Name: Un enfoque integrado para la identificación de microproteínas y el análisis de secuencias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprende a identificar microproteínas mediante PhyloCSF en el navegador UCSC Genome Browser. Este protocolo computacional permite analizar regiones genómicas no codificantes sin requerir experiencia previa en bioinformática.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (HL-141630 y HL-160569) y la Fundación de Investigación Infantil de Cincinnati (Premio Del Fideicomisario).

El protocolo que se describe a continuación detalla los pasos para cargar y navegar por las pistas del navegador PhyloCSF en el UCSC Genome Browser (generado por Mudge et al.49). Para preguntas generales sobre el UCSC Genome Browser, se puede encontrar una extensa Guía del usuario de Genome Browser aquí: <a href="https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html">https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html</a>.
1. Carga del PhyloCSF Track Hub en el ucsc genome browser
<ol><li>Abra una ventana del navegador de Internet y navegue hasta el UCSC Genome Browser (<a href="https://genome.ucsc.edu/">https://genome.ucsc.edu/</a>).</li>
	<li>En el encabezado Nuestras herramientas , seleccione la opción Centros de seguimiento . NOTA: La opción Centros de seguimiento también se puede encontrar en la pestaña Mis datos .</li>
	<li>En la pestaña Centros públicos , escriba PhyloCSF en el cuadro Términos de búsqueda . Haga clic en el botón Buscar centros públicos .</li>
	<li>Conéctese a PhyloCSF haciendo clic en el botón Conectar para el nombre del concentrador PhyloCSF (Descripción: Potencial evolutivo de codificación de proteínas medido por PhyloCSF). NOTA: Este track hub se cargará en numerosos conjuntos, incluidos humanos (hg19 y hg38) y ratones (mm10 y mm39).</li>
	<li>Después de hacer clic en conectar, espere a ser redirigido a la página UCSC Genome Browser Gateway (<a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway</a>).</li>
</ol>2. Navegación a genes de interés utilizando identificadores de genes
<ol><li>Seleccione la especie y el ensamblaje del genoma que desea consultar. Para consultar una especie diferente (por ejemplo, ratón), seleccione la especie de interés en el encabezado Examinar/Seleccionar especies haciendo clic en el icono correspondiente, o escriba la especie en el cuadro de texto que dice: Introduzca especies, nombre común o ID de conjunto. NOTA: El conjunto aparece directamente en el encabezado Buscar posición . Normalmente, el valor predeterminado es la Asamblea Humana (por ejemplo, diciembre de 2009 [GRCh37/hg19]).</li>
	<li>Elija el conjunto que desea buscar en el encabezado Buscar posición mediante el menú desplegable.</li>
	<li>Ingrese la posición, el símbolo del gen o los términos de búsqueda en el cuadro Posición / Término de búsqueda y haga clic en Ir para navegar a un gen de interés en el Navegador del genoma.</li>
	<li>Si la búsqueda dio lugar a varias coincidencias, espere a ser redirigido a una página que requiera la selección de una posición de interés. Haga clic en el gen apropiado de interés.</li>
</ol>3. Navegar a las regiones genómicas de interés utilizando información de secuencia
<ol><li>Navegue hasta el UCSC Genome Browser (<a href="https://genome.ucsc.edu/">https://genome.ucsc.edu/</a>) y seleccione la herramienta de alineación blast-like (BLAT) en el encabezado Nuestras herramientas para consultar una secuencia específica de ADN o proteína. Alternativamente, coloque el cursor sobre la pestaña Herramientas y seleccione la opción Blat o siga este enlace: <a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat</a>.</li>
	<li>Seleccione la especie (Genoma) y el Ensamblaje de interés utilizando los menús desplegables.</li>
	<li>Defina el tipo de consulta mediante el menú desplegable.</li>
	<li>Pegue la secuencia de interés en el cuadro de texto Genoma de búsqueda blaT y haga clic en Enviar.</li>
	<li>Haga clic en el enlace del navegador debajo del encabezado ACCIONES para navegar a la región genómica de interés.</li>
</ol>4. Identificación de sORF conservados utilizando datos de seguimiento de PhyloCSF
<ol><li>Escanee visualmente el área genómica de interés para calificar positivamente las regiones PhyloCSF (Figura 1). NOTA: Para obtener una explicación detallada de cómo interpretar visualmente las puntuaciones de PhyloCSF en el UCSC Genome Browser, consulte la sección de resultados representativos a continuación.</li>
	<li>Utilice la función de zoom para ampliar las regiones de interés para examinar las características de la secuencia y buscar codones de inicio/parada. Para acercar manualmente, mantenga presionada la tecla Mayús y mantenga presionado el botón del mouse mientras arrastra a lo largo de la región de interés. Alternativamente, use los botones de acercar y alejar en la parte superior de la página para navegar (las opciones de zoom 1.5x, 3x, 10x o base están disponibles). NOTA: Antes de usar los botones de zoom in/zoom out , es necesario reposicionar el gen para que la región de interés esté en el centro de la pantalla. Para realizar esta acción, haga clic en la imagen y arrástrela hacia la izquierda o hacia la derecha para mover la región genómica horizontalmente como desee o use las flechas de movimiento en la parte superior de la página.</li>
