Name: Cultivos neuronales del hipocampo para detectar y estudiar nuevos anticuerpos patógenos implicados en la encefalitis autoinmune (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Aprende a cultivar neuronas del hipocampo para detectar anticuerpos patógenos en encefalitis autoinmune. Este método permite identificar autoanticuerpos contra receptores de superficie neuronal y mejorar diagnósticos.

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Agradecemos a Merche Rivas, Maria Marsal, Gustavo Castro, Jordi Cortés, Alina Hirschmann y Angel Sandoval (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) y Mercedes Alba, Marija Radosevic, David Soto, Xavier Gasull, Mar Guasp y Lidia Sabater (IDIBAPS, Hospital Clínic, Universidad de Barcelona) por su apoyo técnico y por el suministro de reactivos, y Josep Dalmau y Myrna R. Rosenfeld (IDIBAPS, Hospital Clínic, Universidad de Barcelona) por su revisión crítica del manuscrito y tutoría. Este estudio ha sido financiado por el Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) y cofinanciado por la Unión Europea, FIS (PI20/00280, J.P.), Fundació CELLEX (P.L-A.); Ministerio de Economía y Competitividad - Programa Severo Ochoa para Centros de Excelencia en I&D (CEX2019-000910-S, P.L-A.); Programa CERCA y Laserlab-Europe (871124, P.L-A.); Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033, P.L-A.); y Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).

Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité de ética local de la Universidad de Barcelona siguiendo la normativa europea (2010/63/UE) sobre el uso y cuidado de animales de experimentación. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes y el estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional local para el uso de muestras humanas (Hospital Clínic, HCB/2018/0192).
NOTA: Hay tres partes en el protocolo actual. El primero es para establecer los cultivos neuronales, el segundo es para la detección de anticuerpos de superficie utilizando cultivos vivos de neuronas, y el tercero es para determinar la patogenicidad de estos anticuerpos.
PARTE 1: Establecimiento de cultivos neuronales disociados, fetales y roedores del hipocampo
1. Pasos preparatorios
<ol><li>Recubrimiento de poli-L-lisina de las superficies de recubrimiento (3 días antes de la disección)<ol><li>Prepare el tampón de borato agregando 2,38 g de ácido bórico y 1,27 g de bórax a 500 ml de agua destilada y agitando durante 15 minutos hasta que se disuelva. Bajo una campana, esterilice la solución tampón filtrando (tamaño de poro de 0,2 μm), etiquete y guárdela a temperatura ambiente (RT). NOTA: Esta solución es estable y se puede utilizar durante 6 meses. PRECAUCIÓN: Cuando prepare el tampón de borato, use el equipo de protección personal recomendado.</li>
		<li>Prepare la solución madre de poli-L-lisina (PLL) (100 mg/ml) agregando 1 g de PLL a 10 ml de agua destilada y agitando hasta que se disuelva. Preparar alícuotas de 500 μL de solución madre de PLL. Para alcanzar una concentración final de 1 mg/ml, añadir 500 μL de alícuota de PLL a 50 ml de tampón de borato y agitar hasta que se disuelva, y esterilizar la solución filtrando (tamaño de poro de 0,2 μm). NOTA: Esta solución es estable y se puede utilizar durante 6 meses.</li>
		<li>Prepare las superficies para el recubrimiento. Use cubreobjetos de 12 mm de diámetro para procedimientos de inmunotinción y platos con fondo de vidrio para estudios que incluirán imágenes de neuronas vivas. Si utiliza cubreobjetos, autoclave y luego coloque cinco cubreobjetos en cada plato (3,5 cm de diámetro). NOTA: El grosor del cubreobjetos afecta a la calidad e intensidad de la señal de las imágenes adquiridas. La mayoría de los objetivos del microscopio están diseñados para cubreobjetos #1.5. Elija los cubreobjetos apropiados de acuerdo con la configuración y las técnicas de imagen.</li>
		<li>Bajo una campana, agregue 1,5 ml de solución de PLL a cada plato (plato con fondo de vidrio o plato de 3,5 cm con cinco cubreobjetos). Asegúrese de que todos los cubreobjetos estén sumergidos y almacenados en RT durante 24 h.</li>
		<li>2 días antes de la disección, aspire la solución de PLL y lávese con agua estéril libre de endotoxinas, asegurándose de que los cubreobjetos estén sumergidos. Mantener el agua en los platos y almacenar en RT durante 24 h.</li>
		<li>1 día antes de la disección, aspirar el agua y reemplazarla con medios de cultivo NB + B27 (ver más abajo), y colocar los platos en una incubadora a 37 °C durante 24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de medios de cultivo y solución madre (1 día antes de la disección)<ol><li>Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM): Para 500 mL de DMEM High Glucose (4.5 g/L) sin L-Glutamina y rojo de fenol, agregue 50 mL de suero de caballo, 50 mL de suero fetal bovino (FBS), 10 mL de L-glutamina (200 mM), 10 mL de piruvato de sodio (100 mM), 10 mL de penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL). Filtrar (tamaño de poro de 0,2 μm) y conservar en alícuotas de 5 ml a 4 oC con una tapa bien cerrada. NOTA: Esta solución es estable y se puede utilizar durante 1 mes.</li>
		<li>Medio neurobasal (NB) suplementado con B27 (NB + B27): A 50 mL de medio NB sin rojo fenol, añadir 1 mL de suplemento B27.</li>
		<li>Medio Hibernate-E suplementado con B27 (Hibernate + B27): A 50 mL de medio Hibernate-E, añadir 1 mL de suplemento B27.</li>
		<li>Solución fisiológica extracelular (EPS): A 1 L de agua estéril, agregue lo siguiente a las concentraciones finales especificadas: NaCl (140 mM), KCl (3.5 mM), HEPES (10 mM), glucosa (20 mM) y CaCl 2 (2 mM). Revuelva hasta que se disuelva y ajuste el pH a 7.4 agregando NaOH (0.5 M) o HCl (0.5 M). Bajo la campana, esterilizar filtrando (tamaño de poro de 0,2 μm) y conservar a 4 oC.</li>
	</ol></li>
	<li>Equipo y otros materiales de laboratorio (día de disección)<ol><li>Poner al baño maría a 37 °C. Calentar las siguientes alícuotas: 50 ml de HBSS y 5 ml de DMEM.</li>
		<li>Esterilice las siguientes herramientas sumergiéndolas en un vaso de precipitados que contenga etanol absoluto (Figura 1B): fórceps, pinzas curvas, tijeras, pinzas curvadas finas, pinzas rectas finas, tijeras de cirugía, pinzas de ángulo fino y tijeras de resorte de precisión. NOTA: Para proteger las herramientas, coloque un material blando (por ejemplo, toallitas de precisión científica) en la parte inferior del vaso de precipitados.</li>
		<li>Llene dos bandejas con hielo y coloque los siguientes elementos.<ol><li>Bandeja de hielo 1 (Figura 1C): Coloque las herramientas quirúrgicas en el vaso de precipitados con etanol absoluto, un vaso de precipitados con HBSS para enjuagar las herramientas quirúrgicas, una placa de 10 cm con HBSS para colocar los embriones, una placa de 6 cm con HBSS para colocar las cabezas de los embriones, y una placa de 6 cm con Hibernate + B27 para colocar los cerebros de los embriones.</li>
			<li>Bandeja de hielo 2: Colocar una alícuota de 1 mL de tripsina al 2,5% y una placa de 3,5 cm con Hibernación + B27 para el hipocampo disecado. NOTA: El tiempo necesario para este procedimiento depende de la experiencia del investigador y del número de embriones a diseccionar. Por lo tanto, el hielo debe permanecer congelado durante el tiempo necesario. Las bandejas de poliestireno se recomiendan para este propósito.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Disección y siembra (Figura 1)
<ol><li>Aislamiento del hipocampo NOTA: Las ratas preñadas con embriones en E18 son sacrificadas inmediatamente antes de que comience el protocolo de acuerdo con el comité de ética local de la Universidad de Barcelona, siguiendo la normativa europea (2010/63/UE) sobre el uso y cuidado de animales de experimentación. En este protocolo, se utilizó la inhalación de dióxido de carbono (CO2) como método de eutanasia.<ol><li>Diseccionar a la rata a nivel del peritoneo abdominal con fórceps y tijeras. Extrae el útero con los embriones E18 y colócalo en un plato de 10 cm que se haya enfriado sobre hielo. NOTA: Es importante evitar que los pelos de rata se adhieran a los embriones. Se recomienda utilizar grandes cantidades de etanol al 70% para esterilizar el abdomen. A partir de este paso, trabaje dentro de la campana en la bandeja de hielo 1.</li>
		<li>Abra los sacos embrionarios y transfiera los embriones a la placa de 10 cm con HBSS, asegurándose de que los embriones estén completamente sumergidos.</li>
		<li>Retire la cabeza del embrión con tijeras y colóquela en el plato de 6 cm con HBSS. Repita este proceso con todos los embriones. NOTA: Para evitar la contaminación, todo el tejido, excepto las cabezas de embriones, debe desecharse en un recipiente con tapón de rosca.</li>
		<li>Sostenga la cabeza del embrión con pinzas curvas finas y perfore las órbitas con un par de pinzas rectas finas, entrando en un ángulo de 45 °, y luego suelte las pinzas curvas finas. NOTA: Los fórceps no deben atravesar el cerebro, por lo que es importante mantener el ángulo al entrar.</li>
		<li>Diseccionar la piel y el cráneo con las tijeras de cirugía, comenzando desde el hueso occipital hasta el hueso frontal. Retire el cerebro con un par de pinzas curvas finas y colóquelo en el plato de 6 cm con Hibernate + B27. Repita este proceso hasta que se recuperen todos los cerebros.</li>
		<li>Separe sagitalmente los telencéfalos con los fórceps finos-rectos. NOTA: A partir de este paso, la disección del hipocampo se lleva a cabo bajo un microscopio estereoscópico. Se recomienda utilizar lámparas articuladas para que la luz ilumine la superficie de disección desde los lados. También se recomienda utilizar un fondo negro ya que esto proporciona más contraste, permitiendo distinguir mejor el hipocampo.</li>
		<li>Prepara un plato de 10 cm colocando gotas de Hibernate + B27 a distancias de 1 cm (por ejemplo, en un círculo). Coloque un telencéfalo por gota de Hibernate + B27 y visualice a través del alcance de disección (se recomienda un aumento objetivo de 1.25x).</li>
		<li>Pelar cuidadosamente las meninges y quitar el tálamo para visualizar mejor el hipocampo.</li>
		<li>Diseccionar el hipocampo con las tijeras de resorte de precisión y colocarlo en el plato de 3,5 cm con Hibernate + B27 en la bandeja de hielo 2. Repita para cada telencéfalo hasta que se recojan todos los hipocampos.</li>
		<li>Recoja cuidadosamente todos los hipocampos con una pipeta Pasteur y transfiéralos a un tubo de 50 ml. NOTA: Tome el volumen mínimo de hibernación + B27 al recolectar el hipocampo para no diluir la tripsina.</li>
	</ol></li>
	<li>Disociación celular<ol><li>Disociación enzimática del hipocampo<ol><li>En el tubo de 50 ml que contiene el hipocampo, agregue 1 ml de tripsina al 2,5% y llévelo a un volumen de 5 ml con HBSS. Incubar durante 15 min en el baño maría a 37 °C.</li>
			<li>Para diluir la tripsina, añadir 10 ml de HBSS precalentado e incubar durante 5 min en el baño maría a 37 °C.</li>
			<li>Transfiera los hipocampos que ahora aparecen como una masa de moco a un tubo de 50 ml con una micropipeta de 1.000 μL, agregue 6 ml de HBSS precalentado e incube durante 5 minutos en el baño de agua a 37 ° C.</li>
		</ol></li>
		<li>Disociación mecánica del hipocampo<ol><li>Transfiera la masa a un tubo de 2 ml con fondo cónico, tomando el volumen mínimo. Agregue 1 ml de medio DMEM precalentado. Homogeneizar el pellet con una micropipeta de 1.000 μL aspirando suavemente hacia arriba y hacia abajo. NOTA: Es fundamental evitar generar burbujas al aspirar, ya que las burbujas pueden lisar las células.</li>
			<li>Repita la aspiración hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de vidrio pretirada (10x-20x), con su punta en contacto con el fondo cónico del tubo. Evita generar burbujas. Al final de este paso, la mezcla debe ser translúcida.</li>
			<li>Una vez mezclada homogéneamente de tal manera que la mezcla sea translúcida, transferir la mezcla a un tubo que contenga 4 ml de medio DMEM a 37 °C y homogeneizar con una pipeta de vidrio pipeteando hacia arriba y hacia abajo.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Siembra celular<ol><li>Cuenta las celdas. El número de neuronas en la solución se puede contar de acuerdo con los procedimientos de laboratorio estándar. NOTA: En experimentos de imágenes para la detección de anticuerpos y la actividad del calcio, una concentración de 50.000 células por plato de 3,5 cm es óptima.</li>
		<li>Manteniendo las celdas suspendidas, retire el volumen calculado y coloque en platos de 3,5 cm que contengan cubreobjetos recubiertos con PLL o en los platos con fondo de vidrio recubiertos de PLL.</li>
		<li>Distribuya uniformemente las células en los platos agitando suavemente en movimientos cruzados (hacia adelante y hacia atrás, luego de lado a lado; repita según sea necesario) y coloque los platos en la incubadora deCO2 (5%). NOTA: Es importante utilizar movimientos cruzados para evitar que las células se asienten en la periferia del plato.</li>
		<li>Cada semana, agregue aproximadamente 1 mL de NB + B27, para que el cultivo no se seque. NOTA: Después de 2 semanas (14 días in vitro [div]), las neuronas están maduras y expresan todos los factores que se utilizarán para la experimentación. El número promedio total de neuronas obtenidas utilizando este protocolo es de aproximadamente 2.5 x 106 neuronas provenientes de un promedio de 12 embriones E18 por rata preñada.</li>
	</ol></li>
</ol> 
    PARTE 2: Uso de cultivos neuronales del hipocampo para la detección de anticuerpos en proteínas de la superficie celular neuronal
NOTA: Esta parte del protocolo demuestra cómo se utilizan los cultivos del hipocampo para identificar anticuerpos anti-NMDAR en el suero y/o LCR de pacientes con encefalitis anti-NMDAR. La inmunotinción fluorescente se utiliza para visualizar la reactividad en las neuronas vivas, pero también se podrían utilizar otros métodos de visualización. Un control apropiado para este experimento sería suero o LCR de un individuo sano. Cuando utilice muestras humanas, tenga en cuenta que puede ser necesaria la aprobación del comité de ética institucional.
3. Inmunotinción fluorescente viva
<ol><li>Use 14 células div que se hayan cultivado en cubreobjetos (50,000 células por plato de 3.5 cm que contenga cinco cubreobjetos).</li>
	<li>Dentro de la campana, enjuague los cubreobjetos con NB precalentado a 37 °C.</li>
	<li>Añadir la muestra que en este caso contiene anticuerpos anti-NMDAR (utilizados como anticuerpo primario) diluidos en medios NB a 1:200 para suero o 1:2 para LCR e incubar 1 h a 37 °C (dentro de la incubadora deCO2 (5%).</li>
	<li>Enjuague cuidadosamente con PBS 3x en RT.</li>
	<li>Añadir solución de fijación (formaldehído al 4% en PBS) e incubar a RT durante 5 min. PRECAUCIÓN: Cuando manipule formaldehído al 4%, trabaje dentro de la capucha y use el equipo de protección personal recomendado.</li>
	<li>Lave 3 veces con PBS durante 5 minutos cada una.</li>
	<li>Añadir el anticuerpo secundario Cabra anti-humano AF488 a 1:1000 dilución e incubar a RT durante 1 h. NOTA: Durante la incubación, protéjase de la exposición a la luz cubriendo con papel de aluminio.</li>
	<li>Lave 3 veces con PBS durante 5 minutos cada una. Enjuagar con agua destilada</li>
	<li>Monte los cubreobjetos con un medio de montaje líquido (por ejemplo, medios de montaje antidecolorantes con DAPI; aproximadamente 7 μL), aspire cualquier líquido restante y enjuague con agua destilada. Las neuronas ahora están listas para imágenes de fluorescencia. PRECAUCIÓN: Cuando manipule el medio de montaje, use el equipo de protección personal recomendado.</li>
</ol> 
   
