Name: Aislamiento de lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de ratón y células mesenquimas palatinas cultivadas para el análisis de fosfoproteínas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprenda a aislar lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de ratón y células mesenquimas palatinas para análisis de fosfoproteínas. Este método preserva la fosforilación para estudiar el desarrollo craneofacial.

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Los ratones 129S4 fueron un regalo del Dr. Philippe Soriano, de la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai. Este trabajo fue apoyado con fondos de los Institutos Nacionales de Salud (NIH)/Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (NIDCR) R01 DE027689 y K02 DE028572 a K.A.F., F31 DE029976 a M.A.R. y F31 DE029364 a B.J.C.D.

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Campus Médico Anschutz de la Universidad de Colorado y se realizaron de conformidad con las pautas y regulaciones institucionales. Se utilizaron ratones hembra 129S4 a los 1,5-6 meses de edad y alojados a una temperatura subteronetral de 21-23 °C para la recolección de embriones. Un flujo de trabajo esquemático del protocolo se representa en la Figura 1. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, equipos, software, reactivos y animales utilizados en este protocolo.
1. Recolección de embriones de ratón E11.5
<ol><li>Eutanasiar a la ratón hembra embarazada 11,5 días después de la detección del tapón vaginal durante el apareamiento cronometrado en una cámara de CO2 utilizando el caudal de CO2 aprobado por la IACUC requerido para aproximadamente el 50% de desplazamiento (2,95 L /min en una cámara de 360 en3 ) y la duración de la exposición (ver Tabla de Materiales). Realizar luxación cervical como método secundario de eutanasia. Proceda inmediatamente a la disección.</li>
	<li>Coloque el cuerpo del ratón en una tabla de disección con el lado ventral hacia arriba. Rocíe el abdomen del ratón con etanol al 70%.</li>
	<li>Abra la cavidad abdominal pellizcando y levantando la piel anterior a la abertura vaginal con pinzas Semken rectas y cortando la piel levantada y las capas subyacentes con tijeras quirúrgicas de cuchilla recta en un ángulo de 45 ° a cada lado para generar una forma de "V" que se extiende a cada superficie lateral aproximadamente a la mitad entre las extremidades anteriores y las extremidades posteriores.</li>
	<li>Usando las pinzas Semken, agarre uno de los cuernos uterinos y corte debajo del oviducto y por encima del cuello uterino con las tijeras quirúrgicas. Corte el mesometrio para permitir la extirpación completa del cuerno uterino.</li>
	<li>Transfiera el cuerno uterino diseccionado a 10 ml de solución salina tamponada con fosfato histológico (PBS) [0.137 M NaCl, 2.68 mM KCl, 1.76 mM KH2PO4 monobásico, 10.14 mM Na2HPO4 dibasic, pH 7.4] en una placa de Petri de 10 cm.</li>
	<li>Retire el segundo cuerno uterino en el lado opuesto de la cavidad abdominal utilizando el mismo procedimiento descrito en los pasos 1.4-1.5.</li>
	<li>Coloque la placa de Petri de 10 cm que contiene ambos cuernos uterinos en hielo si no procede inmediatamente a la disección de embriones individuales (es decir, si se diseccionará un segundo ratón hembra).</li>
	<li>Bajo un microscopio estereoscópico de disección, diseccione cuidadosamente cada embrión de los cuernos uterinos con fórceps finos Dumont #5. Retire lentamente el miometrio, la decidua y el corion. Desgarra y elimina el amnios relativamente transparente que rodea al embrión, y corta el cordón umbilical que conecta el embrión con la placenta.</li>
	<li>Transfiera cada embrión diseccionado a 2,5 ml de PBS histológico en un pozo individual de una placa de cultivo celular de 12 pocillos en hielo utilizando una pipeta de transferencia de plástico cortado o una cuchara de embrión. NOTA: Si trabaja con una camada que puede contener embriones de más de un genotipo, guarde el amnios que rodea a cada embrión para el genotipado colocando cada uno en su propio tubo de microcentrífuga preetiquetado de 0,5 ml en hielo.</li>
</ol>2. Disección de procesos maxilares de embriones de ratón E11.5
<ol><li>Preparar tres placas de Petri de 10 cm que contengan 10 mL de PBS histológico y mantenerlas en hielo para ser utilizadas en rotación entre embriones.</li>
	<li>Transfiera un embrión de un pozo individual de la placa de cultivo celular de 12 pocillos a una de las placas de Petri de 10 cm con PBS histológico en hielo utilizando una pipeta de transferencia de plástico cortado o una cuchara de embrión.</li>
	<li>Bajo el microscopio de disección, separe cada proceso maxilar de la cara usando las pinzas finas. Primero, corte el lado anterior de un proceso maxilar a lo largo de la hendidura natural que separa el proceso nasal lateral y el proceso maxilar (Figura 2A).</li>
	<li>En segundo lugar, cortar el lado posterior del proceso maxilar a lo largo de la hendidura natural que separa el proceso maxilar y el proceso mandibular (Figura 2A).</li>
	<li>En tercer lugar, para separar completamente el proceso maxilar, haga un corte vertical de los lados anterior a posterior del proceso maxilar en el lado ocular del proceso maxilar donde terminan las hendiduras naturales a las que se hace referencia anteriormente (Figura 2A-C).</li>
	<li>Repita estos tres cortes para el proceso maxilar en el lado opuesto de la cara.</li>
	<li>Usando una pipeta Pasteur de 9" con un bulbo de látex pequeño de 2 ml, transfiera el par diseccionado de procesos maxilares y una pequeña gota de aproximadamente 30 μL de PBS histológico a una placa de Petri de 35 mm etiquetada sobre hielo (Figura 2D).</li>
	<li>Siga los pasos 2.3-2.7 para cada embrión, rotando las tres placas de Petri de 10 cm que contienen HISTOLOGÍA PBS en hielo entre embriones. Coloque pares individuales de procesos maxilares disecados en placas de Petri separadas de 35 mm sobre hielo. NOTA: La separación del ectodermo y el mesénquima del proceso maxilar (pasos 2.9-2.17) se puede realizar después de diseccionar los procesos maxilares de todos los embriones en la camada. Si se desean procesos maxilares intactos que contengan tanto el ectodermo como el mesénquima, continúe con el paso 2.18 a continuación.</li>
	<li>Preparar 250 μL de tripsina fresca al 2% en pbS de cultivo tisular y 250 μL de suero bovino fetal (FBS) al 10% en cultivo tisular PBS y almacenar en hielo.</li>
