Name: Medición de las tasas de recambio de proteínas en células cultivadas senescentes y no divisorias con etiquetado metabólico y espectrometría de masas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprende a medir tasas de recambio proteico en células senescentes mediante etiquetado metabólico SILAC y espectrometría de masas. Este método permite calcular semividas de proteínas y estudiar mecanismos de proteostasis en investigaciones sobre envejecimiento celular.

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Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y el Programa de Investigación Intramuros (IRP), Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIA). N.B. fue apoyado por Longevity Impetus Grants y el Programa de Becarios de la Oficina de Suplementos Dietéticos (ODS). La Figura 1 se creó con BioRender.com.

Los autores no tienen revelaciones.

pSILAC es una técnica poderosa que permite la cuantificación global de las tasas de renovación de proteínas en múltiples condiciones celulares. Este artículo detalla el uso de pSILAC para comparar las vidas medias de proteínas globales entre las células senescentes y inactivas, incluidas las instrucciones para la preparación de células senescentes y inactivas, el etiquetado y la cosecha de SILAC y, en última instancia, el análisis utilizando espectrometría de masas DDA. Además, se describe una prueba de dos pasos para la validación del fenotipo de senescencia utilizando el análisis SA-βGal y RT-qPCR de un panel de ARNm que codifican proteínas asociadas a la senescencia. Además de la validación de la senescencia con los dos enfoques descritos, se puede realizar una tercera validación de la senescencia después del análisis de espectrometría de masas mediante la búsqueda de cambios en los marcadores de senescencia conocidos entre las células senescentes y inactivas a nivel proteómico. Las proteínas asociadas a la senescencia que se espera que estén elevadas incluyen p16, p21 y BCL2, entre otras, descritas en otra parte44,45. En el protocolo descrito anteriormente, se utilizó radiación ionizante para la inducción de la senescencia y la inanición sérica para las células inactivas. Para la inducción de la senescencia, existen múltiples opciones disponibles y existe una heterogeneidad sustancial entre ellas 41,42,46. Actualmente, no existe un método senescente que se considere el "más fisiológico", por lo que la elección del inductor senescente se basa en gran medida en el contexto del experimento. Sin embargo, se recomiendan experimentos con el objetivo de establecer un fenómeno general sobre la senescencia para usar al menos dos inductores senescentes diferentes. Discutir la gama de paradigmas de senescencia está más allá del alcance de este artículo, pero algunos métodos comunes para inducir la senescencia incluyen desencadenar daño en el ADN (IR, doxorrubicina, agotamiento replicativo), expresar proteínas oncogénicas (HRAS, BRAF) e interrumpir la funciónmitocondrial 2.
Además de la elección del inductor senescente, la elección de las células de control es una consideración igualmente importante. Las células senescentes están, por definición, bajo detención indefinida del crecimiento, por lo que a menudo se elige una comparación con otras células detenidas por el crecimiento. Para pSILAC, las células detenidas del ciclo celular son generalmente preferibles porque no se replican y, por lo tanto, son más fáciles de usar para los cálculos de vida media de proteínas47. Sin embargo, dado que las células cultivadas a menudo retendrán algunas células en división, es importante que los métodos utilizados para inducir la detención del ciclo celular produzcan una respuesta lo más homogénea posible para minimizar el error de las células que aún están proliferando. Para calcular las tasas de degradación de proteínas para células cicladoras que utilizan pSILAC se requieren cálculos adicionales para compensar la velocidad a la que la proteína se diluye en células hijas27. Sin embargo, la detención del crecimiento inactivo en sí misma no está exenta de complicaciones. Existen dos métodos generales para la detención del ciclo celular: la privación sérica y la inhibición por contacto48. No todas las células pueden quedar inactivas a través de la inhibición del contacto, aunque se ha demostrado que algunos fibroblastos demuestran inactividad después de varios días de cultivo49. Este método utilizó la privación sérica porque se usa más comúnmente para comparaciones de células senescentes, aunque requiere que la célula senescente esté igualmente privada de suero para comparaciones precisas. El suero activa el complejo mTOR y, por lo tanto, la privación sérica tiene varios efectos posteriores en la célula, además de la detención del ciclo celular50. En particular, se ha demostrado que las células senescentes muestran un SASP reducido tras la privación sérica o la inhibición de mTOR51,52.
