Chip de glomérulo renal isogénico diseñado a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos

El chip de glomérulo isogénico permitirá el modelado de enfermedades específicas del paciente y las pruebas de nefrotoxicidad y las aplicaciones avanzadas de medicina de precisión. El epitelio glomerular y el endotelio se derivan de una sola población de células madre pluripotentes inducidas por humanos, o IPSC. Las IPSC poseen una autorrenovación ilimitada y pueden diferenciarse en casi cualquier tipo de célula.

Esta técnica se puede utilizar para evaluar fenotipos celulares patológicos y enfermedades. El chip de órgano específico del paciente también puede servir como plataforma para la detección de drogas y estudios mecanicistas. Este modelo se puede aplicar al desarrollo de un sistema de cuerpo en un chip personalizado para un paciente específico.

Este sistema tiene el potencial de predecir respuestas específicas del paciente antes de las pruebas clínicas. Comience agregando suavemente 25 microlitros de solución de matriz de membrana basal 2 al canal urinario y 20 microlitros en el canal capilar del chip. Tome dos tapas de tubo cónicas estériles de 15 mililitros y llénelas con 500 microlitros de agua destilada estéril.

Coloque la tapa en la placa de Petri para evitar que se seque y coloque la tapa sobre el plato. Incubarlo a 37 grados centígrados durante la noche. A continuación, aspirar el medio a partir de matraces T75 que contengan un cultivo de 15 días de células endoteliales vasculares al 90% de confluencia.

Agregue cinco mililitros de tampón de desprendimiento celular e incube a 37 grados centígrados durante cinco a siete minutos. Luego transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros y agregue cinco mililitros de DMEM / F-12. Centrifugar a 200 veces G durante cinco minutos.

Retirar el sobrenadante y resuspender las células en 300 microlitros de medio de mantenimiento endotelial. Cuente las células con un hemocitómetro para obtener aproximadamente 2 millones de células. Usando una punta de barrera P200, enjuague los canales superior e inferior del chip microfluídico con 200 microlitros de DMEM / F-12 mientras aspira simultáneamente desde la periferia de la salida.

Sostenga el chip firmemente con la punta de barrera P200 conectada al aspirador lejos de la salida del canal inferior. Inyecte firmemente 20 microlitros de la suspensión de células endoteliales vasculares en el canal capilar del chip y aspire cuidadosamente el medio desde la periferia de la salida. Verifique bajo el microscopio si hay burbujas o una densidad de siembra desigual.

Invierta suavemente el chip para que las células puedan adherirse al lado basal de la membrana flexible de PDMS. Coloque el chip en el cartucho soporte y agregue tres mililitros de PBS en el cartucho para evitar que la membrana se seque. Incubar el chip a 37 grados centígrados durante tres horas.

Verifique el canal inferior bajo el microscopio para ver si hay una capa confluente de células unidas a la membrana flexible de PDMS. Lave las células no unidas agregando 200 microlitros de medio de mantenimiento endotelial en la entrada del canal inferior mientras aspira desde la periferia de la salida del canal capilar. Vuelva a colocar el chip en el cartucho soporte e incube a 37 grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, enjuague suavemente el canal capilar con 200 microlitros de medio de mantenimiento endotelial. Enjuague el canal urinario con 200 microlitros de DMEM/F-12 y deje caer 50 microlitros de DMEM/F-12 en los puertos de entrada y salida. Siguiendo las células intermedias del mesodermo, reemplace el medio de inducción del mesodermo intermedio de cada pocillo de la placa de 12 pocillos con un mililitro de tripsina EDTA e incube a 37 grados centígrados durante cinco minutos.

Raspa suavemente las células con un elevador de células y disocia las células con pipeteo. Agregue dos mililitros de solución de neutralización de tripsina a cada pocillo y transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros. Enrasar el volumen de la suspensión celular a 50 mililitros con DMEM/F-12 y centrifugar a 200 veces G durante cinco minutos.

Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 500 microlitros de medio de inducción de mesodermo intermedio para obtener aproximadamente 3 millones de células. Cuente las células con un hemocitómetro. Sostenga el chip e inyecte firmemente 25 microlitros de suspensión celular en el canal urinario del chip mientras aspira cuidadosamente el medio desde la periferia de la salida.

Compruebe si hay burbujas o densidad de siembra celular desigual. Agregue tres mililitros de PBS en el cartucho portachips e incube a 37 grados centígrados durante tres horas. Después de la incubación, enjuague ambos canales con 200 microlitros de su respectivo medio de cultivo celular.