	<li>Coloque una segunda gota pequeña de aproximadamente 30 μL de tripsina al 2% en la placa de Petri de 35 mm separada de la primera gota pequeña de PBS histológico que contiene los procesos maxilares. Transfiera el par de procesos maxilares a la pequeña gota de tripsina al 2% utilizando la pipeta de Pasteur (Figura 2D).</li>
	<li>Incubar el plato en hielo durante 15 min.</li>
	<li>Retire la placa de Petri de 35 mm del hielo y colóquela debajo del microscopio de disección.</li>
	<li>Usando las pinzas finas, lenta y cuidadosamente saque la capa de ectodermo de cada proceso maxilar (Figura 2E). NOTA: Si el ectodermo no se está separando del mesénquima en una lámina intacta, incube en tripsina al 2% a temperatura ambiente (RT) durante un máximo de 5 minutos adicionales antes de continuar con la separación. Si el tejido comienza a desintegrarse en el 2% de tripsina, mueva los procesos maxilares al 10% de FBS como se describe a continuación para neutralizar la tripsina y terminar la separación del ectodermo y el mesénquima.</li>
	<li>Una vez que el ectodermo del proceso maxilar y el mesénquima están separados (Figura 2F), transfiera los tejidos deseados del par de procesos maxilares a una tercera gota pequeña de aproximadamente 30 μL de 10% FBS, separada de las dos gotas pequeñas anteriores, utilizando la pipeta de Pasteur (Figura 2D).</li>
	<li>Coloque la placa de Petri de 35 mm sobre hielo para detener la tripsinización.</li>
	<li>Incubar los tejidos del proceso maxilar en hielo en 10% FBS durante 1-2 min, y luego transferir los tejidos de ambos procesos maxilares a una cuarta gota pequeña de aproximadamente 30 μL de PBS histológico prechillado en hielo, separada de las tres gotas pequeñas anteriores, utilizando la pipeta de Pasteur (Figura 2D).</li>
	<li>Incubar los tejidos del proceso maxilar en histología PBS durante 1 min mientras se arremolina suavemente el PBS histológico alrededor de los tejidos del proceso maxilar con la punta de la pipeta Pasteur para garantizar que todo fbS se enjuague del tejido.</li>
	<li>Transfiera el par de tejidos de proceso maxilar a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml marcado en hielo utilizando la pipeta Pasteur, minimizando la transferencia de PBS histológico. Retire cualquier exceso de PBS histológico en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con la pipeta Pasteur.</li>
	<li>Siga los pasos anteriores para diseccionar los procesos maxilares de cada embrión en la camada.</li>
	<li>Procese las muestras inmediatamente para aislar lisados de proteínas de células enteras (abajo) o almacenar a -80 °C a largo plazo. Antes del almacenamiento a largo plazo, congele el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en un baño de 100% EtOH sobre hielo seco durante 5 minutos.</li>
</ol>3. Aislar lisados de proteínas de células enteras de procesos maxilares de ratón
<ol><li>Si los procesos maxilares se congelaron previamente a -80 °C, descongelarlos en hielo.</li>
	<li>Añadir 0,1 ml de tampón de lisis NP-40 helado (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10% de glicerol, 1% de Nonidet P-40, 2 mM de EDTA; almacenado a 4 °C) con inhibidores de proteasa y fosfatasa (1x cóctel completo de mini inhibidor de la proteasa [disuelto en agua; almacenado a -20 °C], 1 mM PMSF [disuelto en isopropanol; almacenado a 4 °C], 10 mM NaF [almacenado a -20 °C; evitar la congelación/descongelación], 1 mM Na3VO4 [almacenado a -20 °C], 25 mM β-glicerofosfato [almacenado a 4 °C]) añadido inmediatamente antes de su uso en hielo. NOTA: El fraccionamiento celular se puede realizar alternativamente para aislar fracciones de proteínas citoplasmáticas, nucleares, de membrana o mitocondriales.</li>
	<li>Pipetee hacia arriba y hacia abajo 10 veces con un pipetman de 200 μL.</li>
	<li>Vórtice durante 10 s, y luego pipetee hacia arriba y hacia abajo 10 veces con un pipetman de 200 μL. Evita generar burbujas.</li>
	<li>Incubar a 4 °C durante 2 h mientras gira de extremo a extremo utilizando una paleta de 1,5 mL/2 mL con un revólver de tubo.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 13.500 × g durante 20 min a 4 °C.</li>
	<li>Recoja el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml sobre hielo con un tubo de 200 ml.</li>
	<li>Cuantificar la concentración de proteínas con el kit de ensayo de proteínas, utilizando 10 μL de lisado proteico + 10 μL de tampón de lisis NP-40 para muestras experimentales y 3-5 diluciones de albúmina sérica bovina (fracción V) (BSA) en tampón de lisis NP-40 en un rango de 0.25-2.0 mg / ml como estándares de proteínas.</li>
	<li>Proceda con la electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) (paso 5) o congele rápidamente los lisados restantes en hielo seco y guárdelo a -80 °C a largo plazo.</li>
</ol>4. Aislamiento de lisados de proteínas de células enteras de células primarias y/o inmortalizadas de células de mesén palatino embrionario de ratón (MEPM)
NOTA: El aislamiento y cultivo de células MEPM primarias de embriones de ratón E13.5 y células MEPM inmortalizadas se han descrito previamente 32,33,34. La estimulación de las células con factor de crecimiento (pasos 4.1-4.7) se puede realizar antes de la lisis celular. Si se desean células no estimuladas, continúe con el paso 4.8 a continuación.
<ol><li>Aspire el medio de crecimiento [medio de eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 50 U/mL de penicilina, 50 μg/mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 10% FBS] de las células MEPM a ~70% de confluencia en un plato de cultivo celular de 6 cm utilizando una pipeta Pasteur de 5,75" unida a un sistema de vacío.</li>
	<li>Lavar las células con 1 ml de PBS de cultivo de tejidos.</li>
	<li>Añadir 3 ml de medio de inanición sérica [DMEM con 50 U/mL de penicilina, 50 μg/ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 0,1% FBS] precalentado en un baño de agua a 37 °C.</li>
	<li>Incubar a 37 °C y 5% CO2 durante 23 h.</li>
	<li>Reemplace el medio de inanición sérica con 3 ml de medio de inanición sérica fresco y precalentado.</li>
	<li>Incubar a 37 °C y 5% CO2 durante 1 h.</li>
	<li>Estimular las células con el factor de crecimiento de elección a una concentración determinada empíricamente durante el período de tiempo deseado.</li>
	<li>Aspire el medio desde las celdas MEPM a una confluencia del 80%-100% utilizando una pipeta Pasteur de 5.75" unida a un sistema de vacío.</li>
