Name: Aislamiento de preadipocitos de embriones de pollos de engorde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Aprenda a aislar preadipocitos de embriones de pollos de engorde con alto rendimiento y viabilidad. Este método permite estudiar el desarrollo adiposo temprano y la diferenciación celular en modelos de avicultura y humanos.

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Los autores agradecen a UT AgResearch y al Departamento de Ciencia Animal por apoyar y optimizar este protocolo. Este trabajo fue financiado por una subvención del USDA.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque varios protocolos bien descritos han reportado el aislamiento de preadipocitos 14,15,16,17, se ha optimizado el aislamiento para preadipocitos embrionarios, que pueden usarse para análisis funcionales del crecimiento y desarrollo de grasa en la vida temprana en pollitos de engorde. Este protocolo produce progenitores de adipocitos embrionarios de alta viabilidad con alto potencial de dif...

La obesidad es una amenaza para la salud mundial tanto para adultos como para niños. Los niños con sobrepeso u obesidad tienen aproximadamente cinco veces más probabilidades de ser obesos como adultos, lo que los coloca en un riesgo significativamente mayor de enfermedad cardiovascular, diabetes y muchas otras comorbilidades. Alrededor del 13.4% de los niños estadounidenses de 2 a 5 años de edad tienen obesidad1, lo que ilustra que la tendencia a acumular exceso de grasa corporal puede ponerse en marcha muy temprano en la vida. Por razones muy diferentes, la acumulación de exceso de tejido adiposo es una preocupación para los pollos de engorde (tipo carne). Los pollos de engorde modernos son increíblemente eficientes, pero aún acumulan más lípidos de lo fisiológicamente necesario 2,3. Esta tendencia comienza poco después de la eclosión y efectivamente desperdicia el alimento, el componente de producción más caro, al asignarlo lejos del crecimiento muscular. Por lo tanto, tanto para los niños como para los pollos de engorde, aunque por razones muy diferentes, existe la necesidad de comprender los factores que influyen en el desarrollo del tejido adiposo e identificar formas de limitar la expansión adiposa temprano en la vida.
Los adipocitos se forman a partir de preadipocitos, células madre derivadas del tejido adiposo que se someten a diferenciación para desarrollar células grasas maduras que almacenan lípidos. En consecuencia, los preadipocitos in vitro son un modelo experimental valioso para los estudios de obesidad. Estas células, aisladas de la fracción vascular estromal de los depósitos adiposos, pueden proporcionar una comprensión fundamental de las vías moleculares que controlan la diferenciación y el metabolismo de los adipocitos 4,5. Los embriones de pollitos son un modelo experimental favorable en los estudios de desarrollo porque cultivar óvulos en el horario deseado facilita la manipulación experimental, ya que permite obtener embriones sin el sacrificio de la madre para observar una serie de etapas de desarrollo de los embriones. Además, no se requieren procedimientos quirúrgicos complicados y largos períodos de tiempo para obtener embriones en relación con modelos animales más grandes. Por lo tanto, el embrión de pollito presenta una oportunidad para obtener preadipocitos desde las primeras etapas del desarrollo del tejido adiposo. El tejido adiposo subcutáneo se hace visible en el pollito alrededor del día embrionario 12 (E12) como un depósito claramente definido ubicado alrededor del muslo. Este depósito está enriquecido en preadipocitos altamente proliferativos que se diferencian activamente bajo señales de desarrollo para formar adipocitos maduros 6,7. El proceso de diferenciación adipogénica es comparable entre pollos y humanos. Por lo tanto, los preadipocitos aislados de embriones de pollo se pueden utilizar como un modelo de doble propósito para estudios relevantes para humanos y aves de corral. Sin embargo, el rendimiento de los preadipocitos disminuye con el envejecimiento a medida que las células crecen en adipocitos maduros5.
El presente protocolo optimiza el aislamiento de los preadipocitos del tejido adiposo durante la etapa (E16-E18) en la que la diferenciación adipogénica y la hipertrofia de los adipocitos están en su punto máximo en embriones de pollos de engorde8. Este procedimiento puede evaluar los efectos de los factores a los que el embrión en desarrollo está expuesto in ovo, como la dieta de la gallina, sobre el desarrollo de los adipocitos y el potencial adipogénico ex vivo. También puede probar el impacto de varias manipulaciones (por ejemplo, hipoxia, adiciones de nutrientes, agonistas farmacológicos y antagonistas) en la adipogénesis o en los diversos 'omes( por ejemplo, transcriptoma, metaboloma, metiloma) de los progenitores de adipocitos. Como representación de la etapa más temprana de la formación adiposa, las células obtenidas utilizando este protocolo son modelos valiosos para estudios relevantes para aves de corral y humanos.

