Un enfoque basado en la espectrometría de masas para identificar fosfoproteínas fosfatasas y sus interactores

PIB-MS es una técnica novedosa utilizada para enriquecer fosfoproteínas fosfogénicas fosfatasas y están interactuando proteínas de células y tejidos. Implica la identificación y cuantificación de estas proteínas utilizando proteómica basada en espectrometría de masas. Esta técnica no requiere la expresión exógena de versiones marcadas de fosfoproteína fosfatasas que podrían alterar la actividad o localización de las proteínas.

Además, no utiliza anticuerpos que podrían ser inespecíficos o incapaces de distinguir entre isoformas específicas. Este método para investigar el PPPM se puede escalar para su uso en todo, desde células hasta muestras clínicas. Para comenzar, recolecte el pellet celular por centrifugación a 277 veces g durante dos minutos a temperatura ambiente.

Retire los medios y lave las células con cinco mililitros de PBS. Prepare el búfer de lisis como se describe en el protocolo de texto y manténgalo en hielo. Agregue un mililitro de tampón de lisis refrigerado a las muestras, luego homogeneice las muestras mediante sonificación y mantenga las células en hielo entre pulsos.

Transfiera los lisados a tubos frescos de 1,5 mililitros. Centrifugar la muestra sonicada a 21, 130 veces g durante 15 minutos a 4 grados centígrados. Use una alícuota del lisado para cuantificar la concentración total de proteínas utilizando un ensayo de ácido bicinconínico.

Este paso es esencial para asegurar la misma concentración de proteínas en cada muestra. Para un control de inhibidores de la fosfoproteína fosfatasa, prepare dos alícuotas de igual concentración de proteínas para cada muestra. El tampón de lisis se puede utilizar para diluir las muestras de modo que cada tubo tenga la misma concentración de proteínas.

Agregue un micromolar de microcistina-LR libre a una alícuota y un volumen igual de DMSO a la otra. Vórtice las muestras e incube en hielo durante 15 minutos. La preparación de las perlas inhibidoras de la fosfatasa debe llevarse a cabo con anticipación o durante las etapas de incubación descritas en la sección de preparación de la muestra.

Use 10 microlitros de perlas inhibidoras sólidas de fosfatasa, o resina PIB, para un miligramo de proteína y agréguelos a un tubo de 1.5 mililitros. Lave los PIB tres veces con 0,5 mililitros de tampón de lisis mediante vórtice seguido de centrifugación a 376 veces g durante 30 segundos a temperatura ambiente. Agregue una cantidad adecuada de tampón de lisis a los PIB lavados para obtener una solución tampón PIB al 50% por volumen.

Mezcle canalizando suavemente y gire la punta de la pipeta y la suspensión para volver a suspender los PIB. Transfiera 20 microlitros de la suspensión a un tubo de 1,5 mililitros que contenga 0,5 mililitros de tampón de lisis. Gire los tubos a 376 veces g durante 30 segundos.

Cada tubo contiene volúmenes iguales de PIBs en él. Deseche el sobrenadante dejando solo la resina sólida y hasta 50 microlitros de tampón de lisis en cada tubo. Transfiera los lisados a los tubos debidamente etiquetados que contengan PIBs.

Incubar el lisado con los PIBs durante una hora a 4 grados centígrados con rotación a 8 rpm. Después de la incubación con el lisado, centrifugue los PIB a 376 veces g durante 30 segundos a 4 grados centígrados y retire el sobrenadante. Lave las perlas añadiendo 0,5 mililitros de tampón de lisis e invirtiendo los tubos Recoja las perlas por centrifugación y retire el sobrenadante.

Repita este paso para un total de tres lavados. Después del lavado final, retire el tampón de lisis tanto como sea posible sin pipetear los PIB. Prepare un búfer de elución que contenga 2% SDS y agregue el búfer de elución de cuatro a cinco veces el volumen de los SIP.