	<li>Lavar las células dos veces con PBS de cultivo de tejido helado (1 ml para una placa de cultivo celular de 6 cm); incline la placa hacia un lado durante el último lavado para asegurarse de que todo el PBS de cultivo de tejidos esté aspirado.</li>
	<li>Lisar las células agregando tampón de lisis NP-40 helado con inhibidores de proteasa y fosfatasa agregados inmediatamente antes de su uso (0,1 ml para un plato de cultivo celular de 6 cm) en hielo.</li>
	<li>Incubar la placa en hielo durante 5 min con rotación aproximadamente cada min para asegurar una cobertura completa de la placa.</li>
	<li>Raspe las células de la placa usando un elevador de células preenfriado y transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml preenfriado en hielo.</li>
	<li>Incubar la suspensión celular a 4 °C durante 30 min mientras gira de extremo a extremo utilizando una paleta de 1,5 mL/2 mL con un revólver de tubo.</li>
	<li>Continúe con los pasos 3.6-3.9 descritos anteriormente.</li>
</ol>5. Western blotting de lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de ratón y/o células MEPM para fosfoproteínas
<ol><li>Prepare muestras de lisado de proteínas de células enteras para SDS-PAGE.<ol>
<li>Determinar la cantidad de proteína a cargar, dependiendo de la abundancia de proteínas en el tejido/célula; 12,5 μg suele ser suficiente para proteínas expresadas de forma robusta en lisados de proteínas de células enteras.</li>
		<li>Agregue un volumen igual de 2 tampón Laemmli [20% glicerol, 4% SDS, 0.004% azul de bromofenol, 0.125 M Tris HCl pH 6.8] con 10% de β-mercaptoetanol agregado inmediatamente antes de su uso. PRECAUCIÓN: β-mercaptoetanol es corrosivo para la piel o los ojos, tóxico, peligroso si se ingiere y tiene toxicidad acuática. Maneje usando guantes, una bata de laboratorio, protector facial y gafas de seguridad en una capucha de humo químico. Deseche de acuerdo con las pautas de salud y seguridad ambiental.</li>
		<li>Mezclar por vórtice.</li>
		<li>Calentar las muestras a 100 °C durante 5 min en un mini baño seco.</li>
		<li>Mezclar por vórtice y colocar las muestras sobre hielo.</li>
		<li>Centrifugar a 9.400 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Coloque las muestras brevemente en hielo antes de cargarlas en el gel SDS-PAGE, o guárdelas a -20 °C a largo plazo.</li>
	</ol></li>
	<li>Realice SDS-PAGE utilizando una celda de electroforesis con un gel de proteína prefabricada al 4%-15% y un tampón de electroforesis35.</li>
	<li>Electrotransferir las proteínas a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) utilizando tampón de transferencia con metanol al 0%-20% (0%-10% para proteínas mayores de 100 kDa; 20% para proteínas menores de 100 kDa) añadido inmediatamente antes de su uso35.</li>
	<li>Bloquee la membrana y sondee la fosfoproteína de interés.<ol>
<li>Después de la transferencia, lave la membrana en 1x solución salina tamponada tris (TBS) [20 mM Tris, 0.137 M NaCl, pH 7.6] durante 5 min en una caja de western blot.</li>
		<li>Incubar la membrana en 5 mL de tampón de bloqueo [1x TBS, 0.1% Tween 20, 5% p/v BSA; mezclado bien y filtrado a través de un filtro de jeringa de 25 mm con poros de 0.2 μm usando una jeringa de 10 mL con punta de luer] durante 1 h en una caja de western blot con agitación en un agitador orbital. NOTA: No use leche como agente bloqueador al caracterizar fosfoproteínas, ya que contiene la fosfoproteína caseína, que puede causar una señal de fondo alta e inespecífica.</li>
		<li>Lave la membrana tres veces durante 5 min cada una en TBS-T [1x TBS, 0.1% Tween 20] en una caja de western blot con agitación en un agitador orbital.</li>
		<li>Incubar la membrana en 5 ml de anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo a 4 °C durante la noche en un tubo cónico de 50 ml utilizando una paleta de 50 ml con un revólver de tubo. NOTA: Consulte la hoja de datos de anticuerpos para conocer la concentración adecuada para el western blotting.</li>
		<li>Lave la membrana tres veces en RT durante 5 min cada una en TBS-T en una caja de western blot con agitación en un agitador orbital.</li>
		<li>Incubar la membrana en 5 ml de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) apropiado diluido en tampón de bloqueo durante 1 h en una caja de western blot con agitación en un agitador orbital.</li>
		<li>Lave la membrana tres veces durante 5 minutos cada una en TBS-T en una caja de western blot con agitación en un agitador orbital.</li>
		<li>Incubar la membrana en sustrato de goteo occidental de quimioluminiscencia mejorada (ECL) [mezclando volúmenes iguales de las botellas 1 y 2; 0,5 ml de cada una para membranas grandes (8,6 cm x 6,7 cm)] durante 1 minuto, asegurando que toda la membrana esté continuamente expuesta al sustrato de goteo occidental de ECL.</li>
		<li>Drene la membrana del sustrato de goteo occidental ECL en exceso y desarrolle inmediatamente utilizando un generador de imágenes de quimioluminiscencia.</li>
	</ol></li>
	<li>Despoje la membrana y repruebe la proteína total de interés.<ol>
<li>Coloque la membrana de PVDF en una bolsa transparente con revestimiento de polietileno que contenga 5 ml de tampón de extracción [2% SDS, 62,5 mM Tris HCl pH 6,8] con 8 μL/ml de β-mercaptoetanol añadido inmediatamente antes de su uso.</li>
		<li>Incubar a 50 °C durante 30 min con mecedora en horno de hibridación a 11 revoluciones por minuto.</li>
		<li>Lave la membrana tres veces en RT durante 5 min cada una en TBS-T en una caja de western blot con agitación en un agitador orbital.</li>
		<li>Continúe con los pasos 5.4.2-5.4.9 descritos anteriormente.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuantificar densidades de banda western blot utilizando el software ImageJ, normalizando los niveles de la proteína fosforilada de interés a los niveles de la proteína total de interés36.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito aquí permite a los investigadores sondear eventos críticos de señalización dependientes de la fosforilación durante el desarrollo craneofacial de una manera robusta y reproducible. Hay varios pasos críticos en este protocolo que aseguran la recopilación adecuada de datos y el análisis de los resultados. Ya sea aislando fosfoproteínas de procesos faciales de ratón y / o células mesenquimas palatales cultivadas, es imperativo moverse de manera rápida y eficiente mientras se mantienen todos los reactiv...