Otro punto importante a considerar en pSILAC es cuántos puntos de tiempo probar. Este protocolo recolectó células en un solo punto de tiempo (3 días de etiquetado ligero o pesado), lo que simplifica sustancialmente el análisis resultante. La elección del punto de tiempo debe basarse en el objetivo del experimento. Para el análisis global, se espera que 3 días capturen la mayoría de las proteínas, aunque las vidas medias de las proteínas de vida corta que se renuevan completamente dentro de los 3 días (se pierde toda la señal de luz) no se pueden medir en este punto de tiempo. Por el contrario, las proteínas de larga vida con muy poca rotación en 3 días también son difíciles de cuantificar y, a menudo, parecen tener vidas medias extremadamente grandes (del orden de semanas) que generalmente son solo una consecuencia de muy poca acumulación de señal pesada. Debido a la relación no lineal en la proporción de señales peptídicas pesadas y ligeras versus el porcentaje de proteína recién sintetizada en puntos de tiempo más cortos y más largos, la cuantificación de vidas medias podría mejorarse agregando puntos de tiempo de etiquetado adicionales. Para las comparaciones relativas entre dos estados celulares, como en este protocolo, una vida media aproximada puede ser suficiente, pero se pueden usar puntos de tiempo adicionales para mejorar la precisión cuantitativa.
Este protocolo describe cómo realizar un análisis no dirigido basado en DDA de la rotación de proteínas. Sin embargo, los cálculos de recambio de proteínas se pueden aplicar generalmente a cualquier esquema de adquisición que sea capaz de derivar la abundancia relativa de pares de péptidos pesados y ligeros. Por ejemplo, los métodos basados en MS2, como la adquisición independiente de datos (DIA/SWATH), también se pueden aplicar para el cálculo de las tasas de rotación con éxito53. Además, la instrumentación y las canalizaciones de software distintas de las descritas en este protocolo se pueden utilizar para realizar análisis de DDA, identificación de proteínas y cuantificación de proteínas. Cuando se utilizan plataformas de software de cuantificación de proteínas como Skyline para extraer áreas de picos de péptidos, es recomendable inspeccionar manualmente los cromatogramas de iones extraídos en el espacio de trabajo de documentos, identificar picos que se integraron erróneamente y picos no cuantitativos, y curar el documento en consecuencia. Una extensa colección de tutoriales está disponible en línea para Skyline (skyline.ms).
pSILAC representa uno de los métodos más ideales para la cuantificación global de las vidas medias de las proteínas en células cultivadas debido a la multiplexación superior (cobertura del proteoma) y el rendimiento. Si bien pSILAC no proporciona tasas directas de síntesis o degradación, ya que el cambio en la señal ligera y pesada se debe a una confluencia de factores, pSILAC es muy útil para comparaciones entre condiciones y diferentes tipos de células. Los métodos de bajo rendimiento a menudo se dividen en dos tipos: 1) tratamiento de células con cicloheximida para bloquear la síntesis y cosecha de proteínas en intervalos de tiempo después de la adición para monitorear la descomposición, o 2) tratamiento de células con un inhibidor de la descomposición de proteínas y cosecha en intervalos de tiempo después de la adición para monitorear la acumulación de proteínas, infiriendo así las tasas de descomposición de proteínas. La limitación de ambos métodos es que tales tratamientos inevitablemente causarán cambios sustanciales en la fisiología celular. En contraste, pSILAC no requiere una intervención sustancial y teóricamente no tiene efectos detectables en la fisiología celular, ya que los aminoácidos isotópicos difieren en un solo neutrón de sus contrapartes no isotópicas. Por lo tanto, el método descrito aquí para pSILAC representa un protocolo simple para la medición global de las vidas medias de proteínas más fisiológicas en células que no se dividen.
Las alteraciones en el recambio proteico tienen una estrecha relación con el envejecimiento, las enfermedades relacionadas con la edad, la neurodegeneración y la longevidad54,55. Este protocolo describe un método para interrogar estas relaciones mediante el uso de un marcado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular para medir las tasas de renovación de proteínas en células de senescencia. Sin embargo, existen numerosos métodos análogos para realizar estudios en el contexto del envejecimiento y la neurodegeneración in vivo en organismos enteros como los ratones. De hecho, estos estudios han enfatizado la importancia de medir las tasas de recambio de proteínas en el contexto de las enfermedades relacionadas con la edad 56,57,58,59.
En este estudio, las proteínas ribosómicas y las proteínas que residen en el retículo endoplásmico se destacaron como dos categorías de proteínas con vidas medias disminuidas y aumentadas en células senescentes, respectivamente. Si bien se requiere un análisis adicional de los niveles de estado estacionario para las conclusiones definitivas, estos resultados sugieren además que las células senescentes pueden regular de manera única la traducción a través de la disminución de la vida media de las proteínas ribosómicas. En el futuro, la aplicación de enfoques de marcado de isótopos estables para estudiar la relación entre la senescencia celular y la neurodegeneración in vivo en modelos de ratón será una extensión prometedora del enfoque de etiquetado de isótopos descrito por este protocolo.