	<li>Amplíe el zoom hasta que la secuencia de nucleótidos (base) sea visible. NOTA: La secuencia de nucleótidos aparecerá directamente encima de la puntuación +1 Smoothed PhyloCSF.</li>
	<li>Escanee visualmente la secuencia de nucleótidos cerca del principio y el final de las regiones PhyloCSF con puntuación positiva para identificar los codones de inicio y parada putativos (TGA / TAA / TAG). NOTA: Si el gen de interés está en la cadena menos de ADN, los codones de inicio y parada serán el complemento inverso (es decir, CAT para el codón de inicio y TCA / TTA / CTA para el codón de parada).</li>
</ol>5. Visualización de regiones homólogas en otros genomas
<ol><li>Pase el mouse sobre el encabezado Ver en la parte superior de la página y haga clic en la opción En otros genomas (Convertir ).</li>
	<li>Defina el genoma de interés utilizando el menú desplegable debajo del encabezado Nuevo genoma .</li>
	<li>Seleccione el conjunto genómico de interés mediante el menú desplegable situado en el encabezado Nuevo conjunto y , a continuación, haga clic en el botón Enviar .</li>
	<li>Una vez que el navegador devuelva una lista de regiones en el nuevo ensamblado con similitud, haga clic en el enlace de posición cromosómica para navegar a la región homóloga de interés. NOTA: El porcentaje de bases totales (nucleótidos) y el lapso que cubre la región se definirán para cada región enumerada. Cuanto mayor sea el porcentaje de bases coincidentes, mayor será la conservación para la región de interés.</li>
	<li>Siga las mismas estrategias de navegación detalladas en la Sección 4 para analizar la secuencia.</li>
</ol>6. Generación de alineaciones de secuencias multiespecies para microproteínas de interés
<ol><li>Haga clic en el gen de interés en la pista GENCODE en el UCSC Genome Browser (indicado en la Figura 1A con un cuadro azul) para navegar a la página de descripción del gen.</li>
	<li>En el encabezado Secuencia y enlaces a herramientas y bases de datos , haga clic en el enlace de la tabla que dice Otras especies FASTA.</li>
	<li>Haga clic en las casillas asociadas a las especies de interés para seleccionarlas. Haga clic en Enviar. Copie y pegue las secuencias que aparecen en la parte inferior de la página en formato FASTA en un documento de procesamiento de textos.</li>
	<li>Abra una segunda ventana del navegador y navegue hasta la herramienta Clustal Omega Multiple Sequence Alignment 52 en el sitio web del Instituto Europeo de Bioinformática (EMBL-EBI)53,54: <a href="https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/">https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/</a>.</li>
	<li>Pegue los archivos de secuencia que todavía están en el portapapeles en el cuadro del STEP 1 que lee secuencias en cualquier formato compatible. Desplácese hasta la parte inferior de la página y haga clic en Enviar. Mire debajo de los resultados alineados (en fuente negra) los símbolos que indican el grado de conservación de cada aminoácido (los símbolos se definen en la Tabla 1). NOTA: Puede tardar varios minutos en generar la alineación.</li>
	<li>Para ver las propiedades de los aminoácidos en color, haga clic en el enlace Mostrar colores directamente encima de las secuencias para colorear los aminoácidos de acuerdo con sus propiedades (definidas en la Tabla 2).</li>
	<li>Copie y pegue la alineación de la secuencia en un programa de procesamiento de textos o presentación de diapositivas para generar una figura o un archivo de ilustración (por ejemplo, la Figura 2). NOTA: Utilice una fuente monoespaciada para la alineación, como Courier.</li>
	<li>Para ver otros resultados de la página de resultados de Clustal Omega , haga clic en las pestañas correspondientes (es decir, Árbol guía o Árbol filogenético).</li>
	<li>Haga clic en la pestaña Visores de resultados para ver las opciones para ver la información de la secuencia utilizando Jalview, un programa gratuito que se especializa en la edición, visualización y análisis de alineación de secuencias múltiples55, o para acceder a enlaces directos a MView y Simple Phylogeny56.</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El protocolo presentado aquí proporciona instrucciones detalladas sobre cómo interrogar las regiones genómicas de interés para el potencial de codificación de microproteínas utilizando PhyloCSF en el navegador del genoma UCSC fácil de usar 48,49,50,51. Como se detalló anteriormente, PhyloCSF es un poderoso algoritmo de genómica comparativa que integra modelos filogenéticos y frecuencias de sust...