Incubar a 65 grados centígrados durante una hora para eluir las fosfoproteína fosfatasas de las perlas. Centrifugar los tubos a 376 veces g durante 30 segundos a temperatura ambiente. Recoja el eluido en un tubo separado y proceda a los análisis de espectrometría de masas o western blotting.

Para regenerar los PIB, incube en una solución 2%SDS con rotación a 8 rpm durante una hora a temperatura ambiente. Lave las perlas de tres a cinco veces en Tris-HCl 25 milimolares con pH 7.5 con rotación durante 30 minutos por lavado. Almacene los PIBs en 25 milimolares Tris HCL pH 7.5 con azida de sodio.

Para el análisis de espectrometría de masas, los métodos de filtrado y análisis de datos varían y pueden ser realizados por el investigador o una instalación central. Después de buscar los datos sin procesar en una base de datos de proteoma específica de la especie, filtre los resultados de la búsqueda y expórtelos como una hoja de cálculo de Microsoft Excel. Analizar los datos por triplicados.

Para la cuantificación sin etiquetas, utilice las mediciones del área pico MS1 para cuantificar los datos. Para identificar las subunidades de PPP y sus interactores de novo, compare los triplicados biológicos de muestras inhibidas por microcistina-LR y tratadas con DMSO. Filtre los datos de modo que solo estén presentes proteínas con un recuento total de péptidos de más de una de al menos dos de las tres muestras tratadas con control DMSO.

Para filtrar las proteínas que no se unen específicamente a la resina, elimine las proteínas en las que el recuento total de péptidos en la condición tratada con microcistina-LR es mayor que el de cualquier subunidad catalítica de PPP. Excluir del análisis los contaminantes comunes como la queratina, el colágeno, las proteínas ribosómicas y las ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas. Un archivo CSV es esencial para importar los datos a Perseo.

Importe datos filtrados en Perseo haciendo clic en Carga de matriz genérica en la sección Cargar. Transforme los datos yendo a Transformación básica, seleccionando los datos y especificando la función de transformación como log base 2 de x. Impute los valores faltantes de una distribución normal yendo a Imputación, Reemplace los valores faltantes de la distribución normal, seleccionando los datos y especificando el ancho y el desplazamiento descendente para el cálculo.

Realizar normalización cuantil yendo a Normalizar, Normalización cuantil. Anote los datos yendo a Filas de anotaciones, filas de anotaciones categóricas. Realice la prueba T del estudiante yendo a Pruebas, Pruebas de dos muestras, seleccionando los grupos, la prueba a realizar y el método para la corrección de pruebas de hipótesis múltiples como se usa para el truncamiento.

Esta función también calcula las proporciones log 2. Los fosfostatatos de fosfoproteína y sus interactores se identificaron en las células HeLa utilizando un experimento de extracción de PIB, seguido de una cuantificación sin etiqueta de la abundancia de proteínas en muestras tratadas con DMSO y microcistina-LR. La gráfica del volcán del análisis de espectrometría de masas identificó aglutinantes específicos de PIB que se muestran en rojo, subunidades catalíticas en azul y nuevas subunidades candidatas de PPP, o proteínas que interactúan, en blanco.

Los aglutinantes inespecíficos se mostraron en gris. El diagrama de dispersión del área log2 del lisado de células HeLa tratado con DMSO mostró que las abundancias estaban altamente correlacionadas, lo que indica la reproducibilidad de los datos. El análisis de red de todas las subunidades de fosfoproteína fosfostatasa y proteínas que interactúan mostró que estas proteínas eran interactores específicos en el pull-down de PIB.

Se podrían realizar análisis proteómicos globales y comparar los resultados con el análisis PIB para determinar si la composición de PPPome está impulsada por la abundancia de PPP o regulada por mecanismos post-traduccionales. PIB-MS es una herramienta ampliamente aplicable que nos ha permitido identificar diferencias en los patrones de expresión de PPP en diversas condiciones, como muestras interfase versus mitóticas o diferencias entre líneas celulares de cáncer.