La senescencia se identificó por primera vez como un estado de detención indefinida del crecimiento exhibido por las células primarias cultivadas después de alcanzar el agotamiento replicativo1. Desde entonces se ha demostrado que la senescencia puede surgir en respuesta a numerosos insultos celulares, incluyendo tensiones genotóxicas, mitocondriales y oncogénicas, entre otras2. Si bien la senescencia tiene varias funciones fisiológicamente importantes, como la supresión de tumores y la cicatrización de heridas, la acumulación de células senescentes durante el envejecimiento se asocia con una serie de efectos nocivos sobre la salud3, incluidas varias afecciones neurodegenerativas 4,5,6. La senescencia celular ocurre en múltiples tipos de células cerebrales, incluidas las neuronas 7,8,9,10, los astrocitos11, la microglía12 y los precursores de oligodendrocitos13, y contribuye a la neurodegeneración y la disfunción cognitiva. Se ha demostrado que los oligómeros beta amiloides, una de las características distintivas de la enfermedad de Alzheimer14, aceleran la senescencia neuronal 13,15,16. También se ha asociado una mayor prevalencia de células senescentes con la enfermedad de Parkinson17, especialmente derivada de factores estresantes ambientales11,18. Es importante destacar que la eliminación selectiva de células senescentes en modelos preclínicos extiende la vida útil y mitiga una multitud de enfermedades relacionadas con la edad 3,5,12 y mejora los déficits cognitivos 8,11,12,13. Por lo tanto, las células senescentes han surgido como objetivos terapéuticos prometedores para el tratamiento de muchas afecciones relacionadas con la edad.
Gran parte del efecto perjudicial de las células senescentes es causado por el fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP), una mezcla compleja de moléculas bioactivas secretadas por las células senescentes que pueden causar inflamación local, angiogénesis, destrucción de la matriz extracelular y propagación de la senescencia en el tejido circundante 19,20,21 . El SASP también representa un interesante fenómeno biológico de senescencia porque requiere un considerable esfuerzo transcripcional y traslacional durante un estado de detención del ciclo celular. De hecho, se ha demostrado que las células senescentes exhiben disminuciones en la biogénesis del ribosoma 22,23,24 que deberían reducir la síntesis de proteínas. En cambio, las células senescentes traducen robustamente algunas proteínas, particularmente los factores SASP, e influyen en el metabolismo del tejido circundante25. Por lo tanto, existe un interés considerable en comprender cómo las células senescentes que sufren una detención permanente del ciclo celular continúan manteniendo la homeostasis de las proteínas mientras que al mismo tiempo expresan de manera robusta los factores SASP y otras proteínas seleccionadas.
Este método describe cómo utilizar la espectrometría de masas y el etiquetado de isótopos pulsados-estables por aminoácidos en cultivo celular (pSILAC) para medir globalmente la vida media de las proteínas en células senescentes a escala de proteoma. En el SILAC tradicional, las células cultivadas están completamente marcadas metabólicamente con isótopos pesados y ligeros no radiactivos de aminoácidos para el análisis posterior de la abundancia de proteínas. Este método se ha aplicado previamente para evaluar los cambios de abundancia de forma exhaustiva y cuantitativa en el SASP de fibroblastos cultivados26. En pSILAC, las células se etiquetan metabólicamente de manera similar con un pulso de isótopo pesado que sigue el pre-etiquetado con isótopos ligeros, y luego se cosechan en uno o más intervalos de tiempo. Las tasas de incorporación de isótopos pesados en referencia a isótopos ligeros preexistentes se utilizan para calcular las tasas relativas de recambio de proteínas. Generalmente, los isótopos de arginina y lisina se utilizan porque la tripsina se escinde en esos residuos; por lo tanto, todos los péptidos de la digestión estándar contendrán potencialmente la etiqueta pesada. Los pares de péptidos que difieren solo por la presencia o ausencia de lisina pesada o arginina son químicamente idénticos y pueden diferenciarse y cuantificarse mediante un espectrómetro de masas. Después del análisis de espectrometría de masas, los péptidos pueden identificarse como recién sintetizados o preexistentes en función de la presencia o ausencia de la etiqueta isotópica en las identificaciones peptídicas resultantes. Las tasas de recambio de proteínas se pueden determinar ajustando la proporción de péptidos pesados (13 C-15N) sobre ligeros (12 C-14N) para una proteína dada a modelos cinéticos para el crecimiento exponencial o la desintegración27,28. pSILAC se ha utilizado en varias comparaciones de las tasas de recambio de proteínas 29,30,31,32 y actualmente es el método más completo y de alto rendimiento para la medición de las vidas medias de las proteínas.
Este protocolo detalla la preparación de células senescentes en paralelo con células inactivas pareadas por crecimiento similar en cultivo, seguidas de un etiquetado metabólico con pSILAC. Las células se cosechan, homogeneizan en lisados y se procesan para la adquisición y el análisis de espectrometría de masas. Los datos obtenidos de la espectrometría de masas se utilizan para determinar las vidas medias de las proteínas utilizando un método cuantitativo simplificado que emplea un solo punto de tiempo y cálculos de vida media realizados en una hoja de cálculo. Usando este enfoque, las estimaciones de las vidas medias de las proteínas se pueden medir de una manera integral y cuantitativa que es más auténtica para las condiciones celulares imperturbables que los protocolos que utilizan bloqueadores de la síntesis o recambio de proteínas.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrilo (grado LC-MS)</td><td>Grainger</td><td>AH015</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Millipore-Sigma</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>BCA Kit de ensayo</td><td>ThermoFisher</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreotol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto contenido de glucosa, HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>12430112</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, certificado, inactivado por calor</td><td>ThermoFisher</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma</td><td>27001</td><td></td></tr><tr><td>Gammacel 40 Exactor</td><td>Best Theratronics</td> Irradiador de <td></td><td>cesio para células</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Yodoacetamida (IAA)</td><td>Sigma</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos pulmonares primarios IMR-90</td> sensibles a la luz <td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td></td></tr><tr><td>iRT Kit (tiempo de retención indexado)</td><td>Biognosys</td><td>Ki-3002-2</td><td>Patrones de péptidos de tiempo de retención indexado</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>ThermoFisher</td><td>423835000</td><td></td></tr><tr><td>Mascot</td><td>Matrix Science</td><td>Mascot Daemon 2.8</td><td>Software de búsqueda de bases de datos proteómicas</td></tr><tr><td>Maxima Reverse Transcritase (200 U/&micro; L)</td><td>ThermoFisher</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Nano LC System</td><td>ThermoFisher</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB Extracción en fase sólida Cartirdges</td><td>Waters</td><td>186000383</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Espectrómetro de masas</td><td>ThermoFisher</td><td>Q Exactive HF Orbitrap</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/Cloroformo/Alcohol isoamílico (25:24:1), EDTA 100 mM, pH 8,0</td><td>ThermoFisher</td><td>327110025</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Kit de cuantificación de proteínas SILAC (tripsina) -DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A33972</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 6</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Random Hexamer Primer</td><td>ThermoFisher</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>Senescence &beta;-Galactosidasa Staining Kit</td><td>Cell Signaling</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Skyline</td><td>University of Washington</td><td>Skyline-Daily v21.2.1.424</td><td>Software proteómico qantiativo gratuito y de código abierto. Disponible en www.skyline.ms</td></tr><tr><td>baño de agua Sonicator</td><td>Branson</td><td>CPX-952-516R</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo TRIzol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td>Referido como fenol en el texto;</td></tr><tr><td>peligroso TRYPle</td><td>Express ThermoFisher</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (grado de secuenciación)</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>TURBO Dnase (2U/ uL)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>ThermoFisher</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>Agua (grado LC-MS)</td><td>Grainger</td><td>AH365</td><td></td></tr></tbody></table>