<table><tbody><tr><td>Pipeta</td><td>de 1 mL Eppendorf</td><td>Z683825</td><td>Pipeta monocanal, 100 - 1000 y micro; L</td></tr><tr><td>1 mL Punta de pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-402</td><td></td></tr><tr><td>100% Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A426P4</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Matraz</td><td>Pyrex</td><td>4980-25</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehído</td><td>Fisher Scientific</td><td>F75P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>Placa de</td></tr><tr><td>ensayo de 96 pocillos</td> tratada con cultivo de tejidos <td>Costar</td><td>3632</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos, fondo negro</td><td>Costar</td><td>3603</td><td>AdipoRed</td></tr><tr><td>Lonza</td><td>PT-7009</td><td></td><td>Adipotricina</td></tr><tr><td>B</td><td>Gibco</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>Limpiaparabrisas de sobremesa (Kimtechwiper)</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Arriba & </td><td>Subir NDC 1167300334</td><td>20% Solución de trabajo</td></tr><tr><td>Contador de celdas</td><td>Corning</td><td>6749</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de celdas, 40 &micro; m</td><td>SPL</td><td>93040</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Suero de pollo</td><td>Gibco</td><td>16110082</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos, 15 mL</td><td>VWR</td><td>10025-690</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos, 50 mL</td><td>Pinza curva Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Nunc</td><td>343958</td><td></td></tr>, <tr><td>100 mm</td><td>Tijeras quirúrgicas</td> curvas <td>Roboz Surgical RS-5137</td><td></td></tr>, <tr><td>115 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6839</td><td></td></tr><tr><td>Millipore</td> de<td>agua destilada</td><td>SYNSV0000</td><td>Diseñado según sea necesario</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td>70% Solución de trabajo</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>EVOS</td><td>M7000</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas fluorescentes</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1</td><td></td></tr><tr><td>Foil</td><td>Reynolds Reynolds Wrap Papel de aluminio de alta resistencia, 125 SQ. FT.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de congelación</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Millipore</td><td>4055</td><td>Solución de trabajo al 2%</td></tr><tr><td>Hematocitómetro (cámara de recuento)</td><td>Corning</td><td>480200</td><td>0,1 mm de profundidad</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Fisher Scientific</td><td>6845</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de instrumentos</td><td>VWR</td><td>B1205</td><td></td></tr><tr><td>Ácido linoleico-Oleico ácido-albúmina</td><td>Sigma</td><td>L9655</td><td>1x solución de trabajo</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Evos</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661070</td><td>Pipetas de 12 canales, 30 - 300 &micro; L</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S-7907</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Aceite Rojo O</td><td>Sigma</td><td>O-0625</td><td></td></tr><tr><td>Agitador Orbital</td><td>IKA</td><td>KS130BS1</td><td></td></tr><tr><td>Toalla de papel</td><td>Tork</td><td>RK8002</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm M</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Steptomicina (P/S)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>1x solución de trabajo</td></tr><tr><td>Placas de Petri, 100 mm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri, 60 mm</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de placas</td><td>Tampón</td> de lisis VWR <td>200</td><td></td></tr><tr><td>RBC</td><td>Roche</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo Reservior</td><td>VWR</td><td>89094-680</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados pequeño, 100 mL</td><td>Pyrex</td><td>1000-100</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas de espectrofotómetro</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1</td><td></td></tr><tr><td>Gasa estéril</td><td>McKesson Pinzas rectas McKesson</td><td>762703</td><td></td></tr>, <tr><td>120 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-4960</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras rectas, 140 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6762</td><td></td></tr><tr><td>T-25</td><td>Frasco Corning</td><td>430639</td><td>Incubadora de cultivo de tejidos tratada con cultivo de</td></tr><tr><td>tejidos</td><td>Thermo Scientific</td><td></td> 50144906 <td></td></tr><tr><td>Colador de tejidos, 250 &micro; m</td><td>Pierce</td><td>87791</td><td></td></tr><tr><td>Tinte Azul</td><td>Trypan Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td>0.1% Pinzas de solución de trabajo</td></tr><tr><td>, 110 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5035</td><td></td></tr><tr><td>Tipo 1 Colágeno</td><td>Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-10</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro Whatman Grado 1 Whatman</td><td></td><td>1001-110</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de preadipocitos de embriones de pollos de engorde