PARTE 3: Demostración de los efectos patógenos de anticuerpos utilizando imágenes de calcio
NOTA: Esta parte del protocolo demuestra cómo determinar si los anticuerpos en pacientes tienen un efecto funcional en los cultivos, lo que sugeriría patogenicidad. Para aumentar la importancia de los efectos, se utilizó un grupo de LCR de ocho pacientes. La actividad de calcio de los cultivos vivos se registró tras la estimulación química (NMDA + glicina) utilizando el indicador de calcio de fluorescencia GECI (GCaMP5G). Estos estudios requieren un microscopio de fluorescencia invertida con una cámara celular que pueda mantener las condiciones fisiológicas requeridas de las neuronas.
4. Imágenes de calcio
<ol><li>Use 14-18 células div que se hayan cultivado en cubreobjetos (50,000 células por plato de 3.5 cm con cinco cubreobjetos)</li>
	<li>1 semana antes de la toma de imágenes, agregue el vector viral pAAV2-CAG-GCaMP5G a 2.5 x10 10 GC / ml a las células e incube durante 5-7 días. NOTA: Este vector AAV serotipo 2 preempaquetado disponible comercialmente sobreexpresa el indicador de calcio codificado genéticamente GCaMP5G bajo un promotor CAG.</li>
	<li>1 día antes de la imagen, añadir la muestra del paciente (en este ejemplo, un pool de LCR diluido 1:25 en NB + B27) e incubar durante 24 h. Siempre filtre muestras humanas (tamaño de poro de 0,2 μm) antes de usarlas para evitar la contaminación. NOTA: Para estos estudios, el control del LCR de sujetos sanos debe ejecutarse en paralelo.</li>
	<li>El día de la obtención de imágenes, prepare la configuración de imágenes y ajuste la cámara celular del microscopio a 37 ° C, llene el carril con agua destilada e infunda con 5% deCO2 para mantener las condiciones fisiológicas celulares.</li>
	<li>En la campana, lavar las celdas del paso 3 con 3 ml de EPS precalentado a 37 °C</li>
	<li>Cubra las células con 2,45 ml de EPS y transfiéralas a la cámara celular del microscopio. Agregue NBQX (10 μM) para bloquear los receptores AMPA y KA para visualizar exclusivamente la respuesta del receptor NMDA.</li>
	<li>En el microscopio de fluorescencia invertido equipado con una lámpara de mercurio y un cubo de filtro FIFC, adquiera una película de 2 minutos con fotogramas grabados cada 100 ms (actividad espontánea). NOTA: Se utilizó un objetivo aéreo 20x NA 0.75, y se tomaron imágenes (512 x 512 píxeles, escala de grises de 16 bits) cada 100 ms con una cámara sCMOS.</li>
	<li>Adquiere la segunda película de 4 min con fotogramas grabados cada 100 ms. Poco después de comenzar la adquisición, agregue una solución de estimulación (NMDA [100 μM] + glicina [1 μM]) al plato. NOTA: La adición de medios en el plato generará turbulencias que podrían interrumpir las condiciones de imagen (enfoque, intensidad de fluorescencia y / o señal de fondo inespecífica). No agregue más de 50 μL de solución en el plato lleno de 2,5 ml para disminuir la probabilidad de tales alteraciones.</li>
	<li>Utilizando el software de procesamiento de imágenes (aquí se utilizó ImageJ), extraer la señal de fluorescencia a lo largo del tiempo, obtenida tras la estimulación, de los cultivos incubados con el paciente y controlar las muestras de LCR. NOTA: Las sondas GCaMP, cuando se unen a iones de calcio libres, sufren un cambio conformacional que hace que se vuelvan más brillantes. Por lo tanto, el aumento en la intensidad de fluorescencia se correlaciona con una afluencia de calcio debido a la despolarización neuronal.</li>
	<li>Determine las regiones de interés (ROI) a analizar. Segmente manualmente los somas de neuronas y agregue los ROI al administrador de ROI (Analyze > Tools > ROI Manager > Add). Guarde el ROI desde el menú ROI Manager (Más > Guardar).</li>
	<li>Defina las medidas (Analizar > Establecer medidas) y seleccione el valor de gris medio. Extraiga el perfil de intensidad de fluorescencia media de los somas de celda haciendo clic en Más > medida múltiple y, a continuación, guarde la tabla generada como una hoja de cálculo .xls.</li>
	<li>Realizar análisis estadísticos para comparar la fluorescencia entre grupos (LCR de los pacientes frente al LCR del control).</li>
</ol>

<ol><li>Dalmau, J., Geis, C., Graus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+synaptic+receptors+and+neuronal+cell+surface+proteins+in+autoimmune+diseases+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to synaptic receptors and neuronal cell surface proteins in autoimmune diseases of the central nervous system.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 839-887 (2017).</li>
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<li>Bahrami, F., Janahmadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+supplements+affect+electrophysiological+properties+and+excitability+of+rat+hippocampal+pyramidal+neurons+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Iranian+Biomedical+Journal%22%5BJournal%5D)">Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture.</a> Iranian Biomedical Journal. 17 (2), 101-106 (2013).</li>
<li>Ricken, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+methods+for+autoantibodies+in+suspected+autoimmune+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Detection methods for autoantibodies in suspected autoimmune encephalitis.</a> Frontiers in Neurology. 9, 841(2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

