Name: Demostración de la inervación de la piel peluda y glabra en un patrón 3D utilizando múltiples enfoques de tinción fluorescente y limpieza de tejidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: Aprende una técnica de aclarado tisular para visualizar fibras nerviosas CGRP positivas en secciones gruesas de piel de rata mediante microscopía confocal. Este método revela redes tridimensionales de inervación cutánea en piel peluda y glabra.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudio fue apoyado por el Fondo de Innovación de la Academia China de Ciencias Médicas (Código de Proyecto no. CI2021A03404) y el Fondo Nacional de Innovación Interdisciplinaria de Medicina Tradicional China (Código del Proyecto no. ZYYCXTD-D-202202).

El presente estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto de Acupuntura y Moxibustión, Academia China de Ciencias Médicas Chinas (número de referencia D2018-04-13-1). Todos los procedimientos se llevaron a cabo siguiendo la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). En este estudio se utilizaron tres ratas macho adultas (Sprague-Dawley, peso 230 ± 15 g). Todos los animales fueron alojados en un ciclo de luz / oscuridad de 12 h con temperatura y humedad controladas y se les permitió el libre acceso a alimentos y agua.
1. Perfusión y preparación de muestras
<ol><li>Inyectar 250 mg/kg de solución de tribromoetanol (ver Tabla de Materiales) por vía intraperitoneal en la rata para inducir la eutanasia.</li>
	<li>Una vez que se detiene la respiración, use tijeras quirúrgicas de acero inoxidable para abrir la cavidad torácica de la rata. Utilice agujas de 20 G para perfundir a través del ventrículo cardíaco izquierdo13 a una velocidad de 3 ml/min con 100 ml de solución salina normal al 0,9% seguida de 250-300 ml de paraformaldehído al 4% en tampón de fosfato al 0,1 M (PB, pH 7,4) (Figura 1A, B).</li>
	<li>Después de la perfusión, use un bisturí para eliminar la piel del dorso y la suela de la pata trasera.<ol>
<li>Para las muestras que requieren sección congelada, posfijar los tejidos en paraformaldehído al 4% en 0,1 M PB durante 2 h; luego crioproteger los tejidos en sacarosa al 25% en PB 0,1 M durante más de 24 h a 4 °C</li>
		<li>Para las muestras con la sección gruesa que requiere limpieza de tejido, posfije los tejidos en paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) durante 2 h; luego crioproteger los tejidos en 1x PBS a 4 °C (Figura 1C–E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Tinción fluorescente triple con CGRP, faloidina y LYVE1 seguida de un tratamiento de limpieza de tejidos
NOTA: Se aplicó tinción fluorescente triple con CGRP, faloidina y LYVE1 para revelar las fibras nerviosas, los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos en la piel peluda y glabra en secciones de tejido con un grosor de 300 μm después del tratamiento de limpieza de tejidos.
<ol><li>Prepare la agarosa al 2% en 1x PBS calentando en un micro-horno durante 2 min hasta que la agarosa se disuelva (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Después del lavado, incruste los tejidos de la piel en agarosa al 2% a 37 ° C y colóquelos dentro de la nevera para enfriarlos (Figura 1F, G).</li>
	<li>Fije el tejido montado en el microtomo vibratorio con el agua helada y córtelos a un grosor de 500 μm en la dirección transversal. Utilice los siguientes parámetros para ajustar la cortadora de vibración y terminar el corte: velocidad, 0,50 mm/s, y amplitud, 1,5 mm (Figura 1H-K).</li>
	<li>Después de cortar, retire la agarosa de las secciones y guárdelas en una placa de seis pocillos con 1x PBS (pH 7.4) (Figura 1L).</li>
	<li>Incubar las secciones de tejido en una solución de Tritón X-100 al 2% en 1x PBS (TriX-PB) durante la noche a 4 °C. Consulte la Figura 2 para el siguiente procedimiento.</li>
	<li>Coloque las secciones de tejido en el tampón de bloqueo y gire a 72 rpm en el agitador durante la noche a 4 °C. NOTA: La composición del tampón de bloqueo es 10% de suero de burro normal, 1% de Triton-X 100 y 0.2% de azida de sodio en 1x PBS (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Transfiera las secciones de tejido a la solución que contiene los anticuerpos primarios del anticuerpo monoclonal de ratón anti-CGRP (1:500) y el anticuerpo anti-LYVE1 policlonal de oveja (1:500) en tampón de dilución en el tubo de la microcentrífuga (ver Tabla de materiales), y gire sobre el agitador durante 2 días a 4 °C. NOTA: La composición tampón de dilución es 1% de suero de burro normal, 0.2% tritón-X 100 y 0.2% de azida de sodio en 1x PBS.</li>
	<li>Lave las secciones de pañuelos dos veces con tampón de lavado a temperatura ambiente, luego manténgalas en el agitador durante la noche a 4 ° C en el tampón de lavado. NOTA: La composición del tampón de lavado es de 0.2% Triton-X 100 en 0.1 M PB (pH 7.4).</li>