La identificación del conjunto completo de elementos codificantes en el genoma ha sido un objetivo importante desde el inicio del Proyecto Genoma Humano, y sigue siendo un objetivo central hacia la comprensión de los sistemas biológicos y la etiología de las enfermedades de base genética 1,2,3,4. Los avances en las técnicas ngs han llevado a la producción de secuencias del genoma completo para un gran número de organismos, incluidos vertebrados, invertebrados, levaduras y plantas5. Además, los métodos de secuenciación transcripcional de alto rendimiento han revelado aún más la complejidad del transcriptoma celular e identificado miles de nuevas moléculas de ARN con funciones codificantes y no codificantesde proteínas 6,7. La decodificación de esta gran cantidad de información de secuencia es un proceso continuo, y siguen existiendo desafíos con los esfuerzos integrales de anotaciónde genes 8.
El reciente desarrollo de métodos de perfiles traslacionales, incluidos el perfil de ribosomas 9,10 y la secuenciación de poli ribosomas11, han proporcionado evidencia que indica que cientos de eventos de traducción no canónica se asignan a sORF actualmente no anotados en todo el genoma, con el potencial de generar pequeñas proteínas llamadas microproteínas o micropéptidos 12,13,14,15,16, 17. Las microproteínas han surgido como una nueva clase de proteínas versátiles previamente pasadas por alto por los métodos estándar de anotación de genes debido a su pequeño tamaño (<100 aminoácidos) y la falta de características clásicas de genes codificantes de proteínas 8,12,18,19,20. Las microproteínas se han descrito en prácticamente todos los organismos, incluyendo la levadura21,22, las moscas 17,23,24 y los mamíferos 25,26,27,28, y se ha demostrado que desempeñan un papel crítico en diversos procesos, incluyendo el desarrollo, el metabolismo y la señalización de estrés 19,20,29, 30,31,32,33,34. Por lo tanto, es imperativo continuar extrayendo el genoma para miembros adicionales de esta clase de proteínas pequeñas funcionales que se han pasado por alto durante mucho tiempo.
A pesar del reconocimiento generalizado de la importancia biológica de las microproteínas, esta clase de genes sigue estando muy poco representada en las anotaciones del genoma, y su identificación precisa sigue siendo un desafío continuo que ha obstaculizado el progreso en el campo. Recientemente se han desarrollado varias herramientas computacionales y métodos experimentales para superar las dificultades asociadas con la identificación de secuencias codificantes de microproteínas (discutidas ampliamente en varias revisiones exhaustivas 8,35,36,37). Muchos estudios recientes de identificación de microproteínas 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47 se han basado en gran medida en el uso de uno de estos algoritmos llamado PhyloCSF 48,49 , un poderoso enfoque de genómica comparativa que se puede aprovechar para distinguir las regiones codificantes de proteínas conservadas del genoma de las que no codifican.
PhyloCSF compara las frecuencias de sustitución de codones (CSF) utilizando alineaciones de nucleótidos de múltiples especies y modelos filogenéticos para detectar firmas evolutivas de genes codificantes de proteínas. Este enfoque empírico basado en modelos se basa en la premisa de que las proteínas se conservan principalmente a nivel de aminoácidos en lugar de la secuencia de nucleótidos. Por lo tanto, las sustituciones de codones sinónimos, que codifican el mismo aminoácido, o las sustituciones de codones a aminoácidos con propiedades conservadas (es decir, carga, hidrofobicidad, polaridad) se puntúan positivamente, mientras que las sustituciones no sinónimas, incluidas las sustituciones sin sentido y sin sentido, puntúan negativamente. PhyloCSF está entrenado en datos de genoma completo y ha demostrado ser eficaz para puntuar porciones cortas de una secuencia codificante (CDS) aisladamente de la secuencia completa, lo cual es necesario cuando se analizan microproteínas o exones individuales de genes codificantes de proteínas estándar48,49.
En particular, la reciente integración de los centros de seguimiento de PhyloCSF en el Genome Browser 49,50,51 de la Universidad de California en Santa Cruz (UCSC) permite a los investigadores de todos los orígenes acceder fácilmente a una interfaz fácil de usar para consultar las regiones genómicas de interés para el potencial de codificación de proteínas. El protocolo que se describe a continuación proporciona instrucciones detalladas sobre cómo cargar los centros de seguimiento de PhyloCSF en el UcSC Genome Browser y, posteriormente, interrogar las regiones genómicas de interés para sondear las regiones codificantes de proteínas de alta confianza (o la falta de ellas). Además, en el caso de que se observe una puntuación positiva de PhyloCSF, se delinean pasos para analizar más a fondo el potencial de codificación de microproteínas y generar de manera eficiente alineaciones de múltiples especies de las secuencias de aminoácidos identificadas para ilustrar la conservación de secuencias entre especies. Por último, en la discusión se introducen varios recursos y herramientas adicionales disponibles públicamente para estudiar las características de las microproteínas identificadas, incluidas las estructuras de dominio predichas y la comprensión de la supuesta función de las microproteínas.