medición de las tasas de recambio de proteínas en células cultivadas senescentes y no divisorias con etiquetado metabólico y espectrometría de masas

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

La creciente evidencia ha demostrado que la acumulación de células senescentes en el sistema nervioso central contribuye a trastornos neurodegenerativos como las enfermedades de Alzheimer y Parkinson. La senescencia celular es un estado de detención permanente del ciclo celular que generalmente ocurre en respuesta a la exposición a tensiones subletales. Sin embargo, al igual que otras células que no se dividen, las células senescentes permanecen metabólicamente activas y llevan a cabo muchas funciones que requieren demandas transcripcionales y traslacionales únicas y cambios generalizados en los proteomas intracelulares y secretados. Comprender cómo la síntesis de proteínas y las tasas de descomposición cambian durante la senescencia puede iluminar los mecanismos subyacentes de la senescencia celular y encontrar posibles vías terapéuticas para las enfermedades exacerbadas por las células senescentes. Este artículo describe un método para la evaluación a escala de proteoma de las vidas medias de proteínas en células que no se dividen utilizando el marcado de isótopos estables pulsados por aminoácidos en cultivo celular (pSILAC) en combinación con espectrometría de masas. pSILAC implica el etiquetado metabólico de células con versiones estables de aminoácidos que contienen isótopos pesados. Junto con los enfoques modernos de espectrometría de masas, pSILAC permite la medición del recambio de proteínas de cientos o miles de proteínas en mezclas complejas. Después del etiquetado metabólico, la dinámica de recambio de las proteínas se puede determinar en función del enriquecimiento relativo de isótopos pesados en péptidos detectados por espectrometría de masas. En este protocolo, se describe un flujo de trabajo para la generación de cultivos de fibroblastos senescentes y fibroblastos quiescentes detenidos de manera similar, así como un curso de tiempo de etiquetado pSILAC simplificado de un solo punto de tiempo que maximiza la cobertura de las tasas de rotación de proteínas anticipadas. Además, se presenta una tubería para el análisis de los datos de espectrometría de masas pSILAC y el cálculo fácil de usar de las tasas de degradación de proteínas utilizando hojas de cálculo. La aplicación de este protocolo se puede extender más allá de las células senescentes a cualquier célula cultivada que no se divida, como las neuronas.