El desarrollo craneofacial de mamíferos es un proceso morfológico complejo durante el cual múltiples poblaciones celulares se coordinan para generar el esqueleto frontonasal. En el ratón, este proceso comienza en el día embrionario (E) 9.5 con la formación de la prominencia frontonasal y pares de procesos maxilares y mandibulares, cada uno de los cuales contiene células de la cresta neural craneal post-migratorias. Los procesos nasales laterales y mediales surgen de la prominencia frontonasal con la aparición de las fosas nasales y eventualmente se fusionan para formar las fosas nasales. Además, los procesos nasales mediales y los procesos maxilares se fusionan para generar el labio superior. Al mismo tiempo, la palatogénesis se inicia con la formación de distintas excrecencias, los estantes palatinos secundarios, desde el lado oral de los procesos maxilares en E11.5. Con el tiempo, los estantes palatinos crecen hacia abajo a ambos lados de la lengua, se elevan a una posición opuesta por encima de la lengua y, finalmente, se fusionan en la línea media para formar un paladar continuo que separa las cavidades nasales y orales por E16.51.
Estos cambios morfológicos a lo largo del desarrollo craneofacial se inician y mantienen a través de diversas interacciones de señalización, que a menudo incluyen la fosforilación de proteínas por quinasas. Por ejemplo, los receptores de la membrana celular, como las subfamilias de receptores β del factor de crecimiento transformador (TGF), incluidos los receptores de proteínas morfogenéticas óseas (BMPR) y varias familias de receptores tirosina quinasa (RTK), se autofosforilan al unirse y activarse en las células de la cresta neural craneal 2,3,4 . Además, el receptor transmembrana acoplado a la proteína G Smoothened se fosforila en las células de la cresta neural craneal y el ectodermo craneofacial aguas abajo del ligando Sonic Hedgehog (SHH) que se une al receptor Patched1, lo que resulta en una acumulación suavizada en la membrana ciliar y la activación de la vía SHH5. Tales interacciones ligando-receptor pueden ocurrir a través de la señalización autocrina, paracrina y / o yuxtacrina en contextos craneofaciales. Por ejemplo, se sabe que BMP6 señala de manera autocrina durante la diferenciación de condrocitos6, mientras que el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) 8 se expresa en el ectodermo del arco faríngeo y se une a los miembros de la familia FGF de RTK expresados en el mesénquima del arco faríngeo de manera paracrina para iniciar el modelado y el crecimiento de los arcos faríngeos7, 8,9,10. Además, la señalización de Notch se activa tanto en condrocitos como en osteoblastos durante el desarrollo esquelético craneofacial a través de la señalización de yuxtacrina cuando los ligandos Transmembrana Delta y/o Jagged se unen a los receptores de Notch transmembrana en las células vecinas, que posteriormente se escindieron y fosforilan11. Sin embargo, hay otros pares de ligandos y receptores importantes para el desarrollo craneofacial que tienen la flexibilidad para funcionar tanto en la señalización autocrina como en la paracrina. Como ejemplo, durante la morfogénesis de los dientes murinos, se ha demostrado que el ligando del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)-AA indica de manera autocrina para activar el RTK PDGFRα en el epitelio12 del órgano del esmalte. Por el contrario, en los procesos faciales murinos durante la mitad de la gestación, las transcripciones que codifican los ligandos PDGF-AA y PDGF-CC se expresan en el ectodermo craneofacial, mientras que el receptor PDGFRα se expresa en el mesénquima subyacente derivado de la cresta neural craneal, lo que resulta en una señalización paracrina 13,14,15,16,17 . Independientemente del mecanismo de señalización, estos eventos de fosforilación del receptor a menudo resultan en el reclutamiento de proteínas adaptadoras y / o moléculas de señalización, que con frecuencia se fosforilan para iniciar cascadas de quinasa intracelular, como la vía de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK)18,19.
Los efectores intracelulares terminales de estas cascadas pueden fosforilar una serie de sustratos, como factores de transcripción, unión a ARN, proteínas citoesqueléticas y de matriz extracelular. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 y Sox9 26 se encuentran entre los factores de transcripción fosforilados en el contexto del desarrollo craneofacial. Esta modificación post-traduccional (PTM) puede afectar directamente la susceptibilidad a ptM alternativos, dimerización, estabilidad, escisión y/o afinidad de unión al ADN, entre otras actividades 20,21,25,26. Además, la proteína de unión al ARN Srsf3 se fosforila en el contexto del desarrollo craneofacial, lo que lleva a su translocación nuclear27. En general, se ha demostrado que la fosforilación de las proteínas de unión al ARN afecta su localización subcelular, las interacciones proteína-proteína, la unión al ARN y/o la especificidad de la secuencia28. Además, la fosforilación de la actomiosina puede conducir a reordenamientos citoesqueléticos a lo largo del desarrollo craneofacial29,30, y la fosforilación de proteínas de la matriz extracelular, como las pequeñas glicoproteínas ligadas al ligando a la ligando a integrinas N, contribuye a la biomineralización durante el desarrollo esquelético31. A través de lo anterior y muchos otros ejemplos, es evidente que hay amplias implicaciones para la fosforilación de proteínas durante el desarrollo craneofacial. Añadiendo un nivel adicional de regulación, la fosforilación de proteínas es modulada aún más por las fosfatasas, que contrarrestan las quinasas mediante la eliminación de grupos fosfato.
Estos eventos de fosforilación tanto a nivel de molécula receptora como efectora son críticos para la propagación de las vías de señalización y, en última instancia, dan lugar a cambios en la expresión génica en el núcleo, impulsando actividades celulares específicas, como la migración, la proliferación, la supervivencia y la diferenciación, que resultan en la formación adecuada de la cara del mamífero. Dada la especificidad del contexto de las interacciones de las proteínas con las quinasas y las fosfatasas, los cambios resultantes en los PTM y sus efectos sobre la actividad celular, es fundamental que estos parámetros se estudien en un entorno fisiológicamente relevante para obtener una comprensión completa de la contribución de los eventos de fosforilación al desarrollo craneofacial. Aquí, se proporcionan ejemplos de dos contextos en los que estudiar la fosforilación de proteínas y, por lo tanto, la activación de las vías de señalización durante el desarrollo craneofacial de mamíferos: los procesos faciales de ratón, en particular los procesos maxilares E11.5, y las células mesenquimas palatinas embrionarias de ratón cultivadas derivadas de E13.5 estantes palatinos secundarios, tanto primarios32 como inmortalizados33 . En E11.5, los procesos maxilares están en proceso de fusión con los procesos nasales laterales y mediales1, lo que representa un punto de tiempo crítico durante el desarrollo craneofacial del ratón. Además, los procesos maxilares y las células derivadas de los estantes palatinos se eligieron aquí porque las últimas estructuras son derivadas de las primeras, lo que brinda a los investigadores la oportunidad de interrogar la fosforilación de proteínas in vivo e in vitro en contextos relacionados. Sin embargo, este protocolo también es aplicable a procesos faciales alternativos y puntos de tiempo de desarrollo.
