Name: Entrega mediada por electroporación de ribonucleoproteínas Cas9 y ARNm en hepatocitos primarios de ratón recién aislados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprende a editar genes en hepatocitos primarios de ratón mediante electroporación de ribonucleoproteínas Cas9 y ARNm. Este método reproducible permite generar modelos de enfermedades metabólicas hepáticas in vitro e in vivo.

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RNC recibió fondos del Centro de Bioingeniería de Carolina del Sur de Regeneración y Formación de Tejidos Subvención Piloto apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS) de los Institutos Nacionales de Salud, la Asociación Americana para el Estudio de Enfermedades Hepáticas y la Sociedad Americana de Terapia Génica y Celular bajo los números de subvención P30 GM131959, 2021000920, y 2022000099, respectivamente. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de la Sociedad Americana de Terapia Génica y Celular o la Fundación de la Asociación Americana para el Estudio de Enfermedades Hepáticas. El esquema de la Figura 1 se creó con BioRender.com.

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Los autores no tienen intereses contrapuestos que revelar.

Los pasos descritos en el protocolo para el aislamiento de hepatocitos son desafiantes y requieren práctica para la competencia. Hay varios pasos clave para el aislamiento exitoso de hepatocitos del hígado. En primer lugar, la canulación adecuada de la vena cava inferior es esencial para la perfusión hepática completa. La ausencia de blanqueamiento en el hígado después de la perfusión indica desplazamiento del catéter (Tabla 1). La vena cava inferior (perfusión retrógrada) fue canulada en el procedimient...