El creciente campo de la autoinmunidad mediada por anticuerpos ha abierto una ventana de oportunidad para la identificación de autoanticuerpos neuronales que pueden utilizarse para mejorar el diagnóstico y el tratamiento de los pacientes. Los cultivos de neuronas del hipocampo son una herramienta esencial para la identificación de anticuerpos; Por lo tanto, es importante realizar un protocolo estandarizado para obtener resultados confiables y reproducibles. Los pasos más importantes a considerar, las limitaciones y la solución de problemas se discuten aquí.
Los pasos críticos de este protocolo se pueden agrupar en tres categorías dependiendo de si afectan la pureza, la homogeneidad o la viabilidad de las neuronas del hipocampo.
Pureza: para obtener cultivos celulares primarios óptimos, el investigador debe tener confianza, capacitación y capacidad para trabajar rápidamente, especialmente para minimizar el tiempo de la disección. Incluso si las neuronas piramidales son el tipo celular principal, el hipocampo contiene una variedad de interneuronas14. Para generar cultivos con células gliales mínimas, el hipocampo debe extraerse con el mínimo tejido circundante. El uso de un fondo negro durante la disección ayuda a identificar los límites del hipocampo bajo el microscopio estereoscópico. Además, debe tenerse en cuenta que las densidades celulares más bajas resultan en un menor soporte paracrino y dificultan el mantenimiento del cultivo13. Por lo tanto, es importante tener en cuenta este equilibrio. Esto es importante en estudios de imagen que utilizan un número bajo de células (50.000 neuronas por plato de 3,5 cm). Para poder tener tiempo adicional para la extracción del hipocampo, se deben utilizar medios de hibernación que preserven el tejido17. Trabajar con herramientas quirúrgicas adecuadas también es esencial. Las herramientas de alta precisión son delicadas, por lo que la reproducibilidad de la técnica debe garantizarse protegiéndolas cuidadosamente.
Homogeneidad - Para desarrollar un cultivo sin agregados celulares, la disociación celular mecánica se ha mejorado combinando el uso de pipetas de vidrio pre-tiradas con una pipeta estándar de 1.000 μL.
Viabilidad - En este protocolo, no se agregaron antibióticos porque influyen en la excitabilidad neuronal y alteran las propiedades electrofisiológicas de las neuronas cultivadas18. Por lo tanto, la contaminación es muy probable si no se mantienen los más altos estándares de esterilidad. La temperatura también es un factor clave. Mantener el tejido frío durante el aislamiento del hipocampo ralentiza el metabolismo y disminuye la degradación celular. Por lo tanto, el tejido se mantuvo en hielo hasta el proceso de disociación celular. Además, es crucial encontrar el equilibrio correcto durante la disociación celular enzimática que desagrega las células sin una marcada lisis celular. En este protocolo, se han optimizado los tiempos de incubación con tripsina y los pasos de lavado posteriores para obtener células individuales con suficiente espacio para permitir la creación de una red neuronal adecuada.
También se encuentran pasos críticos en la inmunotinción fluorescente en vivo y en los registros de actividad de calcio de los cultivos neuronales. Para realizar con éxito la inmunotinción viva para determinar la presencia de anticuerpos contra las proteínas de la superficie celular en muestras de pacientes, se debe evitar la permeabilización de las células que permitirían el acceso de los anticuerpos a las proteínas intracelulares. Además, en función del título de los anticuerpos, el tiempo de incubación y la dilución de la muestra deben ajustarse en consecuencia (por ejemplo, los anticuerpos de título muy alto pueden dar una tinción de fondo que dificulta la interpretación de los resultados). Al llevar a cabo la evaluación de patogenicidad de los autoanticuerpos con imágenes de calcio, es necesario utilizar un medio que sea óptimo para las mediciones de la actividad celular (por ejemplo, la supresión de Mg2+ en el medio de cultivo es importante para un buen rendimiento). Además, para las imágenes de fluorescencia, se deben evitar los medios con indicadores de pH como el rojo fenol, ya que introducen una señal de fondo no específica.
Hay dos limitaciones principales del uso de cultivos neuronales del hipocampo. En primer lugar, en comparación con las líneas celulares estables, los cultivos primarios deben generarse continuamente, y esto implica el uso regular de animales de laboratorio. Las líneas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) podrían reemplazar la necesidad de usar modelos animales, pero los protocolos de diferenciación para iPSC aún no son óptimos. En segundo lugar, las neuronas derivadas de iPSC no expresan los espectros completos de las proteínas de superficie y, por lo tanto, si se utilizan, la ausencia de reactividad no implica necesariamente la negatividad de la muestra19.
Existen tres métodos para detectar la presencia de autoanticuerpos en el suero o LCR de pacientes sospechosos de tener EA: ensayo basado en tejidos (TBA) utilizando tejido cerebral de rata, ensayo basado en células (CBA) utilizando células HEK transfectadas para expresar proteínas neuronales, y la aplicación reportada aquí usando cultivos vivos de neuronas del hipocampo19. La importancia del método de la neurona del hipocampo cultivada radica en su capacidad para diferenciar la reactividad con antígenos de superficie e intracelulares que no pueden distinguirse fácilmente por TBA. Además, los cultivos neuronales primarios, a diferencia del CBA en las células transfectadas con HEK, no están limitados por el repertorio de proteínas transfectadas. Además, las neuronas cultivadas del hipocampo se pueden utilizar para identificar nuevos anticuerpos y sus antígenos diana cuando se combinan con inmunoprecipitación y espectrometría de masas y, por lo tanto, ampliar el espectro de anticuerpos identificables. Por último, permite la evaluación de los efectos patogénicos de los autoanticuerpos mediante métodos de imagen en vivo que pueden monitorizar alteraciones en la actividad celular. En conclusión, la identificación de nuevos autoanticuerpos eventualmente permite el inicio de inmunoterapias específicas para mejorar los resultados de los pacientes.

La encefalitis autoinmune (EA) es una categoría recientemente descubierta de enfermedades del sistema nervioso central (SNC) mediadas por anticuerpos que se dirigen a la superficie neuronal o proteínas sinápticas 1,2. Las características clínicas varían según el anticuerpo, pero comúnmente incluyen deterioro de la memoria y la cognición, alteración del comportamiento y síntomas psiquiátricos, movimientos anormales, disfunción del sueño, disminución del nivel de conciencia y convulsiones. Estos trastornos pueden afectar a individuos de todas las edades, con algunos tipos de EA que afectan predominantemente a niños y adultos jóvenes2.
En los últimos 15 años, se han descrito 17 síndromes de EA con anticuerpos contra proteínas sinápticas específicas de superficie neuronal (Tabla 1). Algunos ejemplos de las dianas neuronales incluyen los receptores excitatorios sinápticos NMDAR3,4 y AMPAR5, el receptor inhibidor sináptico GABAbR6, la proteína neuronal secretada LGI17 y la molécula de adhesión celular IgLON58. Para la mayoría de estos EA, los estudios han demostrado que los anticuerpos interrumpen la estructura o función de su antígeno diana, apoyando fuertemente un papel patogénico. Por ejemplo, en la encefalitis anti-NMDAR, los anticuerpos reaccionan con el dominio N-terminal de la subunidad GluN1 del NMDAR, produciendo una internalización selectiva y reversible de estos receptores que resulta en alteraciones neuropsiquiátricas prominentes 4,9,10,11. Así, la identificación de cualquiera de los 17 anticuerpos conocidos en el suero o LCR de un paciente también puede utilizarse como prueba diagnóstica que establece el diagnóstico de un EA específico.
Una de las técnicas más utilizadas para la identificación y caracterización de estos anticuerpos incluye el uso de cultivos de neuronas disociadas, fetales y roedores del hipocampo. Estos cultivos son útiles por varias razones: el cerebro embrionario es fácil de disociar y contiene un bajo nivel de células gliales, la principal fuente de contaminación en los cultivos neuronales12; la población celular del hipocampo es relativamente homogénea en comparación con la mayoría de las otras regiones del SNC, con células piramidales que representan la gran mayoría13,14; los cultivos se preparan a partir de embriones en etapa tardía cuando la generación de neuronas piramidales está completa pero las células granulares aún no se han desarrollado, lo que aumenta aún más la homogeneidad del cultivo; Cuando se cultivan, las neuronas piramidales expresan la mayoría de sus principales características fenotípicas, son capaces de formar dendritas bien desarrolladas y establecer redes sinápticamente conectadas que pueden ser utilizadas para investigaciones estructurales y electrofisiológicas12,13; Como los anticuerpos no pueden penetrar en las neuronas vivas, el uso de cultivos vivos permite la identificación de objetivos antigénicos que residen en la superficie celular; y la inmunoprecipitación del complejo anticuerpo-antígeno de cultivos neuronales permite la identificación del antígeno diana5.
El éxito de los estudios que utilizan cultivos neuronales depende en gran medida de la calidad de los cultivos y de los protocolos utilizados para evaluar la inmunorreactividad del suero o líquido cefalorraquídeo (LCR) de un paciente. Las variables que pueden afectar los cultivos incluyen los procedimientos de aislamiento del hipocampo antes del desarrollo del cultivo, la disociación del tejido, la densidad de placa, la superficie de crecimiento utilizada y la composición de los medios13,15,16. Este artículo proporciona un protocolo optimizado para el cultivo celular primario de neuronas del hipocampo de rata fetal combinadas con inmunotinción fluorescente que se puede utilizar para determinar la presencia de anticuerpos contra antígenos AE conocidos y objetivos de superficie potencialmente novedosos. También proporciona un ejemplo de cómo examinar los efectos patogénicos de los anticuerpos NMDAR mediante técnicas de imagen de células vivas utilizando neuronas cultivadas del hipocampo que expresan un indicador de calcio codificado genéticamente (GECI) de la familia GCaMP, GCaMP5G.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Proteína diana</td>
			<td>Función proteica</td>
			<td>Compartimento celular</td>
			<td>Síndrome de Main</td>
		</tr><tr><td>NMDAR (en inglés)</td>
			<td>Ion Chanel</td>
			<td>Proteína sináptica</td>
			<td>Encefalitis anti-NMDAR</td>
		</tr><tr><td>AMPAR</td>
			<td>Ion Chanel</td>
			<td>Proteína sináptica</td>
			<td>Encefalitis límbica</td>
		</tr><tr><td>GluK2</td>
			<td>Ion Chanel</td>
			<td>Proteína sináptica</td>
			<td>Encefalitis</td>
		</tr><tr><td>GABAaR</td>
			<td>Ion Chanel</td>
			<td>Proteína sináptica</td>
			<td>Encefalitis</td>
		</tr><tr><td>GABAbR</td>
			<td>Receptor metabotrópico</td>
			<td>Proteína sináptica</td>
			<td>Encefalitis límbica</td>
		</tr><tr><td>mGluR1</td>
			<td>Receptor metabotrópico</td>
			<td>Proteína sináptica</td>
			<td>Encefalitis</td>
		</tr><tr><td>mGluR2</td>
			<td>Receptor metabotrópico</td>
			<td>Proteína sináptica</td>
			<td>Encefalitis</td>
		</tr><tr><td>mGluR5</td>
			<td>Receptor metabotrópico</td>
			<td>Proteína sináptica</td>
			<td>Encefalitis</td>
		</tr><tr><td>D2R</td>
			<td>Receptor metabotrópico</td>
			<td>Proteína sináptica</td>
			<td>Encefalitis de los ganglios basales</td>
		</tr><tr><td>LGI1</td>
			<td>Molécula de adhesión</td>
			<td>Proteína de la superficie celular</td>
			<td>Encefalitis límbica</td>
		</tr><tr><td>CASPR2</td>
			<td>Molécula de adhesión</td>
			<td>Proteína de la superficie celular</td>
			<td>Encefalitis límbica</td>
		</tr><tr><td>IgLON5</td>
			<td>Molécula de adhesión</td>
			<td>Proteína de la superficie celular</td>
			<td>Enfermedad anti-IgLON5</td>
		</tr><tr><td>Neurexina-3α</td>
			<td>Molécula de adhesión</td>
			<td>Proteína de la superficie celular</td>
			<td>Encefalitis</td>
		</tr><tr><td>DNER (Tr)</td>
			<td>Proteína transmembrana</td>
			<td>Proteína de la superficie celular</td>
			<td>Encefalitis</td>
		</tr><tr><td>SEZ6L</td>
			<td>Proteína transmembrana</td>
			<td>Proteína de la superficie celular</td>
			<td>Encefalitis</td>
		</tr><tr><td>Anfifisina</td>
			<td>Molécula estructural</td>
			<td>Proteína de la superficie celular</td>
			<td>Encefalitis límbica</td>
		</tr><tr><td>DPPX</td>
			<td>Peptidasa</td>
			<td>Proteína de la superficie celular</td>
			<td>Encefalitis</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Anticuerpos contra la superficie celular neuronal y proteínas sinápticas.