Un problema crítico en el estudio de las proteínas fosforiladas es que son fácilmente desfosforiladas durante el aislamiento de proteínas por abundantes fosfatasas ambientales. Para superar esta barrera, se discuten las adaptaciones y modificaciones a los métodos de laboratorio estándar que permiten el aislamiento de proteínas fosforiladas. Además, se proporcionan las mejores prácticas para el análisis y la cuantificación adecuados de las proteínas fosforiladas. Estas técnicas, particularmente en combinación con inhibidores farmacológicos y / o modelos genéticos murinos, se pueden utilizar para obtener una mayor comprensión de la dinámica y el papel de varias vías de señalización activas durante el desarrollo craneofacial.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td>Block para mini baño seco Research Products International Corp 400783 sistema de imagen ChemiDoc XRS+ con software Image Lab Bio-Rad 1708265 generador de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>imágenes de quimioluminiscencia</td></tr><tr><td>CO2 incubadora, camisa de aire</td><td>VWR</td><td>10810-902</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Disección <td></td></tr><tr><td> tablero, 11 x 13 pulgadas</td><td>Fisher Scientific</td><td>09 002 12</td><td></td></tr><tr><td>Célula de electroforesis, 4 geles, para mini geles prefabricados con módulo mini trans-blot</td><td>Bio-Rad</td><td>1658030</td><td></td></tr><tr><td>Horno de hibridación</td><td>Microcentrífuga Fisher Scientific</td><td>UVP95003001</td><td></td></tr><tr><td>5415 D con rotor F45-24-11 (Eppendorf)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z604062</td><td></td></tr><tr><td>Mini baño seco</td><td>Productos de investigación International Corp</td><td>400780</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>VWR</td><td>89231-662</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación para SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de hielo rectangular, maxi 9 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-093</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico Stemi 508 con soporte K Lab, anillo de luz LED</td><td>Zeiss</td><td>4350649020000000</td><td>microscopio de disección</td></tr><tr><td>Temporizador</td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td></td></tr><tr><td>Revólver de tubo</td><td>Fisher Scientific</td><td>11 676 341</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>Fisher Scientific</td><td>02 215 414</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>VWR</td><td>89501-472</td><td></td></tr> Western <tr><td>blot box</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9358182</td><td></td></tr><tr><td> Materiales</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular, 6 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-95</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular, 12 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>Elevadores de células</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-240</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Airgas</td><td>CD USP50</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos, polipropileno, 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pinzas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Cuchara para embriones</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 0,5 mL</td><td>VWR</td><td>89000-010</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 1,5 mL VWR</td><td></td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur, 5,75"</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur, 9"</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri, 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri, 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> FB0875711YZ <td></td></tr><tr><td>Bolsas, transparente, revestimiento de polietileno</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-25B</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de PVDF</td><td>Fisher Pinza Scientific</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Semken Fine</td><td>Science Tools</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>Bombilla de látex pequeña, 2 mL</td><td>VWR</td><td>82024-554</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa, 25 mm, 0,2 &mu; m tamaño de poro</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-108</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa con punta Luer, 10 mL</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de transferencia</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-22</td><td></td></tr><tr><td>Palanca de apertura de casete Western blot</td><td>Bio-Rad</td><td>4560000</td><td></td></tr><tr><td>Whatmann 3MM chr papel de cromatografía</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td> Reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-15% Geles de proteínas prefabricadas, 10 pocillos, 30 y micro; L</td><td>Bio-Rad</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato sódico sal hidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5422-25G concentración de</td><td>existencias 1 M</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina, fracción V, prueba de choque térmico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>AC403140050</tr><tr><td>Cóctel completo de mini inhibidores de la proteasa</td><td>Sigma Aldrich</td> Concentración <td>de</td><td>stock de 11836153001 25x</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas DC II</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alta glucosa</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>E7, anticuerpo primario de beta tubulina monoclonal de ratón, concentrado 0,1 mL</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridomas</td><td>E7</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Sustrato de Western Blot ECL</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI32106</td><td>rango de picogramos</td></tr><tr><td>bajo ECL sustrato de Western blot</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-302B</td> de <td>rango de femtogramo bajo</td></tr><tr><td>Tampón de electroforesis, 5 L</td><td>Bio-Rad</td><td>1610772</td><td>concentración de stock 10x</td></tr><tr><td>Etanol, 200 pruebas, 1 galón</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2705HC</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético, dihidra de sal de Di Na. (Poder cristalino/Electróforo.)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, caracterizado, origen estadounidense, 500 mL</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol (certificado ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario conjugado con HRP, cabra anti-ratón IgG</td> Jackson <td>ImmunoResearch Laboratories</td><td>115-035-146</td> 1<td>:20.000</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario conjugado con HRP, cabra IgG anti-conejo Jackson</td><td>ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-003</td><td>1:20.000</td></tr><tr><td>Solución de ácido clorhídrico, 6N (certificado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA56-500</td><td>HCl</td></tr><tr><td>Igepal Ca - 630 detergente no iónico</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19859650</td><td>Nonidet P-40</td></tr><tr><td>Isopropanol (HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-1</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>concentración de existencias 200 mM</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (Erk1/2) anticuerpo primario</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9102S</td><td>1:1.000; anti-Erk1/2</td></tr><tr><td>PDGF-BB ligando recombinante, rata</td><td>Fisher Scientific</td><td>520BB050</td><td></td></tr><tr><td>PDGF Receptor y beta; anticuerpo primario</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>3169S</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco 15140122</td><td></td><td>concentración de stock 100 U/mL, 100 y micro; g/mL</td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetanosulfonilo, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC215740100</td><td>PMSF; concentración de existencias 100 mM</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9101S</td><td>1:1.000, anti-fosfo-Erk1/2</td></tr><tr><td>Receptor de fosfo-PDGF y alfa; /Receptor de PDGF y beta; anticuerpo primario</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>3170S</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (cristales blancos)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico (cristales blancos)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>SDS, 10%</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (cristalino/biológico, certificado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Fluoruro de sodio (polvo/ACS certificado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S299-100</td><td>NaF; alícuota para un solo uso; concentración de existencias 1</td></tr><tr><td>M Ortovanadato de sodio, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC205330500</td><td>Na3VO4; concentración de existencias 100 mM</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico anhidro (granular o en polvo/ACS certificado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>Cultivo de tejidos PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de transferencia, 5 L</td><td>Bio-Rad</td><td>1610771</td><td>concentración de stock 10x</td></tr><tr><td>Tris base (cristales blancos o polvo cristalino/biología molecular)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>BioWorld</td><td>21560033</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr> Western <tr><td>blot marcador de peso molecular</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>Institutos Nacionales de Salud</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hembra ratones 129S4</td><td></td><td></td><td>regalo del Dr. Philippe Soriano, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai</td></tr></tbody></table>