Los IMD del hígado son trastornos genéticos caracterizados por la deficiencia de una enzima hepática crucial involucrada en el metabolismo que conduce a la acumulación de metabolitos tóxicos. Sin tratamiento, las IMD del hígado resultan en insuficiencia orgánica o muerte prematura 1,2. La única opción curativa para los pacientes con IMD del hígado es el trasplante hepático ortotópico, que es limitado debido a la baja disponibilidad de órganos de donantes y las complicaciones de la terapia inmunosupresora después del procedimiento 3,4. Según datos recientes recopilados por la Red de Procuración y Trasplante de Órganos, solo el 40%-46% de los pacientes adultos en la lista de espera de trasplante hepático reciben un órgano, mientras que el 12,3% de estos pacientes mueren mientras están en la lista de espera5. Además, solo el 5% de todas las enfermedades hepáticas raras tienen un tratamiento aprobado por la FDA6. Está claro que existe una necesidad crítica de nuevos tratamientos para los IMD del hígado. Sin embargo, se requieren modelos de enfermedad apropiados para desarrollar nuevas opciones terapéuticas.
El modelado de enfermedades humanas utilizando sistemas in vitro e in vivo sigue siendo un obstáculo para desarrollar terapias efectivas y estudiar la patología de los IMD del hígado. Los hepatocitos de pacientes con enfermedades hepáticas raras son difíciles de obtener7. Los modelos animales son cruciales para desarrollar una comprensión de la patología de la enfermedad y para probar estrategias terapéuticas. Sin embargo, un obstáculo es la generación de modelos a partir de embriones portadores de mutaciones letales. Por ejemplo, los intentos de crear modelos de ratón del síndrome de Alagille (ALGS) con embriones que contienen deleciones homocigotas de una secuencia de 5 kb cerca del extremo 5′ del gen Jag1 resultaron en la muerte prematura de los embriones8. Además, la generación de modelos de ratón mediante edición de genes en células madre embrionarias puede requerir mucho tiempo y recursos9. Por último, aparecerán mutaciones fuera del tejido diana, dando lugar a variables de confusión que pueden impedir el estudio de la enfermedad9. La edición de genes somáticos permitiría una edición más fácil en el tejido hepático y evitaría los desafíos asociados con la generación de modelos utilizando células madre embrionarias.
La electroporación permite la entrega de CRISPR-Cas9 directamente en el núcleo mediante la aplicación de corrientes de alto voltaje para permeabilizar la membrana celular y es compatible con muchos tipos de células, incluidas aquellas que son intransigentes a las técnicas de transfección, como las células madre embrionarias humanas, las células madre pluripotentes y las neuronas 10,11,12 . Sin embargo, la baja viabilidad es un inconveniente potencial de la electroporación; la optimización del procedimiento puede producir altos niveles de administración al tiempo que limita la toxicidad13. Un estudio reciente demuestra la viabilidad de electroporar componentes CRISPR-Cas9 en hepatocitos primarios de ratón y humanos como un enfoque altamente eficiente14. La electroporación ex vivo en hepatocitos tiene el potencial de ser aplicada para generar nuevos modelos de ratón para IMD humanos del hígado.
Este protocolo proporciona un procedimiento detallado paso a paso para aislar hepatocitos de ratón del hígado y, posteriormente, electroporar CRISPR-Cas9 como complejos RNP, que consisten en proteína Cas9 y ARN sintético de guía única (sgRNA), o ARNm Cas9 combinado con sgRNA para obtener altos niveles de edición de genes en el objetivo. Además, el protocolo proporciona métodos para cuantificar la eficiencia, viabilidad y funcionalidad de la edición de genes después de la electroporación de CRISPR-Cas9 en hepatocitos de ratón recién aislados.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR Tira FLEX-FREE de 8 tubos, tapas planas transparentes adjuntas, natural</td><td>USA Scientific</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>Placas de colágeno de 6 pocillos</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5073</td><td></td></tr><tr><td>accuSpin Micro 17R</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente todo en uno</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice analógico</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>ART Puntas filtradas de diámetro amplio 1.000 y micro; l</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automatizado</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>TC20</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de disección de cera azul</td><td>Braintree Scientific Inc.</td><td>DTW1</td> Rascador/elevador de celdas de <td>9" x 6.5" x 1/2"+F21</td></tr><tr><td>Argos</td><td>Technologies</td><td>UX-04396-53</td> Tubos cónicos <td>estériles y no pirogénicos</td></tr><tr><td>(15 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos (50 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores de algodón</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-170</td><td></td></tr><tr><td>Curvo tijeras</td><td>Cooper Surgical</td><td>62131</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri Desechables</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>100mm,Placas</td></tr><tr><td>de Petri Desechables</td> estériles <td>VWR</td><td>25373-100</td><td>35mm, estériles</td></tr><tr><td>Epoch Microplate Spectrophotometer</td><td>BioTek Instruments</td><td>250082</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Colador de células (70 y micro; m)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Cooper Surgical</td><td>61864</td><td>Euro-Med Adson Pinzas de tejido</td></tr><tr><td>Catéteres IV&nbsp;</td><td>BD</td><td>382612</td><td>24 