Este protocolo describe un método para comparar globalmente las vidas medias de las proteínas entre las células de control senescentes y no dividientes, inactivas utilizando pSILAC y puntos de tiempo mínimos. Este protocolo detalla la generación de células senescentes y quiescentes en cultivo, el etiquetado metabólico de células con isótopos estables de arginina y lisina durante 3 días, la cuantificación de las abundancias relativas de isótopos peptídicos pesados y ligeros mediante espectrometría de masas, y un cálculo directo y accesible de las vidas medias de proteínas utilizando fórmulas de hoja de cálculo (Figura 1). Este método es altamente flexible y se puede adaptar a numerosos tipos de células y condiciones.
Como parte de la generación de células senescentes para este protocolo, se utilizan dos métodos de validación de senescencia: células SA-βGal-positivas visualizadas por microscopía y aumento de los niveles de marcadores senescentes cuantificados mediante análisis RT-qPCR. La medición de los marcadores senescentes debe proporcionar distinciones claras entre las células inactivas y senescentes para que las comparaciones de las poblaciones de las dos células se consideren válidas. Para la actividad de SA-βGal, las células senescentes deben aparecer azules, mientras que las células de control inactivas no tienen o tienen muy poco color (Figura 2A). Este ensayo se puede cuantificar contando las células positivas teñidas de azul como un porcentaje del número total de células, y luego comparando la tasa de positividad porcentual entre el control inactivo y las células senescentes. Es importante que este protocolo se realice al mismo tiempo para la comparación de ambos estados celulares; La actividad de SA-βGal se basa en el pH de la solución de tinción, por lo que los resultados pueden variar sustancialmente entre los ensayos y deben considerarse una medida cualitativa.
El análisis RT-qPCR de marcadores senescentes mostrará altos niveles de los ARNm que codifican los factores SASP (IL6, CXCL8, IL1B) y los inhibidores del ciclo celular (CDKN2A/p16, CDKN1A/p21) en la mayoría de los modelos senescentes. Aunque se espera alguna variación basada en el tipo de célula, la condición de cultivo y el inductor senescente 41,42, la mayoría de las células senescentes muestran niveles más altos que cinco veces más altos de IL6, CXCL8 y CDKN1A / p21 mRNAs en comparación con las células de control inactivas; por el contrario, los niveles de ARNm LMNB1 y PCNA, que codifican marcadores de proliferación, deben ser bajos o ausentes en las células senescentes en comparación con las células inactivas (Figura 2B). En conjunto, un porcentaje significativo de positividad de SA-βGal y la expresión esperada de un panel de marcadores de ARNm asociados a la senescencia son suficientes para confirmar la inducción de la senescencia en un experimento.
El procesamiento de muestras de proteínas para el análisis de espectrometría de masas consiste en la digestión en solución (2 días) y la extracción en fase sólida (4-6 h). Para realizar un análisis proteómico no dirigido, los péptidos resultantes se envían para el análisis LC-MS/MS utilizando la adquisición dependiente de datos (DDA). En los instrumentos Orbitrap, se puede especificar un método DDA en el editor de métodos de software de instrumentos de espectrometría de masas. Los ajustes del espectrómetro de masas utilizados en este estudio se muestran en la Figura 3A. La configuración de cromatografía líquida también se puede especificar en el editor de métodos. Para este estudio se utilizó un gradiente lineal de 90 min con fase orgánica creciente (acetonitrilo) (Figura 3B). Después de una adquisición exitosa, la corriente iónica total (TIC) debe contener una señal intensa durante la porción de gradiente lineal del método (Figura 3C). Este protocolo describe un protocolo de ejemplo en un instrumento Orbitrap, pero el cálculo de la vida media de la proteína se puede realizar sobre los datos obtenidos de cualquier espectrómetro de masas que se recopiló en modo DDA, que está disponible en varios tipos de instrumentos (por ejemplo, Orbitraps e instrumentos de tiempo de vuelo) y proveedores. Los ajustes de adquisición serán exclusivos del tipo y la configuración del instrumento utilizado, y se recomienda utilizar los ajustes sugeridos por la instalación de espectrometría de masas. Este método también es compatible con métodos no DDA (SRM, PRM, DIA), siempre que las áreas de pico cromatográficas cuantitativas para picos pesados y ligeros se puedan extraer de los archivos de datos sin procesar e ingresar en las fórmulas de la hoja de cálculo.
Los archivos de espectrometría de masas en bruto se buscan con una de las muchas herramientas de búsqueda de bases de datos proteómicas disponibles para identificar péptidos y proteínas. Por ejemplo, este estudio utilizó el motor de búsqueda Mascot43. Para obtener áreas de pico cromatográficas para la cuantificación de péptidos pesados y ligeros, los resultados de búsqueda de la base de datos se importan a un software proteómico capaz de áreas de pico cromatográficas como Skyline39,40. El examen de los cromatogramas iónicos extraídos de péptidos (Figura 4) revelará la proporción relativa de señales peptídicas pesadas y ligeras. Una menor proporción de señal de péptido pesado en relación con la señal de péptido ligero en células senescentes indica una tasa de renovación de proteínas más lenta (Figura 4A), y una señal de péptido pesado más alta en relación con la luz indica una tasa de renovación de proteínas más rápida (Figura 4B). Las muestras no etiquetadas deben mostrar poca o ninguna señal peptídica pesada. Cualquier señal aparente de péptido pesado en las muestras no etiquetadas se considera ruido de fondo y se restará durante los cálculos finales. La cuantificación de las zonas de pico cromatográficas para péptidos ligeros y pesados para todas las condiciones de tratamiento y etiquetado debe exportarse para el cálculo posterior de las tasas de recambio de proteínas y el análisis estadístico.
Mediante el uso de análisis de un solo punto de tiempo, la cuantificación de las vidas medias de las proteínas es fácil de realizar y se puede hacer convenientemente en hojas de cálculo. En la Tabla 3, se calcularon las vidas medias de 695 proteínas identificadas a partir del análisis de espectrometría de masas. A partir de las abundancias de isótopos pesados y ligeros a nivel de proteína para cada proteína en las muestras (entrada para la 1) hoja de datos en bruto ), un porcentaje de isótopo pesado (denominado Ratio, R) se calcula automáticamente en la hoja titulada 2) Ratio H | H +L. En este paso, la R de muestras pesadas etiquetadas se normaliza restando la R de muestras no etiquetadas para producir una R final para los triplicados quiescentes y senescentes. Dado que las muestras no etiquetadas no deben tener ningún isótopo pesado añadido exógenamente, se utilizan para eliminar la señal de fondo. A partir de R, el kdeg (tasa de rotación) se calcula utilizando la siguiente fórmula:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq01.jpg" style="margin: auto;">