	<li>Al día siguiente, transfiera las secciones de tejido a la solución mixta que contiene los anticuerpos secundarios de Burro anti-ratón IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) y burro anti-oveja IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), así como Alexa-Flour594 phalloidin (1:1000) (ver Tabla de Materiales) en un tubo de microcentrífuga y gire a 72 rpm en el agitador durante 5 h a 4 °C.</li>
	<li>Lave las secciones de tejido en una placa de seis pocillos con tampón de lavado durante 1 h, dos veces, a temperatura ambiente. Mantenga las secciones de tejido en el tampón de lavado en el agitador durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Transfiera las secciones de tejido al reactivo de limpieza de tejidos (consulte la Tabla de materiales, su volumen fue cinco veces mayor que el volumen de la muestra) y gire a 60 rpm en el agitador suavemente durante 1 h a temperatura ambiente. NOTA: Después de este tratamiento, las secciones de tejido se vuelven claras (Figura 2B).</li>
	<li>Monte los tejidos despejados en el portaobjetos, rodee los tejidos con un espaciador y pegue el espacio con un reactivo de limpieza de tejido fresco y un recubierto.</li>
</ol>3. Triple tinción fluorescente con CGRP, faloidina y LYVE1 siguiendo el enfoque convencional
NOTA: A modo de comparación, se realizó la misma tinción en secciones de tejido con un espesor de 30 μm siguiendo técnicas convencionales.
<ol><li>Cortar las secciones de tejido a 30 μm en un microtomo en la dirección transversal y montarlas en la diapositiva.</li>
	<li>Añadir solución bloqueadora con suero de burro normal al 3% y Tritón X-100 al 0,3% en PB de 0,1 M e incubar las secciones durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire la solución bloqueadora e incube las secciones con la solución que contiene los anticuerpos primarios del anti-CGRP monoclonal de ratón (1:500) y el anticuerpo anti-LYVE1 policlonal de oveja (1:500) en tampón de dilución durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Al día siguiente, lavar las secciones de tejido con 0,1 M PB (pH 7,4) tres veces, añadir la solución mixta que contiene los anticuerpos secundarios de burro anti-ratón IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) y burro anti-oveja IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), así como Alexa-Flour594 phalloidin (1:1000) en las secciones e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Antes de la observación microscópica, lave las secciones en 0.1 M PB (pH 7.4) tres veces, luego cúbralas con fundas en glicerina al 50%.</li>
</ol>4. Imágenes y análisis
<ol><li>Observe las muestras teñidas bajo un microscopio fluorescente y luego tome las imágenes con un microscopio confocal.</li>
	<li>Capture 30 imágenes (pilas Z), cada una en fotogramas de 10 μm, de cada sección de 300 μm de espesor e integre una sola imagen enfocada utilizando un procesador de imágenes del sistema de microscopía confocal (consulte la Tabla de materiales).<ol>
<li>Realice los siguientes pasos en el software de procesamiento de imágenes de la configuración confocal para el análisis tridimensional (3D): Establecer plano focal de inicio | Establecer | de plano focal final Establecer el tamaño de los pasos | Elija el | Patrón de profundidad captura de imágenes | Serie Z. NOTA: Las longitudes de onda de excitación y emisión de las señales de fluorescencia azul fueron de 401 nm y 421 nm, respectivamente. Las longitudes de onda de excitación y emisión de las señales de fluorescencia verde fueron de 499 nm y 519 nm, respectivamente. Las longitudes de onda de excitación y emisión de las señales de fluorescencia roja fueron de 591 nm y 618 nm, respectivamente. 152 μm es el diámetro del agujero de alfiler confocal (lente de objetivo 10x, NA: 0,4). La resolución de captura de imagen fue de 1024 × 1024 píxeles.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para las muestras convencionales (paso 3), capture 30 imágenes (pilas Z) en fotogramas de 1 μm de cada sección de 30 μm de espesor y trate estas imágenes como se mencionó anteriormente (pasos 4.1-4.2).</li>
	<li>Demuestre las imágenes en el patrón de reconstrucción 3D con el sistema de procesamiento de imágenes.</li>
	<li>Realice reconstrucciones 3D importando imágenes confocales de pila Z en Imaris 9.0 (software de imágenes de celdas, consulte Tabla de materiales) y cree representaciones de superficies basadas en intensidades de mancha: Agregue nuevas superficies | Elija el canal de origen | Determinar los parámetros en la opción suavizado de Detalle de superficies | Determine los parámetros en la opción de umbral de Intensidad absoluta | Clasificar superficies | Terminar.</li>
	<li>Adquiera datos en el área de superficie de las fibras nerviosas positivas con el software de imágenes celulares. Seleccione la imagen renderizada | estadísticas | | detallado Valores específicos | Volumen.</li>
</ol>