G x 0,75 en</td></tr><tr><td>IV equipo de infusión</td><td>Baxter</td><td>2C6401</td><td></td></tr><tr><td>MyFuge 12 Mini Centrífuga</td><td>Benchmark Scientific</td><td>1220P38</td><td></td></tr><tr><td>Agujas</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-20</td><td>25 G</td></tr><tr><td>Nucleofector 2b Dispositivo</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>Programa T-028 se utilizó para la electroporación en hepatocitos de ratón</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Masterflex</td><td>&nbsp; HV-77120-42</td><td>De 10 a 60 rpm; de 90 a 260 VCA</td></tr><tr><td>Tubo de bomba de precisión</td><td>Masterflex</td><td>HV-96410-14</td><td>25 pies, silicona</td></tr><tr><td>Placas de cultivo primario</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353846</td><td>Placas de cultivo de tejidos que contienen nitrógeno</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas (25 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-567-604</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas</td><td>BD</td><td></td><td>329464 1 mL, estériles</td></tr><tr><td>Termociclador T100</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>baño de agua</td><td>ALT</td><td>27577</td><td>Termo Scientific Microprocesador de Precisión Controlado Serie 280, 2,5 L</td></tr><tr><td><Reactivos fuertes></fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nucleasa V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9959336</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap Cas9 mRNA</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>L-7606-100</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap&nbsp; ARNm de EGFP</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>L-7201-100</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de Matrigel</td><td>de Corning Ciencias de la Vida</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885076</td><td>Glucosa baja, piruvato</td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>VWR</td><td>71001-652</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermoscientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Mantenimiento de hepatocitos Medio (MM)</td><td>Lonza</td><td>MM250</td><td></td></tr><tr><td>Medio de siembra de hepatocitos (PM)</td><td>Lonza</td><td>MP100</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de ratón ELISA</td><td>Kit Fisher Scientific</td><td>NC0010653</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector de Hepatocitos para ratón/rata</td><td>Lonza</td><td>VPL-1004</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq HotStart ADN polimerasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0481L</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x pH 7.4&nbsp;</td><td>Thermoscientific</td><td>70011-044</td><td>Percoll sin cloruro de calcio o magnesio</td></tr><tr><td>(solución PVP)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-500790A</td><td></td></tr><tr><td>Ácido peryóxico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7875-25G</td><td></td></tr><tr><td>Permount Medio de montaje</td><td>VWR</td><td>100496-550</td><td></td></tr><tr><td>Solución de extracción de ADN QuickExtract Lucigen</td><td>Corporation</td><td>QE05090</td><td></td></tr><tr><td>Schiff' s reactivo de sulfito de fucsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5133</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td>Ensayo</td></tr> de <tr><td>viabilidad de células MTT de Vybrant</td> rojo de fenol <td>ThermoFisher Scientific</td><td>V13154</td><td></td></tr><tr><td><solución >perfusión fuerte 1 (pH 7,4, filtro esterilizado)&nbsp; </fuerte></td><td></td><td></td><td>Estable a 4 & grados; C durante 2 meses</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Fisher Scientific 14155063</td><td></td><td>completo hasta 200 mL</td></tr><tr><td>EGTA (0,5 M)</td><td>Bioworld</td><td>40520008-1</td><td>200 &micro; </td></tr><tr><td>L HEPES (pH 7,3, 1 m)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ16924AE</td><td>2 mL&nbsp;</td></tr><tr><td><solución >perfusión fuerte 2 (pH 7,4, esterilizado con filtro)&nbsp; </fuerte></td><td></td><td></td><td>Estable a 4 & grados; C durante 2 meses</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H20 (1.8 mM)</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td>360 y micro; L de 1 M de culata&nbsp;</td></tr><tr><td>EBSS (sin calcio, sin magnesio, sin rojo de fenol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-155-063</td><td>Completo hasta 200 mL</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ16924AE</td><td>2 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>MgSO4 y punto medio; 7H20 (0.8 mM)</td><td>Sigma</td><td>30391-25G</td><td>160 &micro; L de 1 M</td></tr> <tr><td>< solución >perfusión fuerte 3&nbsp; </fuerte></td><td></td><td></td><td>Preparado fresco antes de usar</td></tr><tr><td>Solución 2</td><td></td><td></td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td>0,094 unidades de Wunsch/mL</td></tr><tr><td><fuerte>Cóctel anestésico para ratones&nbsp; </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acepromzina</td><td></td><td></td><td>0,25 mg/mL concentración final</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td></td><td></td><td>7,5 mg/mL concentración final</td></tr><tr><td>Xilacina</td><td></td><td></td><td>1,5 mg/mL concentración final</td></tr><tr><td>Software</td><td>URL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchling</td><td>https://www.benchling.com/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ImageJ</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>TIDE: Seguimiento de Indels por descomposición</td><td>https://tide.nki.nl/</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