La vida media (H, en días) se determina para cada proteína en el control quiescente y triplicatos senescentes (hoja titulada 3) Vida media (días)) utilizando la siguiente fórmula:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq02.jpg" style="margin: auto;">
Estas vidas medias se promedian entre los triplicados quiescentes y senescentes para generar una vida media quiescente y senescente media para cada proteína, así como un valor p. Las vidas medias calculadas se filtran para los valores que son negativos, lo que ocurre cuando la señal pesada de las células marcadas como ligeras (el fondo) es mayor que la señal pesada de las células marcadas con luz. Este filtrado dio como resultado 707 proteínas de 841 identificadas con vidas medias válidas para los resultados presentados aquí.
La vida media se informa entonces como una relación log2 de células de control senescentes sobre quiescentes (log2FC) y se traza en una gráfica de volcán (Figura 5). Por ejemplo, al observar la hoja de análisis 5), se puede ver que la proteína del receptor de trombina de coagulación II (F2R) tiene una vida media en células inactivas de 0,51 días (columna B) y una vida media en células senescentes de 1,07 días (columna C) que produjo un log2FC de ~ 1,06 (columna D) con un valor p de 0,001.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama del flujo de trabajo de pSILAC para celdas de control senescentes y inactivas. Los fibroblastos IMR-90 humanos se utilizaron para preparar cultivos celulares quiescentes (bajo suero) o senescentes (IR) para la comparación de las vidas medias de las proteínas. Las células se etiquetaron con medios SILAC Light o SILAC Heavy con arginina isotópica y lisina durante 3 días. Los lisados se extrajeron de las células, se digirieron, se desalaron y se analizaron mediante espectrometría de masas. Los picos de isótopos peptídicos pesados y ligeros corresponden a péptidos recién sintetizados y preexistentes, respectivamente. Las vidas medias se calcularon utilizando una ecuación para el decaimiento exponencial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig02.jpg"> Figura 2: Validación de fenotipos senescentes mediante análisis SA-βGal y RT-qPCR. (A) Las células senescentes y quiescentes se vuelven a chapar en el momento de la cosecha en una placa de 6 pocillos y se tiñen para SA-βGal utilizando el kit de tinción SA-βGal. El color azul en el cuerpo celular es positivo para la senescencia. Las imágenes se toman en campo brillante con color a un aumento de 10x, marcador de tamaño en rojo. (B) Análisis RT-qPCR que compara células senescentes (rojas) y células ciclativas (grises) de un experimento no relacionado. Los aumentos en los niveles de CDKN1A/p21, CXCL8 e IL6 mRNAs son indicativos de senescencia, al igual que la disminución en los niveles de ARNm LMNB1 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig03.jpg"> Figura 3: Métodos representativos para exploraciones de adquisición dependiente de datos (DDA) y gradiente de cromatografía líquida de cultivos de pSILAC en el espectrómetro de masas de orbitrap Q-Exactive HF. (A) Configuración recomendada del instrumento en el software del instrumento para el análisis dependiente de datos de lisados de células enteras a partir de un experimento pSILAC. (B) Ejemplo de configuración del método de gradiente de flujo de cromatografía líquida. Los péptidos se eluyen sobre un gradiente lineal de 90 minutos que oscila entre el 5% y el 35% del tampón B (0,2 % de ácido fórmico y 99,8% de acetonitrilo), seguido de un lavado de 10 minutos con un búfer B del 80% y 25 minutos de equilibrio con un tampón B al 5%. (C) Un cromatograma iónico total (TIC) representativo de una adquisición por espectrometría de masas de péptidos fibroblásticos IMR-90 adquiridos con los ajustes especificados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig04.jpg"> Figura 4: Cromatogramas iónicos extraídos representativos de péptidos con recambio alterado durante la senescencia. (A) Áreas de pico cromatográficas del péptido FQMTQEVVCDECPNVK++ de la proteína DnaJ homólogo de la subfamilia B miembro 11 (DNAJB11) en células senescentes y no senescentes. Después de 3 días de SILAC, las células senescentes incorporan isótopos menos pesados en este péptido en comparación con las células inactivas (no senescentes), como lo indica una reducción en el área pico del péptido que contiene isótopos pesados (azul) en relación con el péptido claro (rojo), lo que indica que este péptido ha reducido el recambio en las células senescentes. (B) Áreas de pico cromatográficas del péptido VQAQVIQETIVPK++ de la proteína Factor de empalme 3a Subunidad 1 (SF3A1) en células senescentes y no senescentes. Después de 3 días de SILAC, las células senescentes incorporan una mayor proporción de isótopos pesados en este péptido en comparación con las células inactivas (no senescentes), como lo indica una reducción en el área pico del péptido que contiene isótopos pesados (azul) en relación con el péptido ligero (rojo), lo que indica que este péptido ha aumentado el recambio en las células senescentes. Las condiciones no etiquetadas (Día 0) no muestran incorporación de isótopos pesados para ambos péptidos, como se esperaba. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig05.jpg"> Figura 5: Comparación de las vidas medias de proteínas en células senescentes y inactivas determinadas a partir del etiquetado pSILAC. (A) Diagrama de volcán que muestra la relación log2 de senescente / control (inactivo) para cada una de las 695 proteínas identificadas; en este experimento, los medios de etiquetado Light and Heavy no contenían glucosa ni rojo fenol. (B) Tablas que muestran las 10 proteínas principales con las vidas medias más aumentadas o disminuidas en las células inactivas frente a las células senescentes (izquierda y derecha, respectivamente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Medios y búferes utilizados en este protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%201-63835R1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 2: Cebadores RT-qPCR utilizados en este protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%202-63835R1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 3: Libro de trabajo de análisis SILAC para el cálculo de vidas medias de proteínas, cambios de pliegue y pruebas t. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%203%20v3.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Este protocolo describe el flujo de trabajo para el etiquetado metabólico de células senescentes y no en división con SILAC pulsado, análisis de espectrometría de masas no dirigido y un cálculo simplificado de las vidas medias de las proteínas.