<table><tbody><tr><td>10 cm Plato de cultivo celular</td><td>Nunc</td><td>12-565-020</td><td></td></tr><tr><td>12 mm cubreobjetos redondos</td><td>Fisher</td><td>NC9708845</td><td></td></tr><tr><td>20x NA 0.75 S Objetivo de aire fluorado</td><td>Nikon</td><td>CFI Super Fluor 20X</td><td></td></tr><tr><td>3.5 cm Plato de cultivo celular</td><td>Nunc</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Plato de cultivo celular</td><td>Nunc</td><td>12-565-94</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados 100 mL</td><td>Pirex-Bórax</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Pinza curva</td><td>FST</td><td>11009-13</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Alta glucosa (4,5 g/L), sin L-glutamina, sin fenol Rojo</td><td>Capricornio</td><td>DMEM-HXRXA</td><td></td></tr><tr><td>Rata Wistar hembra (18 días de gestación)</td><td>Janvier-Fetal</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Suero Bovino (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de ángulo fino</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de curvatura fina</td><td>FST</td><td>11272-30</td><td></td></tr><tr><td>Pinza recta fina</td><td>FST</td><td>11251-23</td><td></td>Cubo de</tr><tr><td>filtro FITC</td> Pinza <td>Nikon</td><td>Standard Series</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-Humano AF488</td><td>Invitrogen</td><td>A11013</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Capricornio</td><td>HBSS-1A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Medio de hibernación-E</td><td>Gibco</td><td>A12476-01</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo (HS)</td><td>Thermofisher</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-NMDAR humano (CSF)</td><td>Muestra</td> <td>de paciente-Anticuerpo</td><td></td></tr> <tr><td>humano anti-NMDAR (suero)</td>Muestra <td></td><td></td>de <td></td></tr><tr><td>paciente-ImagenJ/Fiji</td><td>NIH</td><td>v1.50i</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia invertida</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44675</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Biowest</td><td>X0550-100</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de mercurio</td><td>Nikon</td><td>C-HGFI</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de celdas del microscopio</td><td>Custom-build-NaCl</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9887</td><td></td></tr><tr><td>NBQX</td><td>Tocris</td><td>373</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal sin rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>NMDA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2-CAG-GCaMP5G</td> VectorBiolabs-Paraformaldehído <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4%</td><td>Thermo scientific</td><td>J199943-K2</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Biowest</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina</td> <td>tamponada con fosfatoGibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lisine (PLL)</td><td>Péptido internacional</td><td>OKK-35056</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de hielo de poliestireno</td><td>:</td><td></td> <td>tapa reutilizada de una caja de poliestireno</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte de precisión</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold con DAPI (medios de montaje antidecoloración)</td><td>Sondas moleculares</td><td>P36941</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>FST</td><td>14068-12</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Biowest</td><td>L0642-100</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de cirugía</td><td>FST</td><td>14081-09</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 2.5%</td><td>Gibco</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Agua, estéril libre de endotoxinas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr></tbody></table>

cultivos neuronales del hipocampo para detectar y estudiar nuevos anticuerpos patógenos implicados en la encefalitis autoinmune

Hippocampal Neuronal Cultures to Detect and Study New Pathogenic Antibodies Involved in Autoimmune Encephalitis

En los últimos 15 años, se ha caracterizado una nueva categoría de enfermedades mediadas por anticuerpos del sistema nervioso central (SNC) y ahora se define como "encefalitis autoinmune" (EA). Actualmente hay 17 síndromes de EA conocidos, y todos están asociados con anticuerpos contra la superficie celular neuronal o proteínas sinápticas. Los síndromes clínicos son complejos y varían según el tipo de anticuerpo asociado. La más conocida de estas enfermedades es la encefalitis anti-N-metil D-aspartato (NMDAR), que es un trastorno neuropsiquiátrico prominente asociado con graves trastornos de memoria y comportamiento. Los anticuerpos asociados reaccionan con la subunidad GluN1 del NMDAR en el dominio N-terminal. El enfoque más utilizado para el descubrimiento y caracterización de anticuerpos EA incluye el cultivo de neuronas disociadas, fetales y roedores del hipocampo. Durante el proceso de caracterización de anticuerpos, las neuronas vivas en cultivo se exponen al suero o LCR de los pacientes, y la detección de reactividad indica que las muestras de suero o LCR del paciente contienen anticuerpos contra antígenos de superficie neuronal. Los cultivos del hipocampo también se pueden usar para determinar si los anticuerpos en pacientes son potencialmente patógenos examinando si causan alteraciones estructurales o funcionales de las neuronas. El nivel de éxito de estos estudios depende de la calidad de los cultivos y de los protocolos utilizados para obtener y detectar la reactividad de las muestras de pacientes. Este artículo proporciona un protocolo optimizado para el cultivo celular primario de neuronas del hipocampo de ratas fetales combinadas con inmunotinción para determinar la presencia de anticuerpos en el suero o LCR de los pacientes. También se presenta un ejemplo de cómo examinar los posibles efectos patogénicos de los anticuerpos NMDAR utilizando neuronas cultivadas e imágenes de calcio.