entrega mediada por electroporación de ribonucleoproteínas cas9 y arnm en hepatocitos primarios de ratón recién aislados

Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes

Este protocolo describe un método rápido y eficaz para aislar los hepatocitos primarios de ratón seguido de la administración mediada por electroporación de CRISPR-Cas9 como ribonucleoproteínas (RNPs) y ARNm. Los hepatocitos primarios de ratón se aislaron utilizando un método de perfusión retrógrada de tres pasos, lo que resultó en altos rendimientos de hasta 50 × 106 células por hígado y una viabilidad celular de >85%. Este protocolo proporciona instrucciones detalladas para el recubrimiento, tinción y cultivo de hepatocitos. Los resultados indican que la electroporación proporciona una alta eficiencia de transfección del 89%, medida por el porcentaje de células positivas para proteína fluorescente verde (GFP) y una viabilidad celular modesta de >35% en hepatocitos de ratón.
Para demostrar la utilidad de este enfoque, CRISPR-Cas9 dirigido al gen hidroxifenilpiruvato dioxigenasa se electroporó en hepatocitos primarios de ratón como prueba de principio de edición de genes para interrumpir un gen terapéutico relacionado con una enfermedad metabólica hereditaria (IMD) del hígado. Se observó una mayor edición en el objetivo del 78% para los RNP en comparación con la eficiencia de edición del 47% con ARNm. La funcionalidad de los hepatocitos se evaluó in vitro mediante un ensayo de albúmina que indicó que la administración de CRISPR-Cas9 como RNPs y ARNm da como resultado una viabilidad celular comparable en hepatocitos primarios de ratón. Una aplicación prometedora para este protocolo es la generación de modelos de ratón para enfermedades genéticas humanas que afectan al hígado.

Aislamiento de hepatocitos primarios plateables del hígado El proceso general de perfusión hepática y aislamiento de hepatocitos se ilustra en la Figura 1. En este experimento, se utilizaron ratones C57BL6 / 6J de tipo salvaje de 8 a 10 semanas de edad. Se espera que el procedimiento produzca 20-50 × 106 células por ratón con una viabilidad entre el 85% y el 95%. Si la viabilidad es &lt;70%, se debe seguir el tratamiento con percoll para eliminar las células mu...

Este protocolo describe técnicas para aislar hepatocitos primarios de ratón del hígado y electroporar CRISPR-Cas9 como ribonucleoproteínas y ARNm para interrumpir un gen diana terapéutico asociado con una enfermedad metabólica hereditaria del hígado. Los métodos descritos dan como resultado una alta viabilidad y altos niveles de modificación genética después de la electroporación.

Entrega mediada por electroporación de ribonucleoproteínas Cas9 y ARNm en hepatocitos primarios de ratón recién aislados

This protocol describes a fast and effective method for isolating primary mouse hepatocytes followed by electroporation-mediated delivery of CRISPR-Cas9 ...

La principal ventaja de nuestra técnica es que es un enfoque fácil, rápido y reproducible para editar genes en hepatocitos primarios de ratón como una forma de generar modelos de enfermedades in vitro e in vivo. Usando nuestra técnica, puede ser posible derribar un gen objetivo en hepatocitos aislados y luego trasplantarlos nuevamente al paciente, para reemplazar las células enfermas con hepatocitos editados genéticamente. Los investigadores sin experiencia pueden tener dificultades con la canulación y mantener el catéter estable durante toda la perfusión. Se recomienda a los usuarios que lean y practiquen cuidadosamente el procedimiento y los métodos de solución de problemas antes de comenzar.Demostrando la perfusión hepática y el aislamiento de hepatocitos estarán Tina Parker, gerente de instalaciones clínicas, e Ilayda Ates, asistente de investigación graduada. El procedimiento de electroporación será demostrado por Callie Stuart, una asistente de investigación graduada de mi laboratorio. Bajo un plano quirúrgico de anestesia.Comience la perfusión hepática haciendo una incisión lateral en forma de U en la piel del abdomen con tijeras y expanda el orificio a través de los lados.

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Bioingeniería

El artículo detalla el protocolo específico de sitio de la transfección de revueltos secuencia de siRNA en un cultivo de células adherentes de mamíferos usando una matriz de microelectrodos (MEA).

Alta eficiencia, específica del sitio La transfección de células adherentes con siRNA uso de arrays de microelectrodos (MEA)

Inyección en la vena hidrodinámica cola de vectores de integración basado en el transposón permite la transfección estable de hepatocitos murinos en vivo. Aquí, presentamos un protocolo práctico para sistemas de transfección que permite la expresión constitutiva a largo plazo de un solo transgen o expresión constitutiva e inducible de doxiciclina combinada de un transgén o miR-shRNA en el hígado.