aislamiento de lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de ratón y células mesenquimas palatinas cultivadas para el análisis de fosfoproteínas

Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

El desarrollo craneofacial de mamíferos es un proceso morfológico complejo durante el cual múltiples poblaciones celulares se coordinan para generar el esqueleto frontonasal. Estos cambios morfológicos se inician y mantienen a través de diversas interacciones de señalización, que a menudo incluyen la fosforilación de proteínas por quinasas. Aquí, se proporcionan dos ejemplos de contextos fisiológicamente relevantes en los que estudiar la fosforilación de proteínas durante el desarrollo craneofacial de mamíferos: procesos faciales de ratón, en particular procesos maxilares E11.5, y células mesenquimas palatinas embrionarias de ratón cultivadas derivadas de estantes palatinos secundarios E13.5. Para superar la barrera común de la desfosforilación durante el aislamiento de proteínas, se discuten las adaptaciones y modificaciones a los métodos de laboratorio estándar que permiten el aislamiento de fosfoproteínas. Además, se proporcionan las mejores prácticas para el análisis y la cuantificación adecuados de las fosfoproteínas después de la eliminación occidental de lisados de proteínas de células enteras. Estas técnicas, particularmente en combinación con inhibidores farmacológicos y / o modelos genéticos murinos, se pueden utilizar para obtener una mayor comprensión de la dinámica y el papel de varias fosfoproteínas activas durante el desarrollo craneofacial.