Establecimiento de cultivos neuronales disociados, fetales y roedores del hipocampo El protocolo presentado aquí se basa en los influyentes estudios sobre el cultivo de células nerviosas realizados por Banker y Goslin15. El protocolo se ha perfeccionado para obtener cultivos neuronales con morfología, densidad y pureza óptimas para realizar estudios de detección de anticuerpos de superficie neuronal. El protocolo de disección y siembra se divide en tres partes (Figura 1A). La primera parte, el aislamiento del hipocampo, consiste en la extracción quirúrgica del tejido vivo (Figura 1A, panel izquierdo). Como indica la figura, las ratas Wistar preñadas con embriones E18 son el material de partida clave para un cultivo exitoso. Una vez que se extrae el cerebro de los embriones E18, la microcirugía se lleva a cabo bajo un microscopio estereoscópico. Con las herramientas adecuadas (Figura 1B) y un manejo preciso, es posible separar el hipocampo del resto del tejido nervioso. La disposición de los tejidos en los medios específicos se representa en la Figura 1C. La segunda parte del protocolo consiste en la disociación celular del hipocampo. Se subdivide en dos pasos (Figura 1A, panel central): disociación enzimática y disociación mecánica del hipocampo, que dan como resultado células individuales intactas y disociadas. Utilizando esta metodología, es posible obtener cultivos celulares sin agregados celulares, como se representa en la Figura 2A-D. La tercera parte del protocolo consiste en la siembra de celdas (Figura 1A, panel derecho). Esta parte del protocolo es crucial para ajustar la densidad y homogeneidad del cultivo neuronal en la placa. Contar las células y sembrar 50.000 neuronas en un área de una placa de 3,5 cm proporciona una densidad óptima para llevar a cabo no solo experimentos para determinar la presencia de anticuerpos contra proteínas de la superficie celular neuronal (Figura 3) sino también para analizar la patogenicidad de estos anticuerpos con imágenes de calcio (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63829/63829fig01.jpg" style="opacity: 0.9;"> Figura 1: Protocolo visual para cultivos primarios de neuronas del hipocampo. (A) Diagrama de flujo que muestra las tres partes del protocolo para preparar cultivos de células disociadas de neuronas del hipocampo de ratas embrionarias en E18. El protocolo se divide en 1. Aislamiento del hipocampo, 2. Disociación celular, y 3. Siembra celular. (B) Selección de herramientas recomendadas para el aislamiento del hipocampo agrupadas en tres categorías: (1- Fórceps, 2- Fórceps curvos, 3- Tijeras) para la recolección de embriones, (4- Pinzas curvadas finas, 5- Pinzas rectas finas, 6- Tijeras de cirugía) para la extracción de cerebro, y (7- Pinzas de ángulo fino, 8- Tijeras de resorte de precisión) para el aislamiento del hipocampo. (C) Representación esquemática de la bandeja de hielo 1 con placas y medios necesarios para el aislamiento del hipocampo. Los embriones y las cabezas se colocan en HBSS, mientras que los cerebros se colocan en medio de hibernación + B27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63829/63829fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los cultivos de neuronas del hipocampo a 18 div son maduros, interconectados y expresan proteínas estructurales y funcionales. En el crecimiento y maduración de los cultivos neuronales se pueden apreciar dos fases diferenciadas: la fase de polarización de la neurona (Figura 2A,B) y la fase de desarrollo dendrítico y construcción de la red sináptica (Figura 2C,D). Las células en 1 div se distribuyen uniformemente y se han adherido a la placa, desarrollando una lámina alrededor del cuerpo celular con neuritas menores que comienzan a extenderse (Figura 2A). Después de algunos días en cultivo, las neuritas se extienden una corta distancia. Las células muestran una polarización significativa, pero hay poco crecimiento neto (Figura 2B). Después de esta etapa, la sinaptogénesis es prominente y las neuronas comienzan a interconectarse. La red neuronal sigue creciendo y se vuelve más compleja (Figura 2C). A los 18 div, las neuronas están maduras e interconectadas; se construye la red neuronal (Figura 2D). Una vez que las espinas sinápticas se forman y conectan, las neuronas están completamente polarizadas y expresan todas las proteínas funcionales y estructurales. De las muchas proteínas expresadas por neuronas cultivadas maduras, el receptor neuronal NMDA (Figura 2E) y la proteína sináptica PSD95 (Figura 2F) han sido elegidos aquí como marcadores representativos. Además, es posible visualizar selectivamente los axones marcando neurofilamentos (NF) (Figura 2G) y visualizando dendritas dirigiéndose a la proteína MAP2 (Figura 2H).<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63829/63829fig02.jpg"> Figura 2: Curso temporal de la maduración de cultivos celulares disociados de neuronas del hipocampo. (A-D) Imágenes de contraste de fase de neuronas del hipocampo durante los primeros 18 días de cultivo. (A) Neuronas a 1 div al unirse al sustrato recubierto de PLL. (B) La aparición de pequeñas neuritas en neuronas a 5 div. (C) Las neuronas a 11 div han desarrollado neuritas largas que se alargan y adquieren características axonales. (D) Las neuronas a 18 div son maduras y han formado una red neuronal. Barra de escala (A-D) = 40 μm. (E-H) Imágenes fluorescentes representativas tomadas por microscopía de barrido láser confocal utilizando marcadores selectivos para mostrar neuronas maduras a 18 div. Los cultivos neuronales se fijaron e inmunotiñeron con anticuerpos que tiñen selectivamente (E) receptor neuronal (NMDAR), (F) marcador sináptico (PSD95), (G) marcador axonal (neurofilamento, NF) y (H) marcador dendrítico (MAP2). Barra de escala (E-H) = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63829/63829fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los anticuerpos en muestras de pacientes reaccionan con antígenos de superficie celular neuronal Las muestras (suero y LCR) obtenidas de pacientes que tienen encefalitis anti-NMDAR contienen autoanticuerpos que reconocen el NMDAR presente en la superficie de las neuronas. La incubación de los cultivos con las muestras de pacientes produce una intensa señal de fluorescencia en la superficie celular y las dendritas (Figura 3A,C). Por el contrario, las muestras control no producen señal de fluorescencia cuando se administran a los cultivos neuronales (Figura 3B, D). Estos hallazgos muestran cómo los cultivos se pueden utilizar para detectar anticuerpos en muestras de pacientes y pueden conducir a la identificación de nuevos anticuerpos que se dirigen a la superficie celular neuronal. 
La muestra de LCR del paciente disminuye la concentración de calcio intracelular en cultivos de neuronas del hipocampo inducidos por NMDA Para evaluar el efecto de los anticuerpos de los pacientes sobre la actividad neural (después de 24 h de tratamiento), los transitorios de calcio intracelular se monitorizaron ópticamente desde las neuronas cultivadas en tiempo real tras la estimulación mediada por NMDA. La aplicación de NMDA genera un aumento en la intensidad de fluorescencia, como lo indica un cambio en la fluorescencia verde intracelular (Figura 4A y Video Suplementario 1). Las neuronas tratadas con la muestra de LCR control mostraron una mayor diferencia en la intensidad de fluorescencia (56%) cuando se aplicó el estimulador en comparación con las células tratadas con la muestra de LCR del paciente. Se midieron las diferencias en la intensidad de fluorescencia y se compararon las curvas de estimulación mediadas por NMDA a partir de los datos extraídos del soma de las células (Figura 4B, C). Las curvas de estimulación muestran que hubo una afluencia intracelular de calcio en ambos escenarios, pero los cultivos tratados con LCR (línea gris) de los pacientes mostraron una respuesta menor que los cultivos tratados con control (línea negra). Estos resultados demuestran que los anticuerpos presentes en el LCR de los pacientes disminuyen la actividad celular debido a la interacción de los anticuerpos con el NMDAR, y por lo tanto causan un efecto patogénico.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63829/63829fig03.jpg"> Figura 3: Los anticuerpos del paciente reaccionan con la superficie de los cultivos neuronales. (A,E) El suero y el LCR de pacientes con encefalitis anti-NMDAR reaccionan con la superficie celular de las neuronas vivas del hipocampo de rata, (B,F), mientras que el suero y el LCR de los sujetos control no muestran reactividad. Barra de escala (A,B,E,F) = 20 μm. Imagen de mayor aumento de una dendrita (63x) que muestra el patrón superficial típico de reactividad para (C, G) el suero del paciente y el LCR y (D, H) negativo para los controles. Las imágenes fueron tomadas por microscopía de barrido láser confocal. Barra de escala = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63829/63829fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63829/63829fig04.jpg"> Figura 4: Los anticuerpos de los pacientes reducen la afluencia de calcio en las neuronas de rata que expresan GCaMP5G. (A) La administración de solución de estimulación (NMDA [100 μM] + glicina [1 μM]) en cultivos de neuronas desencadenó una afluencia de calcio, como lo indica el aumento de la fluorescencia verde intracelular (pico de estimulación), en comparación con la imagen tomada antes de la estimulación (preestimulación). Después de 120 s, la intensidad de la fluorescencia disminuye y se estabiliza (post-estimulación). Los cultivos tratados con LCR de los pacientes mostraron una reducción significativa (56%) en el aumento de calcio mediado por NMDA en comparación con el LCR del control. Las imágenes fueron tomadas por microscopía de fluorescencia. Barra de escala = 20 μm. (B) Un gráfico de uno de los tres experimentos independientes que representan la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo (180 s) para los cultivos tratados con LCR (línea negra) de control y LCR (línea gris) de los pacientes tras la estimulación NMDA (flecha azul). n(LCR de los controles) = 20 células; n (LCR de los pacientes) = 28 células. Los datos se representan como media ± SEM. (C) Los diagramas de caja muestran la mediana, los percentiles 25 y 75. Los bigotes indican los valores mínimo y máximo. La evaluación de la significancia se realizó mediante análisis bidireccional de varianza (ANOVA; p &lt; 0,0001) y pruebas U de Mann-Whitney (p &lt; 0,0001). Un valor de p &lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63829/63829fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Video suplementario 1: Video que muestra dos neuronas del hipocampo que expresan GCaMP5G una al lado de la otra: neurona tratada con LCR de control (izquierda) vs. neurona tratada con LCR de pacientes (derecha). La aplicación de NMDAR (estimulación) genera un aumento de la intensidad de fluorescencia intracelular en ambos casos, pero con un nivel significativamente mayor en la neurona tratada con el LCR del control sobre el tratado con el LCR de los pacientes. Las imágenes fueron tomadas por microscopía de fluorescencia y editadas con ImageJ aplicando la tabla de búsqueda (LUT) Fire. 1700 cuadros (170 s); acelerado 5 veces. Barra de escala = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63829/Supplemental%20Video%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