<table><tbody><tr><td>Website</td><td>Website Address</td><td>Requirements</td><td></td></tr><tr><td>Clustal Omega Multiple Sequence Alignment Tool</td><td><a href="https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/">https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/</a></td><td>Navegador</td> <td>webPrograma de alineación de secuencias múltiples para la alineación eficiente de secuencias FASTA (es decir, para la comparación entre especies de microproteínas identificadas)</td></tr><tr><td>COXPRESSdb</td><td><a href="https://coxpresdb.jp">https://coxpresdb.jp</a></td><td>Navegador web</td><td>Proporciona relaciones génicas correguladas para estimar las funciones de los genes</td></tr><tr><td>Preguntas frecuentes sobre las herramientas de bioinformática EMBL-EBI</td><td><a href="https://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/JDSAT/Bioinformatics+Tools+FAQ">https://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/JDSAT/Bioinformatics+Tools+FAQ</a></td><td>Preguntas</td><td>frecuentes (FAQs) del navegador web sobre las herramientas EMBL-EBI. Incluye la clave de codificación por colores para las alineaciones de secuencias de proteínas</td></tr><tr><td>Instituto Europeo de Bioinformática (EMBL-EBI), Herramientas y recursos de datos</td><td><a href="https://www.ebi.ac.uk/services/all">https://www.ebi.ac.uk/services/all</a></td><td>Navegador web</td><td>Lista completa de sitios web, herramientas y recursos de datos disponibles gratuitamente</td></tr><tr><td>Expasy - Portal</td> <td>Suizo de Recursos Bioinformáticos<a href="https://www.expasy.org">https://www.expasy.org</a></td><td>Navegador web</td><td>Conjunto de herramientas y recursos bioinformáticos para el análisis de secuencias de proteínas mantenido por el Instituto Suizo de Bioinformática (SIB)</td></tr><tr><td>Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) Búsqueda</td> <td>de dominio conservado<a href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi</a></td><td>Navegador web</td><td>Herramienta de búsqueda para identificar dominios conservados dentro de secuencias de proteínas o nucleótidos codificantes</td></tr><tr><td>Pfam 35</td><td><a href="http://pfam.xfam.org">http://pfam.xfam.org</a></td><td>Navegador web</td><td>Base de datos de la familia de proteínas (Pfam), proporciona alineaciones y clasificación de familias y dominios de proteínas</td></tr><tr><td>PhyloCSF Track Hub Descripción</td><td><a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?hgsid=1267045267_TEc99h2oW5QedaCd4ir8aZ65ryaD&amp; db=mm10& c=chr2& g=hub_109801_PhyloCSF_smooth"> https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?hgsid=1267045267_TEc99h2oW5Q edaCd4ir8aZ65ryaD&db=mm10 &c=chr2&g=hub_109801_ PhyloCSF_smooth</a></td><td>Navegador web</td><td>Descripción detallada de las pistas Smoothed PhyloCSF y PhyloCSF Track Hub &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td></tr><tr><td>SignalP 6.0</td><td><a href="https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? SeñalP-6.0">https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? SignalP-6.0</a></td><td>Navegador web</td><td>Predice la presencia de péptidos señal y la ubicación de sus sitios de escisión</td></tr><tr><td>TMHMM - 2.0</td><td><a href="https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? TMHMM-2.0">https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? TMHMM-2.0</a></td><td>Navegador web</td><td>Predicción de hélices transmembrana en proteínas</td></tr><tr><td>UCSC Genome Browser BLAT Search</td><td><a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat</a></td><td>Navegador web</td><td>Herramienta utilizada para encontrar regiones genómicas utilizando información de secuencia de ADN o proteínas</td></tr><tr><td>UCSC Genome Browser Gateway</td><td><a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway</a></td><td>Navegador web</td><td>Enlace directo al Navegador del genoma de la UCSC Portal del</td></tr> genoma <tr><td>de la UCSC Inicio</td><td><a href="https://genome.ucsc.edu/">https://genome.ucsc.edu/</a></td><td>Navegador web</td><td>Sitio web principal del Navegador del Genoma</td></tr><tr><td>de la UCSC Navegador del genoma de la UCSC Rastree los centros de</td> <td>datos<a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubs">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubs</a></td><td>Navegador web</td><td>Enlace directo a la base de datos Track Data Hubs/Public Hubs para buscar y cargar la Guía del usuario del navegador del genoma PhyloCSF Tracks</td></tr><tr><td>UCSC</td><td><a href="https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html">https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html</ a></td><td>Navegador web</td><td>Guía de usuario completa que detalla cómo navegar por el navegador del genoma UCSC</td></tr><tr><td>WoLF PSORT</td><<td>a href="https://wolfpsort.hgc.jp">https://wolfpsort.hgc.jp</a></td><td>Navegador web</td><td>Herramienta de predicción de localización subcelular de proteínas</td></tr></tbody></table>

