo, retire lentamente el Neurobasal del cultivo neuronal. Después de 48 horas de estimulación con IL-2 e IL-15, resuspender las células NK y agregar 10 a la quinta célula NK por pocillo al cultivo neuronal.Co-cultivo de las células en MX neurobasal suplementado a 37 grados centígrados. Después de 48 horas, recolecte y lave las células tres veces con PBS y centrifugarlas durante cinco minutos a 500 G a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante antes de teñir las células con uno a 1, 000 colorante de viabilidad diluido eFluor 780 durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.Lave y centrifuga las células como se demuestra, seguido de tratamiento con CD 1632 durante 15 minutos a cuatro grados centígrados para bloquear sitios no específicos en las células, seguido de recoger y lavar las células con PBS tres veces. Después del siguiente ciclo de lavado y centrifugación, tiñe las células con BV421, anti-NK-1.1, isotiocianato de fluoresceína anti-NKp46 y ficoeritrina anti-GM-CSF durante 15 minutos. Una vez más, recolecte y lave las células tres veces con PBS, centrifugarlas y deseche el sobrenadante, luego resuspenda las células en 500 microlitros de tampón FACS e inmunofenotipe las células NK usando citometría de flujo.Cuando se cultivaron solas, las células NK expresaron niveles basales de factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos o GM-CSF y NKp46. Cuando se co-cultivó con neuronas DRG cosechadas de ratones nociceptores intactos, la estimulación de capsaicina disminuyó la expresión de células NK de GM-CSF. La capsaicina no tuvo impacto en las activaciones de las células NK cuando se cocultivó con neuronas DRG cosechadas de ratones ablacionados con nociceptores.El nivel de NKp46 no se vio afectado. Los pasos clave en este protocolo son la disociación y el aislamiento de DRG. La idea es mantener la máxima viabilidad neuronal evitando hacer burbujas y utilizando la pipeta del tamaño adecuado.Después del protocolo, el investigador puede usar la secuenciación de ARN o qPCR para medir el cambio de transcripción en las células purificadas de FACS, o puede usar ELISA para medir la secreción de citoquinas o neuropéptidos. Tal interacción revela que la función de las células NK probablemente esté sintonizada por la neurona nociceptora. Y esta diafonía puede ser importante en procesos biológicos que van desde lesiones nerviosas, infecciones bacterianas y virales, hasta neoplasias malignas.

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