La encefalitis autoinmune es una nueva categoría de enfermedades mediadas por anticuerpos del sistema nervioso central. Las neuronas del hipocampo se pueden utilizar para descubrir y caracterizar estos anticuerpos. Este artículo proporciona un protocolo para el cultivo celular primario y la inmunotinción para determinar los autoanticuerpos en el suero y el líquido cefalorraquídeo de los pacientes.

Cultivos neuronales del hipocampo para detectar y estudiar nuevos anticuerpos patógenos implicados en la encefalitis autoinmune

Over the last 15 years, a new category of antibody-mediated diseases of the central nervous system (CNS) has been characterized and is now defined as ...

Este protocolo es significativo porque nos permitió identificar si una muestra de paciente contenía anticuerpos patógenos. La principal ventaja de esta técnica radica en su capacidad para diferenciar la reactividad entre antígenos de superficie e intracelulares, que no pueden ser fácilmente discriminados por otros métodos. Las neuronas culturales del hipocampo se utilizan para identificar nuevos anticuerpos.La identificación de estos nuevos anticuerpos permite finalmente el inicio de un específico en monoterapias para mejorar los resultados de los pacientes. Esta técnica es importante porque puede extenderse a todo el campo de las enfermedades relacionadas con anticuerpos patógenos dirigidos a proteínas de superficie neuronal. Sosteniendo la cabeza del embrión con pinzas curvas finas, perfore las órbitas con un par de pinzas rectas finas en un ángulo de 45 grados.Luego suelte las pinzas curvas finas. Con la ayuda de tijeras quirúrgicas, diseccionar la piel y el cráneo comenzando desde el hueso occipital hasta el hueso frontal. Luego retire el cerebro con un par de pinzas curvas finas y recójalo en el plato de seis centímetros con hibernación más B27.Una vez que se recuperan los cerebros de todos los embriones, use las pinzas rectas finas para separar sagitalmente los telencéfalos. A continuación, prepare un plato de 10 centímetros colocando gotas de hibernación más B27 a una distancia de un centímetro en un círculo, y coloque un telencéfalo por gota para visualizar a través del alcance de disección a un aumento de 1.25 X. Mientras trabaja bajo el microscopio, retire cuidadosamente el tálamo y pele las meninges para visualizar mejor el hipocampo.Luego disecciona el hipocampo con las tijeras de resorte de precisión. Y colocarlo en el plato de 3,5 centímetros con hibernar más B27 e istrate dos. Repita el procedimiento para recoger todos los hipocampos.Para la disociación enzimática del hipocampo, agregue un mililitro de tripsina al 2,5% en el tubo de 50 mililitros que contiene el hipocampo. Después de llevar el volumen en el tubo a cinco mililitros con HBSS, incubar el tubo durante 15 minutos en el baño de agua a 37 grados centígrados. Para diluir aún más la tripsina, agregue 10 mililitros de HBSS precalentado y vuelva a colocar el tubo en el baño de agua, establecido a 37 grados centígrados durante cinco minutos.A continuación, use una micropipeta de 1000 microlitros para transferir el hipocampo que aparece como una masa de moco a un tubo de 50 mililitros. E incubar el tejido con seis mililitros de HBSS precalentado durante cinco minutos, como se demuestra. Para disociar el tejido mecánicamente, transfiera la masa del hipocampo a un tubo de dos mililitros con fondo cónico.Después de agregar un mililitro de medio DMEM precalentado, homogeneice el pellet con una micropipeta de 1000 microlitros aspirando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Asegurándose de no crear burbujas, repita la aspiración hacia arriba y hacia abajo de 10 a 20 veces con una pipeta de vidrio previamente tirada con su punta en contacto con el fondo cónico del tubo hasta que la mezcla esté translúcida. Cuente las celdas antes de distribuirlas uniformemente en un plato de 3,5 centímetros con movimientos de agitación cruzada.Una vez hecho esto, coloque el plato en la incubadora con 5% de dióxido de carbono. Para la inmunotinción fluorescente de células in vitro de 14 días, agregue la muestra que contiene anticuerpos Anti-NMDAR a los cubreobjetos e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de una hora, tratar la muestra con formaldehído al 4% y PBS como una solución de fijación a temperatura ambiente durante cinco minutos.Luego lave la muestra empujada con PBS durante cinco minutos cada una, seguida de la adición de anticuerpo secundario de cabra anti-humano Alexa Fluor 488 en una dilución a 1000 durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, monte los cubreobjetos que contienen la muestra con un medio de montaje líquido y aspire cualquier líquido restante. Visualice las neuronas con imágenes de fluorescencia.Para obtener imágenes de calcio, use de 14 a 18 días células in vitro que se hayan cultivado en cubreobjetos. Antes de la obtención de imágenes, trate las células con el vector viral que codifica pAAV2 CAG GCaMP 5G a 2,5 veces 10 a la décima copia del genoma por mililitro durante cinco a siete días. Un día antes de la toma de imágenes, incubar las células con la muestra del paciente durante 24 horas.El día de la imagen, prepare la configuración y ajuste la cámara celular del microscopio a 37 grados centígrados. Llene el carril con agua destilada, infundirlo con 5% de dióxido de carbono para mantener las condiciones fisiológicas celulares. Después de cubrir las células con solución fisiológica extracelular, transfiéralas a la cámara celular del microscopio.Agregue 10 NBQX micromolares para bloquear los receptores AMPA y KA, y visualice la respuesta del receptor NMDA. Adquiere la película de cuatro minutos con los fotogramas grabados cada 100 milisegundos. Poco después de comenzar la adquisición, agregue una solución de estimulación al plato.Tras la estimulación, extraer la señal fluorescente a lo largo del tiempo del cultivo incubado con el control y las muestras de líquido cefalorraquídeo o LCR del paciente utilizando software de procesamiento como Image J.It se observó que las células en un día in vitro se distribuyeron uniformemente y se adhirieron a la placa con una lámina que se desarrolla alrededor del cuerpo celular y neuritas menores que comienzan a extenderse. Después de algunos días en cultivo, las neuritas se extendieron una corta distancia y las células mostraron una polarización significativa. La red neuronal siguió creciendo y se volvió compleja.A los 18 días, las neuronas estaban maduras, interconectadas y construyeron la red neuronal. Las imágenes fluorescentes representativas muestran neuronas maduras a los 18 días utilizando marcadores selectivos. La incubación de los cultivos con las muestras de pacientes produjo una intensa señal de fluorescencia ya que contiene los autoanticuerpos que reconocieron el receptor NMDA presente en la superficie de las neuronas.Por el contrario, las muestras de control no produjeron señal fluorescente cuando se administraron a los cultivos neuronales. La aplicación de NMDA aumentó la intensidad de fluorescencia como lo indica un cambio en la fluorescencia verde intracelular. Cuando se aplicó el estimulador, las neuronas tratadas con la muestra de LCR de control mostraron una mayor diferencia en la intensidad de fluorescencia que las células tratadas con la muestra de LCR de los pacientes.La identificación de propiedades y la disección del hipocampo determinan la pureza de los cultivos. La agregación celular es un factor clave, especialmente cuando se utilizan los cultivos con fines de obtención de imágenes. Además, las neuronas cultivadas del hipocampo se pueden utilizar para identificar nuevos anticuerpos y sus antígenos diana cuando se combinan con técnicas de inmunoprecipitación y espectrometría de masas.Esta técnica ha permitido la caracterización de una nueva categoría de enfermedades mediadas por anticuerpos. Por lo tanto, es esencial en el estudio del nuevo campo de la nanoinmunología.