Medición de las tasas de recambio de proteínas en células cultivadas senescentes y no divisorias con etiquetado metabólico y espectrometría de masas

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

La forma en que las células mantienen la homeostasis de las proteínas no se entiende bien en el contexto del estrés celular y la senescencia. En este protocolo, proporcionamos una forma simple y precisa de calcular el recambio de proteínas, que es un componente clave de la homeostasis de proteínas en células vivas. Pulse SILAC le da a un experimentador la capacidad de medir la renovación de proteínas para proteínas individuales y todo el proteoma de una manera de alto rendimiento que también es más auténtica para los sistemas biológicos que otros métodos.Los principios de este método se pueden aplicar a cualquier sistema que pueda ser etiquetado metabólicamente, incluyendo organismos enteros. Este método también puede conducir a la comprensión de la senescencia celular, el envejecimiento y las enfermedades neurodegenerativas. El análisis de espectrometría de masas es altamente sensible a ciertos contaminantes químicos, como los detergentes.Utilice reactivos de grado LC-MS durante todo este procedimiento para garantizar una recopilación de datos de alta calidad. Para comenzar el etiquetado metabólico de las células, reemplace los medios para tres placas cada una de células senescentes y quiescentes con 30 mililitros de medios de luz SILAC. Por separado, reemplace el medio para tres placas senescentes y tres inactivas con 30 mililitros de SILAC Heavy.Cultive las células durante tres días sin cambiar el medio. Para separar las células de las placas de cultivo, agregue cinco mililitros de reactivo de tripsina precalentado a cada placa e incube las placas durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Más tarde, resuspend las células separadas en cinco mililitros del mismo medio utilizado para el cultivo a un volumen total de 10 mililitros.A continuación, transfiera las células al hielo y centrífuga las células a 300 veces G a cuatro grados centígrados. Después de lavar el pellet dos veces, gire las células nuevamente y retire el sobrenadante antes de volver a depositar el pellet en 150 microlitros de urea de ocho molares recién preparada y tampón de lisis de bicarbonato de amonio 50 milimolar. Mezcle el contenido del tubo mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo.Alícuota 50 microgramos de la muestra de proteína en un nuevo tubo y lleva las muestras a volúmenes iguales con tampón de lisis. Luego agregue ditiotreitol a una concentración final de 20 milimolares al tubo e incube la muestra a 37 grados Celsius durante 30 minutos con agitación. Deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de agregar yodoacetamida a una concentración final de 40 milimolares e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos.Luego diluya la muestra por debajo de la urea de un molar con un tampón de bicarbonato de amonio de 50 milimolares. Agregue un microgramo de tripsina por 50 microgramos de proteína inicial o a 1:50 de la proporción de tripsina a proteína a la muestra. Incubar la muestra durante la noche a 37 grados centígrados con agitación para digerir las proteínas en péptidos.Al día siguiente, agregue ácido fórmico al 1% por volumen de la muestra para calmar la digestión de la proteína. Para la limpieza de la muestra, coloque un cartucho de extracción en fase sólida en un colector de vacío, utilizando un cartucho de extracción para cada muestra, de acuerdo con las pautas del fabricante. Después de la extracción, retire las muestras de péptidos del colector de vacío y séquelas completamente en un concentrador de vacío.El secado dura aproximadamente tres horas. Para la espectrometría de masas, o análisis de EM, resuspender la muestra peptídica a una concentración de 400 nanogramos por microlitro en un tampón de ácido fórmico al 0,2%. Para resolver los péptidos, mezcle la muestra durante cinco minutos.Luego, sonicar durante cinco minutos en un sonicador de baño de agua. Luego, centrífuga la muestra para granular los materiales insolubles y transferir los sobrenadantes peptídicos a viales de EM. Envíe las muestras para el análisis proteómico mediante cromatografía líquida en tándem espectrometría de masas, o LC-MS-MS.Utilice la configuración recomendada para el análisis no dirigido por la instalación de espectrometría de masas. Cargue las muestras en una columna analítica con un caudal de 400 nanolitros por minuto para eluir los péptidos a lo largo de un gradiente lineal de 90 minutos utilizando una mezcla de disolventes orgánicos e inorgánicos, con el disolvente orgánico que