Al intentar caracterizar la fosforilación de proteínas aisladas de procesos faciales de ratón y/o células mesenquimas palatales cultivadas, los resultados representativos idealmente revelarán una banda distinta y reproducible después de Western Blotting con un anticuerpo antifosfoproteína que corre a la altura o cerca de la altura de la banda de proteína total correspondiente (Figura 3 ). Sin embargo, si se produce una fosforilación extensa de la proteína, puede haber un ligero desplazamient...

El protocolo presenta un método para aislar lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de embriones de ratón disecados o células mesenquimas palatales embrionarias de ratón cultivadas y realizar posterior western blotting para evaluar los niveles de proteína fosforilada.

Aislamiento de lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de ratón y células mesenquimas palatinas cultivadas para el análisis de fosfoproteínas

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...

Este protocolo se puede utilizar para obtener una mayor comprensión de la dinámica y el papel de las fosfoproteínas activas durante el desarrollo craneofacial de los mamíferos. Este protocolo supera la barrera común de la desfosforilación durante el aislamiento de proteínas de dos contextos fisiológicamente relevantes, los procesos faciales de ratón y las células de mesénquima palatal embrionarias de ratón cultivadas. Es imperativo moverse rápidamente mientras se mantienen todos los reactivos y materiales en hielo y usar inhibidores de la fosfatasa en todos los tampones de lisis para mantener la integridad de las proteínas fosforiladas.Para comenzar, coloque el cuerpo del ratón en una tabla de disección con el lado ventral hacia arriba y rocíe el abdomen del ratón con etanol al 70%. Luego abra la cavidad abdominal pellizcando y levantando la piel anterior a la abertura vaginal con pinzas Semken rectas. A continuación, corte la piel levantada en las capas subyacentes con tijeras quirúrgicas de hoja recta en un ángulo de 45 grados a cada lado para generar una forma de V que se extienda a cada superficie lateral aproximadamente a medio camino entre las cuatro extremidades y las extremidades posteriores.Usando las pinzas Semken, agarre uno de los cuernos uterinos y corte debajo del oviducto y por encima del cuello uterino con tijeras quirúrgicas. Para permitir la extirpación completa del cuerno uterino, corte el mesometrio, luego transfiera el cuerno uterino diseccionado a 10 mililitros de histología PBS en una placa de Petri de 10 centímetros. Del mismo modo, retire el segundo cuerno uterino en el lado opuesto de la cavidad abdominal.Después, coloque la placa de Petri de 10 centímetros que contiene ambos cuernos uterinos sobre hielo. Bajo un microscopio estereoscópico de disección, diseccione cuidadosamente cada embrión de los cuernos uterinos con Dumont 5 fórceps finos. Luego retire lentamente el miometrio, la decidua y el corion.A continuación, rasgue y elimine el amnios relativamente transparente que rodea al embrión y corte el cordón umbilical que conecta el embrión con la placenta. Luego transfiera cada embrión diseccionado a 2.5 mililitros de PBS histológico en un pozo individual de una placa de cultivo celular de 12 pocillos en hielo usando una pipeta de transferencia de plástico cortada. Preparar tres placas de Petri de 10 centímetros que contengan 10 mililitros de HISTOLOGÍA PBS y mantenerlas en hielo para ser utilizadas en rotación entre embriones.Luego transfiera un embrión de un pozo individual de la placa de cultivo celular de 12 pocillos a una de las placas de Petri de 10 centímetros con PBS histológico en hielo utilizando una pipeta de transferencia de plástico cortado. Bajo el microscopio de disección, separe cada proceso maxilar de la cara usando los fórceps finos haciendo primero un corte en el lado anterior de un proceso maxilar a lo largo de la hendidura natural que separa el proceso nasal lateral en el proceso maxilar. A continuación, corte el lado posterior del proceso maxilar a lo largo de la hendidura natural que separa el proceso maxilar y el proceso mandibular.Luego, separe completamente el proceso maxilar haciendo un corte vertical de los lados anterior a posterior del proceso maxilar en el lado del ojo del proceso maxilar donde terminan las hendiduras naturales a las que se hace referencia anteriormente. Usando una pipeta Pasteur de nueve pulgadas con un bulbo de látex pequeño de dos mililitros, transfiera el par diseccionado de procesos maxilares en una pequeña gota de aproximadamente 30 microlitros de HISTOLOGÍA PBS a una placa de Petri de 35 milímetros etiquetada en hielo. Luego transfiera el par de tejidos de proceso maxilar a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros marcado en hielo utilizando la pipeta Pasteur, minimizando la transferencia de PBS histológico.Además, elimine cualquier exceso de PBS histológico en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con la pipeta Pasteur. Agregue 0.1 mililitro de tampón de lisis NP40 helado con inhibidores de proteasa y fosfatasa agregados inmediatamente antes de usarlos en hielo. Luego pipetee hacia arriba y hacia abajo 10 veces con un PIPETMAN de 200 microlitros.A continuación, vórtice durante 10 segundos, y luego pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces con un PIPETMAN de 200 microlitros, evitando la generación de burbujas. Incuba a cuatro grados centígrados durante dos horas mientras giras de extremo a extremo usando una paleta de 1,5 mililitros o dos mililitros con un revólver de tubo. Luego centrifugue las muestras a 13, 500 x g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius y recoja el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros en hielo con un PIPETMAN de 200 mililitros.Primero, aspire el medio de las células del mesénquima palatino embrionario de ratón utilizando una pipeta Pasteur de 5,75 pulgadas unida a un sistema de vacío. Luego lave las células dos veces con PBS de cultivo de tejido helado y utilice la placa hacia un lado durante el último lavado para asegurarse de que todo el cultivo de tejido PBS se aspire. A continuación, agregue el tampón de lisis NP40 helado con inhibidores de proteasa y fosfatasa agregados inmediatamente antes de usarlos en hielo para lisar las células.Incubar la placa en hielo durante cinco minutos con rotación aproximadamente cada minuto para garantizar una cobertura completa de la placa. Luego raspe las células de la placa usando un elevador de células preenfriado y transfiera la suspensión de la celda a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros preenfriado en hielo. Después, incuba la suspensión celular a cuatro grados centígrados durante 30 minutos mientras giras de extremo a extremo con una paleta de 1,5 mililitros o dos mililitros con un revólver de tubo.Luego centrifugue las muestras a 13, 500 x g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius y recoja el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros en hielo con un PIPETMAN de 200 mililitros. El análisis de Western blot de lisados de células enteras de células embrionarias de ratón inmortalizadas en células del mesénquima palatal después de la estimulación con ligando PDFG-B de 2 a 15 minutos reveló distintas bandas reproducibles para las fosfoproteínas que se ejecutan a la altura o cerca de la altura de la banda de proteína total correspondiente. Se observó un aumento en las intensidades de la banda de fosfoproteínas en el tratamiento con un factor de crecimiento en comparación con las de las células no tratadas, mientras que las intensidades totales de la banda de proteínas fueron relativamente iguales entre las muestras.Este protocolo se puede utilizar para sondear cómo las perturbaciones y la fosforilación influyen directamente en la señalización intercelular, la expresión génica y la actividad celular en contextos craneofaciales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