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

Los preadipocitos primarios son un valioso sistema experimental para comprender las vías moleculares que controlan la diferenciación y el metabolismo de los adipocitos. Los embriones de pollo brindan la oportunidad de aislar los preadipocitos desde la etapa más temprana del desarrollo adiposo. Esta célula primaria se puede utilizar para identificar factores que influyen en la proliferación de preadipocitos y la diferenciación adipogénica, lo que los convierte en un modelo valioso para estudios relacionados con la obesidad infantil y el control del exceso de deposición de grasa en aves de corral. El rápido crecimiento del tejido adiposo postnatal desperdicia efectivamente el alimento al asignarlo lejos del crecimiento muscular en pollos de engorde. Por lo tanto, los métodos para comprender las primeras etapas del desarrollo del tejido adiposo pueden proporcionar pistas para regular esta tendencia e identificar formas de limitar la expansión adiposa temprano en la vida. El presente estudio fue diseñado para desarrollar un método eficiente para el aislamiento, el cultivo primario y la diferenciación adipogénica de preadipocitos aislados del tejido adiposo en desarrollo de embriones comerciales de pollos de engorde (tipo carne). El procedimiento se ha optimizado para producir células con alta viabilidad (~ 98%) y una mayor capacidad para diferenciarse en adipocitos maduros. Este método simple de aislamiento, cultivo y diferenciación de preadipocitos embrionarios apoya los análisis funcionales del crecimiento y desarrollo de la grasa en los primeros años de vida.

Los preadipocitos primarios son morfológicamente similares a los fibroblastos, con formas irregulares en forma de estrella y un núcleo central (Figura 2A-C). Las células se adhieren fácilmente al plástico de cultivo de tejidos y comienzan a proliferar poco después de la unión. Se diferencian rápidamente y acumulan gotas lipídicas (Figura 3D) cuando se les proporcionan ácidos grasos en los medios. La viabilidad (98%, basada en la...

El presente protocolo describe un método simple para aislar preadipocitos del tejido adiposo en embriones de pollos de engorde. Este método permite el aislamiento con alto rendimiento, cultivo primario y diferenciación adipogénica de preadipocitos. La tinción de aceite Rojo O y la tinción de lípidos /ADN midieron la capacidad adipogénica de las células aisladas inducidas con medios de diferenciación.

Aislamiento de preadipocitos de embriones de pollos de engorde

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...