oscila entre el 5 y el 35%Adquirir datos de espectrometría de masas en el modo dependiente de datos, con un ciclo continuo de escaneos de encuesta MS1 seguido de 20 escaneos MS2 dependientes de datos con fragmentación HCD. Cuantifique las áreas de pico de péptidos para péptidos pesados y ligeros en la herramienta de software Proteome Quantitation.Luego, exporte las áreas pico de péptidos pesados y ligeros. Para el cálculo de las vidas medias de las proteínas, abra el Libro de trabajo de análisis SILAC en la primera hoja denominada Datos sin procesar y pegue los ID de UniProt, los nombres de los genes, las áreas pico pesadas y ligeras en las columnas indicadas. A continuación, abra la cuarta hoja denominada Análisis y quite las filas donde las columnas G y H indican que la muestra está fuera del rango y mantenga las filas que leen dentro del rango.Los fenotipos senescentes se validaron mediante la actividad de la beta-galactosidasa asociada a la senescencia y el análisis RT-qPCR. Para la actividad de la beta-galactosidasa, las células senescentes parecían azules, mientras que las células de control inactivas no tenían o tenían un color mínimo. En el análisis RT-qPCR, las células senescentes mostraron mayores arronales de interleucina-6, CXCL8 y CDKN1A-P21 en comparación con las células inactivas.Por el contrario, el nivel de lamina B1 que codifica para el marcador de proliferación fue bajo o ausente en las células senescentes. Los cromatogramas iónicos extraídos de péptidos revelaron la proporción relativa de señales peptídicas pesadas y ligeras. Una menor proporción de señales de péptidos pesados en relación con las células senescentes ligeras indicó una tasa de renovación de proteínas más lenta, y una señal de péptido pesado más alta en relación con la luz indicó una tasa de renovación de proteínas más rápida.Las muestras no etiquetadas mostraron poca o ninguna señal peptídica pesada. Se calcularon las vidas medias de 695 proteínas identificadas a partir del análisis de espectrometría de masas. La vida media se informa como una relación log-dos de células senescentes sobre células inactivas y se traza en una gráfica de volcán.Tras el cálculo de las tasas de renovación de proteínas en células senescentes, el análisis posterior puede revelar vías biológicas candidatas que están reguladas por mecanismos de proteostasis. Pulse SILAC allanó el camino para que los investigadores estudiaran la dinámica de las proteínas con una granularidad y un rendimiento sin precedentes, lo que nos permitió estudiar los cambios en la homeostasis de las proteínas en muchas proteínas individuales.

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Investigación

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Bioquímica

Este video ilustra un ensayo basado en citometría de flujo para cuantificar células cancerosas senescentes inducidas por la terapia con marcadores de senescencia duales. La detección y cuantificación de células senescentes implica el uso de un sustrato de β-galactosidasa. El sustrato es escindido por la β-galactosidasa lisosomal activa dentro de las células senescentes, produciendo un producto fluorescente que, junto con gránulos de lipofuscina autofluorescente, marca las células cancerosas...

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Si senescencia previene o promueve la tumorigénesis sigue siendo controvertido. Como los fármacos quimioterapéuticos pueden inducir a las células cancerosas a la senescencia, el estudio de la senescencia es esencial para proponer nuevas terapias. Sin embargo, el ensayo de β-galactosidasa estándar y ampliamente utilizado presenta importantes inconvenientes. Proponemos aquí un ensayo de citometría basada rápido y sensible para cuantificar el flujo de la senescencia.

Un método sensible para cuantificar las células cancerosas senescentes

Aquí se describe un método robusto para el fraccionamiento de las membranas de plasma de plantas en las membranas solubles resistentes y detergentes detergente a base de una mezcla de no marcado e in vivo completamente 15 N cultivos de células de Arabidopsis thaliana etiquetados. El procedimiento se aplica para los estudios proteómicos comparativos para entender los procesos de señalización.

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Medición de las tasas de recambio de proteínas en células cultivadas senescentes y no divisorias con etiquetado metabólico y espectrometría de masas (Video) | JoVE Journal

Medición de las tasas de recambio de proteínas en células cultivadas senescentes y no divisorias con etiquetado metabólico y espectrometría de masas

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