El vídeo muestra el análisis del estado de palmitoilación de proteínas de la membrana celular aisladas de tejido cerebral de ratón. El proceso consiste en exponer las cisteínas no palmitoiladas y bloquearlas, y luego usar un polímero que se une a las cisteínas palmitoiladas, lo que ayuda a evaluar el estado de palmitoilación de las proteínas aisladas.

Evaluación del estado de palmitoilación de las proteínas de la membrana celular a partir de tejido cerebral de ratón

Un protocolo para la separación de ectodermo y el mesénquima facial embrión se describe. Utilizamos Dispasa II para el tratamiento de embriones enteros en primer lugar, analizar las prominencias faciales completas, y luego separar el ectodermo facial y mesénquima.

La separación de Ratón Facial ectodermo embrionario y mesénquima

El análisis proteómico de cualquier tipo de célula depende en gran medida tanto de la pureza como del prefraccionamiento del material de partida para descomplejizar la muestra antes de la cromatografía líquida, espectrometría de masas (MS). Mediante el uso de técnicas de retrolavado, se pueden obtener espermatozoides puros de roedores. Después de la digestión, los fosfopéptidos se pueden enriquecer con TiO2.

Análisis Phosphopeptide de roedores epidídimo Espermatozoides

El análisis de la expresión de proteínas en válvulas de ratones embrionarios jóvenes se ha visto obstaculizado por el limitado tejido disponible. Este manuscrito proporciona un protocolo para la preparación de proteínas a partir de regiones de válvulas de ratón embrionarias en desarrollo para el análisis de Western blot.

Proteína Aislamiento del desarrollo embrionario del corazón del ratón Válvula Región

En este método, presentamos procedimientos bioquímicos para el aislamiento rápido y eficiente de proteínas de filamento intermedio (IF) de múltiples tejidos de ratón. Se pueden usar IFs aisladas para estudiar los cambios en las modificaciones postraduccionales por espectrometría de masas y otros ensayos bioquímicos.

Aislamiento de proteínas de filamento intermedio de múltiples tejidos de ratón para estudiar las modificaciones postraduccionales asociadas al envejecimiento

Este protocolo describe cómo aislar los queratinocitos de la piel de los modelos de ratón, para manchar con anticuerpos etiquetados con metal, y analizar las células manchadas por citometría de masa para perfilar el patrón de expresión de proteínas de interés en las diferentes fases del ciclo celular.

Aislamiento y tinción de queratinocitos de piel de ratón para el análisis específico del ciclo celular de la expresión de proteínacelular espora

Presentamos un protocolo para el aislamiento y cultivo de células mesenquimales palatales embrionarias primarias de ratón para imágenes de lapso de tiempo de crecimiento bidimensional (2D) y ensayos de reparación de heridas. También proporcionamos la metodología para el análisis de los datos de imágenes de lapso de tiempo para determinar la formación de flujo celular y la motilidad direccional.

Aislamiento e imágenes de lapso de tiempo de células mesenquimas palatinas embrionarias primarias de ratón para analizar los atributos del movimiento colectivo

El presente protocolo describe el aislamiento y cultivo de queratinocitos orales derivados del paladar del ratón adulto. También se informa de un método de evaluación mediante inmunotinción.

Aislamiento y cultivo de queratinocitos orales primarios del paladar del ratón adulto

Este protocolo presenta dos técnicas para aislar los compartimentos subcelulares de los fotorreceptores de bastón murino para el análisis de proteínas. El primer método utiliza retina viva y papel de filtro de celulosa para separar los segmentos externos de la varilla, mientras que el segundo emplea retinas liofilizadas y cinta adhesiva para pelar las capas internas y externas de la varilla.

Dos métodos de peeling para el aislamiento de compartimentos de células fotorreceptoras en la retina del ratón para el análisis de proteínas

El presente protocolo describe la preparación de muestras y el análisis de datos para cuantificar la fosforilación de proteínas utilizando un ensayo mejorado de extracción de una sola molécula (SiMPull).

Un ensayo optimizado de extracción de una sola molécula para la cuantificación de la fosforilación de proteínas

Aquí, presentamos un protocolo para el enriquecimiento de fosfoproteínas fosfatasas endógenas y sus proteínas que interactúan a partir de células y tejidos y su identificación y cuantificación mediante proteómica basada en espectrometría de masas.

Un enfoque basado en la espectrometría de masas para identificar fosfoproteínas fosfatasas y sus interactores

Aprenda a aislar lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de ratón y células mesenquimas palatinas para análisis de fosfoproteínas. Este método preserva la fosforilación para estudiar el desarrollo craneofacial.

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Aislamiento de lisados de proteínas de células enteras de procesos faciales de ratón y células mesenquimas palatinas cultivadas para el análisis de fosfoproteínas

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