Coloque puntas de barrera P200 vacías en ambas salidas de los canales urinario y capilar. Pipetear 200 microlitros de medio de mantenimiento endotelial e inyectar la mitad en la entrada del canal capilar. Suelte la punta de la pipeta dentro de la entrada de tal manera que tanto la entrada como la salida del canal estén unidas a las puntas de pipeta llenas de medio.

Repita este procedimiento para la entrada del canal urinario con 200 microlitros de medio de mantenimiento intermedio del mesodermo. Incubar las patatas fritas con puntas incrustadas a 37 grados centígrados durante la noche. Para conectar los chips al biorreactor de chip de órgano, primero, retire las puntas P200 de los canales.

Agregue gotitas de los medios respectivos a la entrada y salida de los canales urinario y capilar para evitar que se sequen. Agregue tres mililitros de medio de inducción de podocitos caliente al depósito de entrada urinaria y tres mililitros de medio de mantenimiento endotelial caliente al reservorio de entrada capilar. Agregue 300 microlitros de los medios respectivos a los depósitos de salida directamente sobre el puerto de salida.

Deslice las cápsulas en la bandeja y en el biorreactor de chip de órgano. Utilice el dial giratorio para seleccionar e iniciar el ciclo principal durante dos minutos. Inspeccione visualmente la parte inferior de la cápsula en busca de pequeñas gotas en los cuatro puertos fluídicos.

Para lograr un contacto fluido-fluido entre la parte inferior de la cápsula y los puertos de chip microfluídico, deslice suavemente el portador del chip en la cápsula. Presione suavemente la pestaña del portador de chip hacia adentro y hacia arriba. Aspirar el exceso de medio de la superficie del chip.

Ajuste el caudal del biorreactor del chip de órgano a 60 microlitros por hora. Ajuste la tensión cíclica al 10% a 0,4 hercios. Utilice el dial giratorio del biorreactor del chip del órgano para seleccionar el ciclo de regulación y funcionar durante dos horas.

Inspeccione visualmente los depósitos de salida para un aumento en el nivel de medio. Utilice el dial giratorio del biorreactor del chip del órgano para seleccionar el ciclo de regulación. Después del día 17 de cultivo, aspirar diariamente el medio de los depósitos de salida del canal urinario en diagonal lejos del puerto, pero mantener algo de medio en el reservorio.

Reponga el depósito de entrada del canal urinario con hasta tres mililitros de medio de inducción de podocitos cada dos días durante cinco días. Después de cinco días, aspire el medio del canal urinario, pero mantenga algo de medio en el reservorio. Reponga el depósito de entrada del canal urinario diariamente con tres mililitros de medio de mantenimiento de podocitos.

Del mismo modo, aspire el medio desde la salida del canal capilar y reponga los depósitos de entrada diariamente con medio de mantenimiento endotelial. Usando este protocolo, se utilizaron células madre pluripotentes inducidas humanas para desarrollar un modelo funcional in vitro del glomérulo mediante la propagación de células endoteliales vasculares y podocitos. El día 21 después de la inducción de podocitos y la propagación del endotelio vascular, las células dentro de los chips expresaron marcadores de identificación de linaje como Podocin y Nephrine para podocitos, VE Cadherin y PECAM-1 para células endoteliales vasculares.

Tanto el podocitos como las capas de células endoteliales vasculares expresaron colágeno IV, que es la proteína GBM más abundante en el glomérulo renal. Los chips de glomérulo filtraron selectivamente moléculas pequeñas como la inulina del capilar al canal urinario, al tiempo que evitaban que proteínas grandes como la albúmina salieran del canal capilar, mostrando una función de filtración molecular selectiva. Durante la inducción endotelial en los días cuatro a siete, un aumento en el número de células puede resultar en una capa secundaria de células, pero la sobresiembra puede causar agregación que puede impedir la diferenciación.

Se puede observar un flujo cruzado de fluido inesperado entre los canales urinario y capilar en caso de unión inadecuada de los componentes del chip PDMS, bloqueo en la ruta del flujo de fluido o barrera de filtración comprometida. Al sembrar endotelio y epitelio y mantener las virutas desde los días 15 en adelante, es importante inspeccionar visualmente si hay burbujas de aire en los canales en cada paso. En el chip de glomérulo isogénico, se pueden administrar candidatos a fármacos clínicamente relevantes para probar su potencial terapéutico o niveles de toxicidad.

Esta técnica ahora abre oportunidades para comprender la base genética de la enfermedad renal humana y desarrollar terapias personalizadas.