<ol><li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+neuro-immuno-cutaneous+system+on+human+skin+equivalent+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design.</a> Cell Proliferation. 52 (6), 12677(2019).</li>
<li>Wu, H., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+diversity+of+cutaneous+sensory+afferents+revealed+by+genetically+directed+sparse+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling.</a> Elife. 1, 00181(2012).</li>
<li>Pomaville, M. B., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+genetic+labeling+of+hairy+and+glabrous+skin+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Currents+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation.</a> Currents Protocols. 1 (5), 121(2021).</li>
<li>Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+of+cutaneous+structures+in+the+mouse+hind+paw%3A+a+confocal+microscopy+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study.</a> Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).</li>
<li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51749(2014).</li>
<li>Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+confocal+microscopy+for+adult+ear+skin%3A+a+model+system+to+study+neuro-vascular+branching+morphogenesis+and+immune+cell+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57406(2018).</li>
<li>Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+hair+follicle+innervation+in+experimental+models%3A+a+guide+for+the+exact+and+reproducible+evaluation+of+neuronal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity.</a> Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).</li>
<li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+whole+mount%3A+a+novel+processing+and+imaging+protocol+for+thick%2C+three-dimensional+tissue+cross-sections+of+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e56106(2017).</li>
<li>Yokomizo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+three-dimensional+imaging+of+internally+localized+immunostained+cells+within+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos.</a> Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li>
<li>Pende, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+ultramicroscopy+of+the+developing+and+adult+nervous+system+in+optically+cleared+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster.</a> Nature Communications. 9 (1), 4731(2018).</li>
<li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e61742(2021).</li>
<li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+phallotoxin%2C+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li>
<li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LYVE-1%2C+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein%2C+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUBIC+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54401(2016).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li>
<li>Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neuromediators+and+innervation+in+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Dermato-Venereologica%22%5BJournal%5D)">The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing.</a> Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Histology%22%5BJournal%5D)">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li>
<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+cytoskeletal+F-actin+with+rhodamine+phalloidin+or+fluorescein+phalloidin+for+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).</li>
<li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+vessel+network+structure+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lymphatic vessel network structure and physiology.</a> Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).</li>
<li>Schwager, S., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+lymphatic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and lymphatic function.</a> Frontiers in Immunology. 10, 308(2019).</li>
<li>Hagan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+fission+yeast+filamentous+actin+with+fluorescent+phalloidin+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocol%22%5BJournal%5D)">Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates.</a> Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El presente estudio proporciona una demostración detallada de las fibras nerviosas cutáneas en la piel peluda y glabra mediante el uso de inmunofluorescencia en secciones de tejido más gruesas con tratamiento de limpieza y una vista 3D para comprender mejor la inervación de la piel. El tiempo de incubación de anticuerpos de hasta 1-2 días y un proceso de limpieza nocturno son importantes. Estos dos pasos clave afectan directamente el efecto de tinción de inmunofluorescencia de secciones gruesas. Otro problema surgió de l...