Los preadipocitos primarios son un valioso sistema experimental para comprender las vías moleculares que controlan el metabolismo de los adipocitos. Los embriones de pollo brindan la oportunidad de aislar los preadipocitos desde la etapa más temprana del desarrollo de los adipocitos. Este método se ha optimizado para producir células con alta viabilidad y mayor capacidad de diferenciación en adipocitos maduros, que se pueden utilizar para el análisis funcional del crecimiento y desarrollo de grasa en embriones de crecimiento y desarrollo de grasa en la vida temprana en pollitos.El proceso de diferenciación adipogénica es altamente comparable entre pollos y humanos. Por lo tanto, los preadipocitos aislados se pueden utilizar como un modelo de doble propuesta para estudios relevantes para humanos y aves de corral. Para comenzar, hisifique el cuerpo del embrión con 70% de etanol.Luego, para evitar interferencias durante la filtración en pasos posteriores después de la digestión, frote suavemente la superficie de la piel con una gasa estéril para eliminar las plumas. Luego corte la piel entre las piernas y la región abdominal para revelar el par de depósitos adiposos femorales. Use fórceps curvos con una mano para sostener la piel alrededor de la pierna y retire suavemente la grasa subcutánea femoral.con la otra mano. Más tarde, use pinzas curvas para alejar suavemente el depósito de la pierna. Transfiera los tejidos a un tubo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de medios de recolección y repita la disección para el otro lado de la almohadilla de grasa.Ahora, transfiera las almohadillas de grasa recolectadas a una placa de Petri de 60 milímetros que contenga solución de esterilización y enjuague brevemente girando la placa varias veces. Luego enjuague la solución de esterilización transfiriendo las almohadillas de grasa a una placa de Petri de 60 milímetros que contenga PBS. Revuelva suavemente el plato y una vez más, lávese con PBS.Para la digestión de los tejidos adiposos, transfiéralos a un tubo de 15 milímetros que contenga una solución enzimática precaliente. Luego sumerja un par de tijeras largas y rectas en el tubo y finalmente pica los tejidos adiposos en la solución en pedazos lo más pequeños posible. Transfiera el tejido picado y la solución enzimática a un matraz en autoclave de 25 mililitros.Envuelva el matraz con una película de parafina y colóquelo en una incubadora de agitadores orbitales a 37 grados centígrados para la digestión. Después de la digestión, pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Luego, elimine cualquier trozo de tejido no digerido y escombros filtrando a través de un colador de tejido de 250 micrómetros en un tubo de 15 mililitros mediante pipeteo.Ahora, retire las células adheridas al matraz enjuagando el matraz con cuatro mililitros de medios de crecimiento y filtre la suspensión celular en el mismo tubo de 15 mililitros. A continuación, enjuague el colador pipeteando los medios de crecimiento nuevamente para eliminar las células atrapadas en el filtro. Centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente para granular la fracción celular y aspirar el sobrenadante sin perturbar el gránulo celular.Resuspeda suavemente el pellet en un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos, mezcle bien mediante pipeteo e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego diluya las células agregando cinco mililitros de medios de crecimiento al tubo que contiene las células y mézclelas suavemente mediante pipeteo. Ahora, pipetee las células en un colador de células de 40 micrómetros y filtre en un nuevo tubo de 50 mililitros.Luego enjuague el colador con cinco mililitros adicionales de medios de crecimiento y gule las células centrifugando a 300 veces G durante siete minutos a temperatura ambiente. Aspirar con cuidado el sobrenadante. Resuspend el pellet celular restante en un mililitro de medios de crecimiento mediante pipeteo Para determinar la densidad celular y la viabilidad, mezcle 10 microlitros de cada muestra en azul tripano mediante pipeteo.Cargue 10 microlitros de la mezcla en el hemocitómetro y cuente las células. El análisis de los preadipocitos después de 24, 48 y 72 horas mostró una morfología y un número celular normales. La inducción adipogénica de preadipocitos mostró una rápida diferenciación y acumulación de gotas lipídicas.El manejo agresivo de los preadipocitos durante el aislamiento resultó en daño celular y bajo número de células. La contaminación microbiana se puede observar a pesar de tomar medidas preventivas. La tinción lipídica con aceite rojo O indicó que los preadipocitos comienzan a desarrollar rápidamente gotas lipídicas bajo inducción adipogénica y la acumulación progresa con el tiempo como se observa en 24, 48 y 72 horas.La acumulación de lípidos en relación con el número de células se cuantificó utilizando tinciones de lípidos y ADN. Tanto la acumulación de lípidos como la proliferación celular aumentaron con el tiempo. Se puede observar un bajo número de células o células dañadas cuando las fracciones de tejido se digieren demasiado tiempo.Por ello, se recomienda que no se supere una hora y media de digestión. Los preadipocitos aislados se pueden utilizar para estudios de expresión génica. Se puede obtener suficiente ARN para su uso en la síntesis de ADNc y la qPCR o RNAseq de seguimiento.