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Investigación

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Neurociencia

Este video muestra una técnica para identificar anticuerpos contra antígenos específicos en una muestra utilizando un cultivo neuronal de hipocampo de rata. Al exponer neuronas cultivadas a muestras de pacientes que contienen autoanticuerpos dirigidos a los receptores de N-metil-D-aspartato (NMDAR), la presencia de autoanticuerpos unidos a la superficie neuronal se revela a través de la inmunotinción.

Un ensayo para detectar autoanticuerpos en suero humano utilizando un cultivo neuronal del hipocampo

La adición de palmitato reversible a las proteínas es un importante regulador de tráfico intracelular de proteínas. Esto es de particular interés en las neuronas donde muchas proteínas sinápticas se palmitoilada. Nosotros utilizamos un método simple bioquímico para detectar proteínas palmitoiladas en las neuronas cultivadas, que pueden ser adaptados para múltiples tipos de células y tejidos.

La detección de palmitoilación proteínas en neuronas del hipocampo cultivadas por inmunoprecipitación e Intercambio Acyl-Biotina (ABE)

Durante los últimos años, los ensayos basados ​​en células vivas se han utilizado con éxito para detectar anticuerpos contra antígenos de superficie y conformacionales. Aquí se describe un método que utiliza el flujo de alto rendimiento citometría permite el análisis de grandes cohortes de pacientes. La detección de nuevos anticuerpos será mejorar el diagnóstico y el tratamiento de trastornos del sistema inmune-mediada.

Ensayo de alto rendimiento basado en células citometría de flujo para detectar anticuerpos a la N-metil-D-aspartato receptor o dopamina-2 del receptor en suero humano

Hemos expresado ectopically subunidad NR1 del receptor NMDA etiquetada con proteína verde fluorescente en células embrionarias humanas (HEK293) como antígeno para detectar autoanticuerpos contra el receptor de NMDA en la sangre de pacientes con encefalitis autoinmune. Este sencillo método puede ser adecuado para la detección de propósitos en contextos clínicos.

Un análisis de la inmunofluorescencia celular Simple para detectar autoanticuerpos contra el Receptor N-metil-D-Aspartato (NMDA) en sangre

Aquí, presentamos los protocolos para investigar el deterioro de la unidad neurovascular durante la encefalomielitis autoinmune experimental en vivo. Específicamente abordamos cómo determinar permeabilidad de la barrera blood - brain y gelatinasa actividad involucrada en la migración de leucocitos a través de la glía INCURVATA4.

Visualizar el deterioro de las barreras endoteliales y Glial de la unidad Neurovascular durante la encefalomielitis Autoinmune Experimental In Vivo

Este artículo presenta un método para estudiar el tráfico de receptores de glutamato (GluR) en cultivos hipocampales primarios disociados. Utilizando un enfoque de alimentación de anticuerpos para etiquetar receptores endógenos o sobreexpresados en combinación con enfoques farmacológicos, este método permite la identificación de mecanismos moleculares que regulan la expresión superficial de GluR modulando procesos de internalización o reciclaje.

Un enfoque de alimentación de anticuerpos para estudiar el tráfico de receptores de glutamato en cultivos hipocampales primarios disociados

Este manuscrito presenta un protocolo para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental activa (EAE) en ratones. También se presenta un método para el aislamiento y caracterización de los linfocitos infiltrados en el sistema nervioso central (SNC) para mostrar cómo los linfocitos participan en el desarrollo de la enfermedad autoinmune del SNC.

Análisis citométrico de flujo de infiltración de linfocitos en el sistema nervioso central durante la encefalomielitis autoinmune experimental

Presentamos aquí un protocolo sobre cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de cortezas de rata para imágenes de video de lapso de tiempo de Ca2+ intracelular para la investigación sobre fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica en el modelo de rata hSOD1G93A .

Cultivos primarios de astrocitos de rata y microglia y su uso en el estudio de la esclerosis lateral amiotrófica

Este protocolo presenta una forma única de generar cultivos celulares del sistema nervioso central a partir de cerebros embrionarios de ratón del día 17 para la investigación neuro(inmuno)lógica. Este modelo se puede analizar utilizando varias técnicas experimentales, incluyendo RT-qPCR, microscopía, ELISA y citometría de flujo.

Establecimiento de cultivos mixtos de células neuronales y gliales a partir de cerebros embrionarios de ratones para estudiar la infección y la inmunidad innata

Hasta la fecha, los protocolos para el aislamiento simultáneo de todos los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central del mismo ratón son una demanda insatisfecha. El protocolo muestra un procedimiento aplicable en ratones con encefalomielitis autoinmune naïve y experimental para investigar redes celulares complejas durante la neuroinflamación y, al mismo tiempo, reducir el número de ratones requerido.

Aislamiento simultáneo de los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central de ratones adultos con encefalomielitis autoinmune

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal de esclerosis múltiple (EM), que comparte con la enfermedad humana una respuesta autoinmune humoral robusta. En este trabajo presentamos un protocolo ELISA sencillo y flexible para cuantificar autoanticuerpos en el suero de ratones inmunizados con EAE.

Cuantificación de anticuerpos autorreactivos en ratones tras encefalomielitis autoinmune experimental

Aprende a cultivar neuronas del hipocampo para detectar anticuerpos patógenos en encefalitis autoinmune. Este método permite identificar autoanticuerpos contra receptores de superficie neuronal y mejorar diagnósticos.

Cultivos neuronales del hipocampo para detectar y estudiar nuevos anticuerpos patógenos implicados en la encefalitis autoinmune

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