La piel, el órgano más grande del cuerpo, que sirve como una interfaz clave para el medio ambiente, está densamente inervada por muchas fibras nerviosas 1,2,3. Aunque la inervación de la piel ha sido ampliamente estudiada previamente con varios métodos histológicos, como la tinción en las secciones 4,5,6 de la piel y el tejido de montaje completo, la demostración efectiva detallada de las fibras nerviosas cutáneas sigue siendo un desafío 7,8. Dado esto, el presente protocolo desarrolló una técnica única para exhibir las fibras nerviosas cutáneas más claramente en la sección de tejido grueso.
Debido al límite por el grosor de las secciones, la observación de las fibras nerviosas inervadas de la piel no es lo suficientemente precisa como para representar con precisión la relación entre las fibras nerviosas del péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) y los tejidos y órganos locales a partir de la información de la imagen adquirida. La aparición de la tecnología de limpieza de tejidos en 3D proporciona un método factible para resolver este problema 9,10. El rápido desarrollo de enfoques de limpieza de tejidos ha ofrecido muchas herramientas para estudiar estructuras tisulares, órganos enteros, proyecciones neuronales y animales enteros en los últimos tiempos11. El tejido transparente de la piel podría ser fotografiado en una sección mucho más gruesa por microscopía confocal para obtener los datos para visualizar las fibras nerviosas cutáneas.
En el estudio actual, la piel plantar y dorsal de un pie trasero de rata se seleccionó como los dos sitios objetivo de la piel peluda y glabra 3,4,7. Para rastrear las fibras nerviosas cutáneas a una distancia más larga, el tejido de la piel se cortó en rodajas con un grosor de 300 μm para la tinción inmunohistoquímica e histoquímica, seguida de un tratamiento de limpieza de tejidos. CGRP se utilizó para etiquetar las fibras nerviosas sensoriales12,13. Además, para resaltar las fibras nerviosas cutáneas en el fondo tisular, la faloidina y el receptor 1 de hialuronano endotelial de vasos linfáticos (LYVE1) se utilizaron para etiquetar los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos, respectivamente14,15.
Estos enfoques proporcionaron un método sencillo que se puede aplicar para demostrar una vista de alta resolución de las fibras nerviosas cutáneas y también para visualizar la correlación espacial entre las fibras nerviosas, los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos en la piel, lo que puede proporcionar mucha más información para comprender la homeostasis de la piel normal y la alteración cutánea en las condiciones patológicas.

<table><tbody><tr><td>1x solución salina tamponada con fosfato</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>P1020</td><td>pH 7,2-7,4, 0,01 Mol</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromoetanol</td><td>Sigma Life Science</td><td>T48402-5G</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía de fluorescencia confocal</td><td>Olympus Corporation</td><td>Fluoview FV1200</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-ratón IgG H& L Alexa-Flour488</td><td>Abcam plc.</td><td>ab150105</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-ovejas IgG H& L Alexa-Flour405</td><td>Abcam plc.</td><td>ab175676</td><td></td></tr><tr><td>Tubo EP</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co.</td><td>615001</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Sistema de micrótomo deslizante de etapa de congelación</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1860</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Oxford Instruments</td><td>v.9.0.1</td><td></td></tr><tr><td>Tijera estándar IRIS</td><td>WPI (World Precision Instruments Inc.)</td><td></td><td></td>503242</tr><tr><td>iSpacer</td><td>SunJin Lab co.</td><td>IS005</td><td></td></tr><tr><td>Micro pinzas-Str</td><td>RWD</td><td>F11020-11</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal anti-CGRP de ratón</td><td>Santa cruz biotechnology, Inc.</td><td>sc-57053</td><td></td></tr><tr><td>Formalina tamponada neutra</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>G2161</td><td>10%</td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>017-000-12</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Longer Precision Pump Co., Ltd</td><td>BT300-2J</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Alexa-Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear 1.52 solución</td><td>SunJin Lab co.</td><td>RC152001</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>de agarosa regular</td><td>Gene Company Limited</td><td>G-10</td><td></td></tr><tr><td>SEMKEN 1 x 2 Pinzas de tejido dental-Str</td><td>RWD</td><td>F13038-12</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal anti-LYVE1 de oveja</td><td>R& D Sistemas, Inc.</td><td>AF7939</td><td></td></tr><tr><td>Placa de seis pocillos</td><td>Corning Incorporated</td><td>3335</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Sigma Life Science</td><td>S2002</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma Life Science</td><td>V900116</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Henkel AG & Co.</td><td>Pattex 502</td><td></td></tr><tr><td>Mangos quirúrgicos</td><td>RWD</td><td>S32003-12</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>9002-93-1</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Uretano</td><td>Sigma Life Science</td><td>U2500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte VANNAS</td><td>RWD</td><td>S1014-12</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo vibratorio</td><td>Leica Biosystems VT1200S</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

demostración de la inervación de la piel peluda y glabra en un patrón 3d utilizando múltiples enfoques de tinción fluorescente y limpieza de tejidos

Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches

La inervación de la piel es una parte importante del sistema nervioso periférico. Aunque el estudio de las fibras nerviosas cutáneas ha progresado rápidamente, la mayor parte de la comprensión de sus características distributivas y químicas proviene de la tinción histoquímica e inmunohistoquímica convencional en secciones delgadas de tejido. Con el desarrollo de la técnica de limpieza de tejidos, ha sido posible ver las fibras nerviosas cutáneas en secciones de tejido más gruesas. El presente protocolo describe múltiples tinciones fluorescentes en secciones de tejido a un grosor de 300 μm de la piel plantar y dorsal de la pata trasera de rata, los dos sitios típicos de piel peluda y glabra. Aquí, el péptido relacionado con el gen de la calcitonina etiqueta las fibras nerviosas sensoriales, mientras que la faloidina y el receptor 1 de hialuronano endotelial de los vasos linfáticos etiquetan los vasos sanguíneos y linfáticos, respectivamente. Bajo un microscopio confocal, las fibras nerviosas sensoriales marcadas se siguieron completamente a una distancia más larga, corriendo en haces en la capa cutánea profunda y freestyle en la capa superficial. Estas fibras nerviosas corrían en paralelo o rodeaban los vasos sanguíneos, y los vasos linfáticos formaban una red tridimensional (3D) en la piel peluda y glabra. El protocolo actual proporciona un enfoque más efectivo para estudiar la inervación de la piel que los métodos convencionales existentes desde la perspectiva de la metodología.

Después de la triple tinción fluorescente, las fibras nerviosas, los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos se etiquetaron claramente con CGRP, faloidina y LYVE1, respectivamente, en la piel peluda y glabra (Figura 3,4). Con el tratamiento de limpieza, las fibras nerviosas positivas para CGRP, los vasos sanguíneos positivos para faloidina y los vasos linfáticos positivos para LYVE1 se pueden obtener imágenes a mayor profundidad para adquirir la información estructural compl...

El grosor de las secciones de tejido limitó el estudio morfológico de la inervación de la piel. El presente protocolo describe una técnica única de limpieza de tejidos para visualizar las fibras nerviosas cutáneas en secciones de tejido gruesas de 300 μm bajo microscopía confocal.

Demostración de la inervación de la piel peluda y glabra en un patrón 3D utilizando múltiples enfoques de tinción fluorescente y limpieza de tejidos

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of ...