un enfoque integrado para la identificación de microproteínas y el análisis de secuencias

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

La secuenciación de próxima generación (NGS) ha impulsado el campo de la genómica hacia adelante y ha producido secuencias del genoma completo para numerosas especies animales y organismos modelo. Sin embargo, a pesar de esta gran cantidad de información de secuencia, los esfuerzos integrales de anotación de genes han demostrado ser un desafío, especialmente para las proteínas pequeñas. En particular, los métodos convencionales de anotación de proteínas se diseñaron para excluir intencionalmente las proteínas putativas codificadas por marcos de lectura abiertos cortos (sORF) de menos de 300 nucleótidos de longitud para filtrar el número exponencialmente mayor de sORFs espurios no codificantes en todo el genoma. Como resultado, cientos de pequeñas proteínas funcionales llamadas microproteínas (<100 aminoácidos de longitud) se han clasificado incorrectamente como ARN no codificantes o se han pasado por alto por completo.
Aquí proporcionamos un protocolo detallado para aprovechar las herramientas bioinformáticas gratuitas y disponibles públicamente para consultar las regiones genómicas en busca de potencial de codificación de microproteínas basado en la conservación evolutiva. Específicamente, proporcionamos instrucciones paso a paso sobre cómo examinar la conservación de la secuencia y el potencial de codificación utilizando frecuencias de sustitución de codones filogenéticos (PhyloCSF) en el navegador del genoma fácil de usar de la Universidad de California en Santa Cruz (UCSC). Además, detallamos los pasos para generar de manera eficiente alineaciones de múltiples especies de secuencias de microproteínas identificadas para visualizar la conservación de la secuencia de aminoácidos y recomendamos recursos para analizar las características de las microproteínas, incluidas las estructuras de dominio predichas. Estas poderosas herramientas se pueden utilizar para ayudar a identificar secuencias supuestas de codificación de microproteínas en regiones genómicas no canónicas o para descartar la presencia de una secuencia de codificación conservada con potencial de traducción en una transcripción no codificante de interés.

