Técnicas moleculares e inmunológicas en un modelo de ratón genéticamente modificado de tumor del estroma gastrointestinal

Nuestro protocolo describe la reproducción, el mantenimiento, la disección y el procesamiento de muestras del único modelo de ratón inmunocompetente, GIST, actualmente en uso. Esperamos que los futuros investigadores puedan utilizar este modelo de ratón para promover la investigación traslacional en GIST. Las terapias tradicionales en GIST implican terapia molecular dirigida con inhibidores de la tirosina cinasa.

Este modelo permite a los investigadores probar inmunoterapias en GIST. Para comenzar, esterilice todos los instrumentos, use guantes durante todo el procedimiento y mantenga un campo estéril. Prepare el área de incisión con etanol al 70%.

Usando tijeras, haga una incisión vertical de dos centímetros en la línea media y entre en la cavidad abdominal. Lisa bruscamente cualquier adherencia intraabdominal. Para extirpar el ganglio linfático mesentérico drenante, identifique el ciego y levante su mesenterio de manera superior.

Aproximadamente a mitad de camino a la base del mesenterio colónico, identifique el ganglio linfático mesentérico y diseccionarlo bruscamente. Según sea necesario, divida el tejido de los ganglios linfáticos en tercios para el aislamiento de proteínas, la histología y la suspensión de una sola célula. Coloque el tejido de los ganglios linfáticos en 20 mililitros de medio RPMI para suspensiones unicelulares y manténgalo en hielo.

El ciego es reemplazado principalmente por un GIST en los ratones Kit558. Para el aislamiento del GIST y el ciego, divida cuidadosamente la unión ileocólica de la base del tumor. Luego, divida el ciego nuevamente, dos centímetros distales a la base del tumor.

En el 50 al 60% de los ratones Kit558, la cabeza del tumor contiene una tapa de tejido cecal, que generalmente contiene líquido seroso, pero rara vez puede contener pus. Diseccionar bruscamente el tejido de la tapa lejos del tejido tumoral. Divida el tejido tumoral y el ciego en tercios para el aislamiento de proteínas, la histología y la suspensión unicelular.

Para suspensiones unicelulares, coloque el tejido tumoral o el ciego en HBSS con 2% fcS, suficiente para cubrir la muestra, y manténgase en hielo. Vierta el medio RPMI con la muestra de ganglios linfáticos sobre un filtro de 100 micrómetros. Mueva el filtro a un nuevo cónico de 50 mililitros y triture el ganglio linfático con el extremo blando de una jeringa de plástico de tres mililitros.

Filtro de lavado con 20 mililitros de medios RPMI. Centrifugar las muestras y aspirar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 20 mililitros de tampón de cuentas y verter sobre un filtro de 40 micrómetros.

Recoger el filtrado celular. Cuente las células con un hemocitómetro. Centrifugar las muestras y desechar el sobrenadante.

Luego, vuelva a suspender en el tampón de cuentas para citometría de flujo. Prepare el tampón de colagenasa como se describe en el manuscrito de texto. Coloque GIST en un plato estéril y agregue 2.5 mililitros de tampón de colagenasa.

Usando un bisturí estéril y tijeras, picar el tumor hasta que esté en fragmentos finos. Use una pipeta de gran diámetro para aspirar el tumor y la colagenasa en un tubo de 50 mililitros. Incubarlo a 37 grados centígrados durante 30 minutos a 100 rotaciones por minuto, luego apagar la reacción con dos mililitros de FBS.

Vierta la colagenasa con una muestra de GIST sobre un filtro de 100 micrómetros y triture el tumor con el extremo blando de una jeringa de plástico de tres mililitros y recójalo en un tubo de 50 mililitros. Filtro de lavado con 20 mililitros de HBSS. Centrifugar el filtrado a 450 RCF durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, luego desechar el sobrenadante.

Resuspender el pellet en 20 mililitros de tampón de cuentas y verter sobre un filtro de 40 micrómetros Recoger el filtrado y contar las células utilizando un hemocitómetro. Centrifugue y aspire el sobrenadante, luego vuelva a suspender en tampón de cuentas para citometría de flujo. Usando tijeras, divida el ciego longitudinalmente para exponer la mucosa interna.

Córtelo en secciones de 0,5 centímetros y colóquelo en un tubo de 50 mililitros con cinco mililitros de HBSS y 2% FBS. Agite vigorosamente durante 30 segundos y centrífuga a 450 RCF durante 20 segundos. Luego, deseche el sobrenadante.

Agregue de cinco a 20 mililitros de HBSS con EDTA de dos milimolares. Incubarlo a 37 grados centígrados a 100 rotaciones por minuto durante 15 minutos. Centrifugar y desechar el sobrenadante, luego volver a suspender el pellet en cinco a 20 mililitros de HBSS.

Agite la mezcla vigorosamente durante 30 segundos, luego centrífuga a 450 RCF durante 20 segundos y deseche el sobrenadante. Repita este proceso una vez más. Resuspender el pellet en cinco mililitros de tampón de colagenasa, luego incubarlo a 37 grados Celsius durante 30 minutos a 100 rotaciones por minuto.

Agitar vigorosamente cada 10 minutos y saciar la reacción con dos mililitros de FBS. Vierta la colagenasa con una muestra de ciego sobre un filtro de 100 micrómetros y triture con el extremo blando de una jeringa de plástico de tres mililitros. Lave el filtro con 20 mililitros de HBSS y recoja el filtrado.

Centrifuga y desecha el sobrenadante. Resuspender el pellet en 20 mililitros de tampón de cuentas y verter sobre un filtro de 40 micrómetros. Recolecte el filtrado y cuente las células usando un hemocitómetro.

Repita el proceso de centrifugación una vez más y vuelva a suspender el pellet en tampón de cuentas para citometría de flujo. Los ratones Kit558 tuvieron una vida útil promedio de ocho meses debido a la obstrucción intestinal progresiva. Los tumores de los ratones Kit558 expresaron marcadores canónicos de GIST, incluyendo la tirosina quinasa KIT, el canal transmembrana Dog1 y el factor de transcripción ETV1.

Los tumores se estudiaron para detectar cambios en la vía de señalización kit, como los marcadores aguas abajo ERK y AKT o el microambiente inmune, que imitaba de cerca el GIST humano. La resonancia magnética o la tomografía computarizada se utilizaron para rastrear el volumen del tumor como una medición precisa de la respuesta tumoral. La disección del tumor lejos de la unión ileocólica y lejos de la tapa cecal es importante para capturar el verdadero peso del tumor y el análisis inmunológico y molecular.

Dentro de GIST, este modelo ha permitido la investigación del microambiente tumoral, así como de las inmunoterapias.