Nuestro protocolo proporcionó un método factible para observar la sección de sincronización utilizando un microscopio confocal, que podría garantizar la precisión en la observación de las fibras nerviosas. El protocolo de limpieza de tejidos simple y fácil es una de las principales ventajas de esta técnica. El proceso de limpieza de tejidos es eficiente y toma alrededor de 30 minutos a una hora.Realizar perfusión en la rata sacrificada como se menciona en el manuscrito del texto. Use un bisturí para eliminar la piel del dorso y la suela de la pata trasera. Para las muestras que requieren una sección congelada, fije los tejidos en un 4% de aldehído en PB molar 0.1 durante dos horas.Después del lavado, incruste los tejidos de la piel en agarosa al 2% a 37 grados centígrados y colóquelos dentro de la caja de hielo para enfriarlos. Fije el tejido montado en el microtono vibratorio con agua helada y córtelos a un grosor de 500 micrómetros en la dirección transversal. Después de cortar, retire la agarosa de las secciones y guárdelas en una placa de seis pocillos con 1x PBS.Incubar las secciones de tejido en una solución de 2%tritón X-100 en 1x PBS durante la noche a cuatro grados centígrados. Coloque las secciones de tejido en el tampón de bloqueo y gire a 72 rotaciones por minuto en el agitador durante la noche a cuatro grados centígrados. Transfiera las secciones de tejido a la solución que contiene los anticuerpos primarios del anticuerpo monoclonal de ratón anti-CGRP y el anticuerpo policlonal anti-LYVE-1 de oveja en tampón de dilución en el tubo de micro centrífuga.Luego gire sobre la coctelera durante dos días a cuatro grados centígrados. Lave las secciones de tejido dos veces con tampón de lavado a temperatura ambiente, luego manténgalas en el agitador durante la noche a cuatro grados centígrados en el tampón de lavado. Al día siguiente, transfiera las secciones de tejido a la solución mixta que contiene los anticuerpos secundarios en un tubo de micro centrífuga y gire a 72 rotaciones por minuto en el agitador durante cinco horas a cuatro grados centígrados.Lave las secciones de tejido en una placa de seis pocillos con tampón de lavado dos veces durante una hora a temperatura ambiente. Mantenga las secciones de tejido en el tampón de lavado en el agitador durante la noche a cuatro grados centígrados. Transfiera las secciones de tejido al reactivo de limpieza de tejido y gire a 60 rotaciones por minuto en el agitador suavemente durante una hora a temperatura ambiente.Monte los tejidos transparentes en el portaobjetos, luego rodee los tejidos con un espaciador y pegue el espacio con un reactivo de limpieza de tejido fresco y un resbalón de cubierta. El patrón 3D demostró que las fibras nerviosas positivas para CGRP pasaron a través del tejido subcutáneo y la dermis hasta la epidermis. Estas fibras nerviosas corrían en haces en el tejido subcutáneo ramificado dentro de la dermis y terminado en la epidermis.Por el contrario, la faloidina en los vasos sanguíneos positivos y los vasos linfáticos positivos de LYVE-1 se distribuyen en el tejido subcutáneo y la dermis. En general, las fibras nerviosas positivas para CGRP corrían paralelas o rodeaban los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos formando una red 3D en la piel peluda y glabra. Con el enfoque convencional, aunque los vasos sanguíneos de las fibras nerviosas y los vasos linfáticos estaban claramente marcados con faloidina CGRP y LYVE-1 en las secciones delgadas, la observación de estas estructuras estaba limitada por el grosor de la rebanada y no se puede observar por completo.En la sección con un grosor de 30 micrómetros, no hubo diferencia entre la piel peluda y la piel glabra en el área de superficie de las fibras nerviosas positivas para CGRP. En las secciones de tejido de 300 micrómetros de espesor, en comparación con la piel peluda, el área de superficie de las fibras nerviosas positivas para CGRP de la piel glabra aumentó significativamente. Es importante usar el tampón de limpieza con alta presión osmótica después de la incubación de anticuerpos.Varias veces, el tiempo de limpieza requerido para la tinción de inmunofluorescencia es necesario. Después de este procedimiento, creemos que existe la posibilidad de tinción y observación de otros tejidos y órganos en seis secciones. Esta técnica podría ayudar a los investigadores de neurociencia a encontrar el área de superficie y el estado de las fibras neuronales.También nos ayuda a observar la innovación de tejidos y órganos.

demonstrating-hairy-glabrous-skin-innervation-3d-pattern-using

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se introduce un inmunohistoquímica todo el montaje y la microscopía confocal de barrido láser con múltiples etiquetas para analizar la formación de complejos de la red vascular de la piel del ratón extremidades embrionarias.

Todo el montaje El análisis inmunohistoquímico de la piel del miembro Vasculatura embrionarias: un sistema modelo para estudiar la morfogénesis vascular ramificación en embriones

Identificación de inmuno periféricos subtipos de fibras nerviosas sensoriales (y la detección de la expresión de proteínas en ella) son fundamentales para la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la sensación periférica. A continuación se describen los métodos para la preparación de las muestras de los tejidos periféricos / visceral, como los huesos y la piel del miembro, por inmunotinción específica de las fibras nerviosas sensoriales periféricas.

Preparación y tejido de fibras inmunotinción ratón nerviosas sensoriales que inervan la piel y los huesos de extremidades

Visualización de las células individuales en los tejidos densamente empaquetadas, tales como terminales de las células de Schwann (SC) en las uniones neuromusculares (NMJs), es un reto. "Sequential foto-blanqueamiento" permite delimitar SCs individuales terminal, por ejemplo en el explante de músculo triangularis esternón, una conveniente preparación nervio-músculo, donde secuencial de blanqueamiento puede ser combinado con las imágenes de lapso de tiempo...