Sistemas inducibles y constitutivos para la modificación genética In Vivo de hepatocitos de ratón mediante la inyección en la vena hidrodinámica cola

El cluster regularmente otro proteínas cortas repeticiones palindrómico/CRISPR asociado 9 (CRISPR/Cas9) sistema proporciona una herramienta prometedora para la ingeniería genética y abre la posibilidad de integración dirigida de los transgenes. Describimos una mediada por homología se terminan uniendo (HMEJ)-estrategia por turnos para ADN eficiente objetivo integración en vivo y dirigida terapias genéticas usando CRISPR/Cas9.

Integración dirigida CRISPR/Cas9-mediada In Vivo mediante una estrategia basada en unirse a final mediada por homología

Un protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediado interrupción de genes en ratón y células hematopoyéticas primarias humanas se describe en este artículo. Cas9 sgRNA ribonucleoproteínas se introducen a través de electroporación con sgRNAs generado a través de transcripción en vitro y Cas9 comercial. Alta eficiencia edición se logra con tiempo limitado y costos financieros.

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de hepatocitos primario de ratón sano y funcional. Para detectar la síntesis hepática de la proteína naciente por substrato etiquetado no radiactivo se instrucciones para ayudar a comprender los mecanismos subyacentes a la síntesis de proteínas en el marco de la homeostasis del metabolismo energético en el hígado.

Aislamiento de hepatocitos primario de ratón para proteína naciente síntesis análisis por el método de etiquetado no radiactivo L-azidohomoalanine

Aquí se presenta un protocolo para la edición eficiente de genes mediados por ribonucleoproteína CRISPR/Cas9 en células de mamíferos mediante electroporación de tubos.

CRISPR/Cas9 Edición génica precisa mediada por Ribonucleoproteína por electroporación de tubo

La traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) permite un aislamiento rápido y eficiente del ARNm de traducción específico del tipo de célula. Aquí, demostramos un método que combina la inyección hidrodinámica de cola-vena en un modelo de ratón de repoblación hepática y TRAP para examinar el perfil de expresión de los hepatocitos repoblados.

Perfilado de expresión génica específico del tipo de celda en el hígado del ratón

Aquí se presenta un protocolo para la electroporación unicelular que puede entregar genes en neuronas excitatorias e inhibitorias a través de un rango de edades in vitro de cultivo de rebanadas de hipocampo. Nuestro enfoque proporciona una expresión precisa y eficiente de genes en células individuales, que se pueden utilizar para examinar las funciones intercelulares y autónomas de la célula.

Electroporación Unicelular A Través De Diferentes Cultivos Organotípicos Slice De Ratón Excitatorio Hipocampal Y Neuronas Inhibitorias Específicas De Clase

Este protocolo describe el procedimiento para la edición del genoma en macrófagos derivados de la médula ósea de ratón utilizando complejos de ribonucleoproteínas Cas9-sgRNA ensamblados in vitro y administrados por electroporación.

Disrupción génica de alta eficiencia en macrófagos primarios derivados de la médula ósea mediante complejos Cas9-sgRNA electroporados

Los nanosensores sol-gel biocompatibles que responden al pH se pueden incorporar en andamios electrohilados de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA). Los andamios autoinformados producidos se pueden utilizar para el monitoreo in situ de las condiciones microambientales mientras se cultivan células en el andamio. Esto es beneficioso ya que la construcción celular 3D se puede monitorear en tiempo real sin perturbar el experimento.

Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

Aprende a editar genes en hepatocitos primarios de ratón mediante electroporación de ribonucleoproteínas Cas9 y ARNm. Este método reproducible permite generar modelos de enfermedades metabólicas hepáticas in vitro e in vivo.

Entrega mediada por electroporación de ribonucleoproteínas Cas9 y ARNm en hepatocitos primarios de ratón recién aislados

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