Aquí usaremos la microproteína mitoregulina validada (Mtln) como ejemplo para demostrar cómo un sORF conservado generará una puntuación PhyloCSF positiva que se puede visualizar y analizar fácilmente en el UCSC Genome Browser. La mitoregulina se anotó previamente como un ARN no codificante (anteriormente ID del gen humano LINC00116 y ID del gen de ratón 1500011K16Rik). La genómica comparativa y los métodos de análisis de conservación de secuencias desempeñaron un papel crítico en su descubrimiento inici...

El protocolo descrito aquí proporciona instrucciones detalladas sobre cómo analizar las regiones genómicas de interés para el potencial de codificación de microproteínas utilizando PhyloCSF en el navegador del genoma UCSC fácil de usar. Además, se recomiendan varias herramientas y recursos para investigar más a fondo las características de secuencia de las microproteínas identificadas para obtener información sobre sus supuestas funciones.

Un enfoque integrado para la identificación de microproteínas y el análisis de secuencias

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model ...

El protocolo descrito aquí proporciona instrucciones detalladas sobre el análisis de regiones genómicas de interés para el potencial de codificación de proteínas utilizando phyloCSF en el navegador del genoma UCSC fácil de usar. PhloCSF puede identificar eficazmente marcos de lectura abiertos cortos conservados con potencial de codificación de microproteínas en regiones genómicas que actualmente están anotadas como no codificantes. Los métodos descritos aquí son fácilmente utilizados y pueden ser implementados por investigadores de todos los orígenes sin capacitación previa o experiencia en bioiformatics o genómica comparativa.Para comenzar, abra una ventana del navegador de Internet y navegue hasta el navegador del genoma de la Universidad de California en Santa Cruz o UCSC. En el encabezado Nuestras herramientas, seleccione la opción Centros de seguimiento. En la pestaña concentradores públicos, escriba phyloCSF en el cuadro de términos de búsqueda.Luego, haga clic en el botón buscar centros públicos. Conéctese a phyloCSF haciendo clic en el botón de conexión para el nombre del concentrador phyloCSF. Después de hacer clic en conectar, espere para redirigir a la página de la puerta de enlace del navegador del genoma UCSC.Para consultar una especie diferente, seleccione la especie de interés en el encabezado Examinar o seleccionar especie haciendo clic en el icono correspondiente, o escriba la especie en el cuadro de texto que dice, ingrese el nombre común de la especie o el ID de ensamblaje.Usando el menú desplegable, elija el conjunto para buscar bajo el encabezado de posición definida, luego ingrese el símbolo del gen de posición o los términos de búsqueda en el cuadro de posición o término de búsqueda y haga clic en ir para navegar a un gen de interés en el navegador del genoma. Si la búsqueda resultó en varias coincidencias, espere a ser redirigido a una página que requiere la selección de una posición de interés, luego haga clic en el gen de interés apropiado. Después de navegar al navegador del genoma UCSC, seleccione la herramienta de alineación similar a una explosión o blat debajo del encabezado de nuestras herramientas para consultar una secuencia específica de ADN o proteína.Alternativamente, coloque el cursor sobre la pestaña de herramientas y seleccione la opción blat o siga el enlace dado. Usando el menú desplegable seleccione la especie, el genoma y el ensamblaje de interés. Luego, defina el tipo de consulta, pegue la secuencia de interés en el cuadro de texto del genoma de búsqueda blat y haga clic en enviar.A continuación, haga clic en el enlace del navegador debajo del encabezado de acciones para navegar a la región genómica de interés. Escanee visualmente el área genómica de interés para obtener una puntuación positiva de las regiones phyloCSF. Utilice la función de zoom para ampliar las regiones de interés para examinar las características de la secuencia y buscar los codones de inicio y parada.Para acercar manualmente, mantenga presionada la tecla Mayús y mantenga presionado el botón del mouse mientras arrastra a lo largo de la región de interés. Alternativamente, use los botones de acercar y alejar en la parte superior de la página para navegar. Amplíe el zoom hasta que el nucleótido o la secuencia de bases sea visible.Escanee visualmente la secuencia de mareas nucleares cerca del principio y el final de las regiones filoCSF con puntuación positiva para identificar codones punitivos de