Secuencial Foto-blanqueamiento para Precisar las células individuales de Schwann en la unión neuromuscular

Con el fin de estudiar los cambios en las fibras nerviosas nociceptivas intraepidérmicos (IENFs) en neuropatías dolorosas (PN), hemos desarrollado protocolos que podrían examinar directamente los cambios morfológicos observados en tres dimensiones en IENFs nociceptivas. El análisis tridimensional de IENFs tiene el potencial para evaluar los cambios morfológicos de IENF en PN.

Imagen tridimensional de nociceptivos Fibras Nerviosas intraepidérmicas en biopsias de piel humana

Piel de los mamíferos contiene una amplia gama de estructuras - tales como los folículos pilosos y las terminaciones nerviosas - que exhiben patrones distintivos de organización espacial. El análisis de la piel como montura plana se aprovecha de la geometría de 2 dimensiones de este tejido para producir de espesor total de imágenes de alta resolución de las estructuras de la piel.

Flat Mount Imaging de ratón de la piel y su aplicación al análisis del folículo del pelo Patrones y sensorial Axon Morfología

Este protocolo utiliza técnicas de análisis y proyección de imagen (3D) tridimensionales para visualizar y cuantificar las mitocondrias del nervio específico. Las técnicas son aplicables a otras situaciones donde una señal fluorescente se utiliza para aislar un subconjunto de los datos de otra señal fluorescente.

Proyección de imagen tridimensional y análisis de las mitocondrias en las fibras de nervio humano Intraepidermal

Aquí describimos una preparación novedosa para obtener imágenes de terminales sensoriales lanceoladas vivas de terminaciones en empalizada que inervan los folículos pilosos de la piel del oído de ratón durante la tinción y decoloración con colorantes de estiril piridinio.

Seguimiento óptico del nervio terminal de estar etiquetado en folículo piloso lanceoladas Los finales de la<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Piel de la oreja de ratón

Este informe describe un protocolo cúbico a aclarar las biopsias de espesor completo de piel de ratón, y visualizar los patrones de expresión de proteínas, células proliferantes, y sebocitos en la resolución de una sola célula en 3D. Este método permite una evaluación precisa de la anatomía y la patología de la piel y de los fenotipos anormales en la epidermis líneas de ratones modificados genéticamente.

Protocolo CÚBICO Visualiza la expresión de la proteína en la resolución de la celda individual en su totalidad para la piel Mount

Este trabajo presenta un nuevo protocolo de procesamiento e imagen para el análisis transversal transversal de tejido tridimensional denso que permite la plena explotación de las modalidades de imagen confocal. Este protocolo preserva la antigenicidad y representa un sistema robusto para analizar la histología de la piel y potencialmente otros tipos de tejidos.

Montaje entero horizontal: un nuevo protocolo de procesamiento e imágenes para tejidos gruesos y tridimensionales Secciones transversales de la piel

Aquí, presentamos procedimientos económicos y simples para introducir varios modelos de piel en 3D para la investigación de rutina en un laboratorio de cultivo celular. Los investigadores pueden crear modelos adaptados a sus necesidades sin depender de modelos disponibles en el mercado.

Creación de modelos de piel para numerosas aplicaciones, desde el monocultivo bidimensional (2D) hasta el multicultivo tridimensional (3D)

Este estudio presenta un enfoque in vivo de imagen de dos fotones para visualizar las estructuras de terminales axonales de mecanorreceptores de bajo umbral (LTMR) en la piel de la pata delantera de ratones. Utilizando imágenes repetidas y de alta resolución de axones individuales, este método proporciona una nueva plataforma para estudiar la estructura y función del circuito sensorial cutáneo durante el desarrollo y en adultos.

Imagen intravital de dos fotones de la morfología del axón sensorial táctil en piel de ratón

Aprende una técnica de aclarado tisular para visualizar fibras nerviosas CGRP positivas en secciones gruesas de piel de rata mediante microscopía confocal. Este método revela redes tridimensionales de inervación cutánea en piel peluda y glabra.

Demostración de la inervación de la piel peluda y glabra en un patrón 3D utilizando múltiples enfoques de tinción fluorescente y limpieza de tejidos (Video) | JoVE Journal

Demostración de la inervación de la piel peluda y glabra en un patrón 3D utilizando múltiples enfoques de tinción fluorescente y limpieza de tejidos

Explorar más videos