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Investigación

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Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este artículo se proporciona un método para aislar y cultivar la codorniz o pollo...

Aislamiento y cultivo de células embrionarias progenitoras aviar valvular

Este video muestra el aislamiento de la membrana corioalantoidea portadora de tumores del embrión de pollo. El CAM cosechado se puede utilizar para otras aplicaciones posteriores.

Cosecha de membrana corioalantoidea de pollo: un método para aislar la membrana corioalantoidea portadora de injerto tumoral del huevo de gallina

Modelos de cultivo celular proporcionan un control detallado de las condiciones ambientales y por lo tanto constituyen una plataforma poderosa para dilucidar numerosos aspectos de la biología de las células neuronales. Se describe un método rápido, barato y fiable para aislar, disociar, y la cultura neuronas sensoriales de los embriones de pollo. También se proporcionan detalles de la preparación de sustratos y inmunocitoquímica.

Aislamiento y cultivo de neuronas sensoriales disociadas De embriones de pollo

Aquí, describimos una inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y el protocolo de preparación de biblioteca de ChIP-seq para generar perfiles de epigenómica global de muestras embrionarias de pollo baja abundancia.

Cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia

Este artículo proporciona un método para aislar puros tejidos embrionarios de embriones de codorniz y pollo que pueden combinarse para formar ex vivo quimérica órganos.

Aislamiento de los tejidos embrionarios y formación de órganos quiméricas pollo codorniz utilizando el ejemplo de timo

Este informe describe un protocolo para el aislamiento simultáneo de preadipocytes marrones y blancos primarios de ratones recién nacidos. Las células aisladas se pueden cultivar en cultivo e inducir a diferenciarse en adipocitos blancos y marrones completamente maduros. El método permite la caracterización genética, molecular y funcional de las células de grasa primarias en cultivo.

Aislamiento Y Diferenciación De Preadipocitos Blancos Y Marrones Primarios De Ratones Recién Nacidos

Este es un método eficaz para detectar supresores o impulsores de metástasis del cáncer. Las células, transducidas con una biblioteca de expresión, se inyectan en la vasculatura de la membrana corioalantoica del pollo para formar colonias metastásicas. Las colonias que han disminuido o aumentado la invasividad se extirpan, se expanden, se reinyectan para confirmar su fenotipo y, finalmente, se analizan mediante secuenciación de alto rendimiento.

Descubrimiento de reguladores metastásicos utilizando un modelo de membrana corioalantoica intravital de pollitos rápido y cuantitativo

Este protocolo describe el aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y lograr la diferenciación de los adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de la colagenasa reduce la variación experimental y aumenta la reproducibilidad.

Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

Aquí, describimos un protocolo para separar la yema, las células de la granulosa y las células de teca en folículos preovulatorios aviares. Este manejo de precisión permite investigaciones críticas sobre el papel de estas capas en la función reproductiva, lo que ayuda a comprender el desarrollo folicular, la regulación hormonal y la investigación de enfermedades para mejorar el rendimiento agrícola y los conocimientos biomédicos.

Separación de las capas de folículo granuloso preovulatorio aviar y células de teca para aplicaciones posteriores

Ver y acceder al embrión de pollo durante el desarrollo puede ser un desafío. Hemos desarrollado un método ex ovo que es simple, rentable y se puede usar fácilmente en un aula o en un entorno de investigación. Este método proporciona acceso al embrión en etapas tardías del desarrollo embrionario (HH 40).

Optimizado Ex-ovo El cultivo de embriones del polluelo a etapas avanzadas de desarrollo

Aprenda a aislar preadipocitos de embriones de pollos de engorde con alto rendimiento y viabilidad. Este método permite estudiar el desarrollo adiposo temprano y la diferenciación celular en modelos de avicultura y humanos.

Aislamiento de preadipocitos de embriones de pollos de engorde

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