inicio y parada. Coloque el cursor del mouse sobre el encabezado de la vista en la parte superior de la página y haga clic en la opción de conversión en otros genomas, luego defina el genoma de interés usando el menú desplegable debajo del nuevo encabezado del genoma. Seleccione el conjunto genómico de interés en el nuevo encabezado de conjunto y haga clic en el botón Enviar.Una vez que el explorador devuelve una lista de regiones en el nuevo ensamblado con similitud. Haga clic en el enlace de posición cromosómica para navegar a la región homóloga de interés. Siga las estrategias de navegación descritas anteriormente para analizar la secuencia.Para navegar a la página de descripción del gen, haga clic en el gen de interés en la pista del código gen en el navegador del genoma UCSC. Debajo de la secuencia y los enlaces a herramientas y bases de datos, haga clic en el enlace de la tabla que lee otras especies más rápido. Haga clic en las casillas asociadas a las especies de interés para seleccionarlas.Luego, haga clic en enviar. Copie y pegue las secuencias que aparecen en la parte inferior de la página en formato más rápido en un documento de procesamiento de textos. A continuación, abra una segunda ventana del navegador y navegue hasta la herramienta de alineación de secuencias múltiples omega clustal en el sitio web del Instituto Europeo de Bioinformática.Pegue los archivos de secuencia en el portapapeles en el cuadro del paso uno que lee secuencias en cualquier formato compatible. Desplácese hasta la parte inferior de la página y haga clic en enviar. Observe a continuación los resultados alineados para los símbolos que indican el grado de conservación de cada aminoácido.Para ver las propiedades de los aminoácidos y el color, haga clic en el enlace Mostrar colores directamente encima de las secuencias para colorear los aminoácidos de acuerdo con sus propiedades. A continuación, copie y pegue la alineación de la secuencia en un programa de procesamiento de textos o presentación de diapositivas para generar una figura o un archivo de ilustración. Para ver otros resultados de la página de resultados de omega clustal, haga clic en el árbol guía de pestañas o árbol genético filo.Finalmente, haga clic en la pestaña del visor de resultados para ver las opciones para ver la información de la secuencia utilizando jalview o para acceder a enlaces directos a mview y filogenia simple. Un análisis representativo de phyloCSF del gen de la mitoregulina indica una región de conservación de alta secuencia correspondiente a una microproteína validada. La secuencia codificante completa de la mitoregulina está contenida dentro del exón uno y puntúa muy alto en el filoCSF menos una pista.Se puede observar un codón de inicio conservado al comienzo de la región de puntuación positiva en el filoCSF menos una pista. La región de puntuación positiva en el primer exón de la mitoregulina comienza directamente sobre un codón de inicio y termina en el codón de parada. La alineación de secuencia múltiple de la microproteína mitoregulina para ocho especies diferentes se muestra aquí.El análisis del aire caliente de ARN largo no codificante mostró una puntuación negativa en todo el gen en las seis pistas, lo que indica una falta de conservación de la secuencia y apoya que el aire caliente está correctamente anotado como un ARN no codificante. El análisis PhyloCSF del gen ratón uno, ocho, uno, cero, cero, cinco, ocho, I 24 rike mostró que un marco de lectura abierto conservado abarca tres exones y la puntuación positiva de phyloCSF salta de la pista más dos en el exón uno a la pista más tres en el exón dos, y luego de vuelta a la pista más dos en el exón tres. El análisis PhyloCSF del locus de meet one gene también se utilizó de manera efectiva para identificar múltiples marcos de lectura abiertos codificantes distintos dentro de una sola molécula de ARN.Es importante tener en cuenta que, si bien una puntuación positiva de phyloCSF es altamente sugestiva de la capacidad de codificación de microproteínas, esta línea de evidencia no puede ser independiente y debe validarse experimentalmente. Una vez que se ha identificado un período de microproteína, la secuencia de aminoácidos se puede analizar en busca de dominios conservados o características de secuencia para proporcionar información sobre su función. PhyloCSF se ha utilizado eficazmente para identificar nuevas microproteínas en regiones genómicas que antes se pensaba que no eran codificantes y seguirá siendo una herramienta útil en futuros estudios de identificación de microproteínas.

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Biología

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Aquí se describe protocolos para romper las células de mamíferos por molienda en estado sólido a una temperatura criogénica, producir un extracto celular a partir del polvo de células resultante, y aislar los complejos de proteínas de interés por captura de afinidad sobre perlas paramagnéticas a escala micrométrica de anticuerpos acoplados.

Complejo de proteínas de captura por afinidad a partir de células de mamífero Cryomilled

Aquí presentamos protocolos para la purificación por afinidad de los complejos de proteínas y su separación por PAGE nativa azul, seguido por la proteína de perfiles de correlación utilizando etiqueta espectrometría de masa libre cuantitativo. Este método es útil para resolver interactomes en complejos de proteínas distintas.

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

La arquitectura de complejos de la proteína es esencial para su función. Combinando varias técnicas de espectrometría de masa probado poderoso para el estudio de su montaje. Ofrecemos protocolos de reticulación química y espectrometría de masas nativa y mostrar cómo estas técnicas complementarias ayudan a dilucidar la arquitectura de los conjuntos de multi-subunidades de proteína.

La combinación de reticulación química y espectrometría de masas de complejos de proteína intacta para el estudio de la arquitectura de multi-subunidades proteína asambleas

Proporcionamos un protocolo paso a paso para split-BioID, un ensayo de complementación de fragmentos de proteína basado en la técnica de etiquetado de proximidad BioID. Activa en la interacción de dos proteínas determinadas, permite el análisis de Proteómica de los complejos de la proteína dependiente de contexto en su entorno celular nativo. El método es simple, rentable y sólo requiere equipo normal de laboratorio.

Split-BioID: Análisis proteómico de complejos de proteínas específicos de contexto en su entorno celular nativo

Aquí presentamos un protocolo para la identificación rápida de proteínas producidas por bacterias patógenas secuenciadas genómicamente utilizando espectrometría de masas en tándem MALDI-TOF-TOF y análisis proteómico de arriba hacia abajo con software desarrollado internamente. Los iones proteicos metaestables se fragmentan debido al efecto del ácido aspártico y esta especificidad se explota para la identificación de proteínas.

Identificación de proteínas de inmunidad antibacteriana en Escherichia coli utilizando MALDI-TOF-TOF-MS/MS y análisis proteómico de arriba hacia abajo

La metaproteómica clínica ofrece información sobre el microbioma humano y sus contribuciones a la enfermedad. Aprovechamos el poder computacional de la plataforma Galaxy para desarrollar un flujo de trabajo bioinformático modular que facilita el análisis metaproteómico complejo basado en espectrometría de masas y la caracterización de diversos tipos de muestras clínicas relevantes para estudios de enfermedades.

Un flujo de trabajo de metaproteómica clínica implementado dentro de la plataforma Galaxy Bioinformatics para analizar las interacciones entre el huésped y el microbioma que subyacen a las enfermedades humanas

Aprende a identificar microproteínas mediante PhyloCSF en el navegador UCSC Genome Browser. Este protocolo computacional permite analizar regiones genómicas no codificantes sin requerir experiencia previa en bioinformática.

Un enfoque integrado para la identificación de microproteínas y el análisis de secuencias

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