Aislamiento de preadipocitos de embriones de pollos de engorde
August 4th, 2022
El presente protocolo describe un método simple para aislar preadipocitos del tejido adiposo en embriones de pollos de engorde. Este método permite el aislamiento con alto rendimiento, cultivo primario y diferenciación adipogénica de preadipocitos. La tinción de aceite Rojo O y la tinción de lípidos /ADN midieron la capacidad adipogénica de las células aisladas inducidas con medios de diferenciación.
Los preadipocitos primarios son un valioso sistema experimental para comprender las vías moleculares que controlan el metabolismo de los adipocitos. Los embriones de pollo brindan la oportunidad de aislar los preadipocitos desde la etapa más temprana del desarrollo de los adipocitos. Este método se ha optimizado para producir células con alta viabilidad y mayor capacidad de diferenciación en adipocitos maduros, que se pueden utilizar para el análisis funcional del crecimiento y desarrollo de grasa en embriones de crecimiento y desarrollo de grasa en la vida temprana en pollitos.
El proceso de diferenciación adipogénica es altamente comparable entre pollos y humanos. Por lo tanto, los preadipocitos aislados se pueden utilizar como un modelo de doble propuesta para estudios relevantes para humanos y aves de corral. Para comenzar, hisifique el cuerpo del embrión con 70% de etanol.
Luego, para evitar interferencias durante la filtración en pasos posteriores después de la digestión, frote suavemente la superficie de la piel con una gasa estéril para eliminar las plumas. Luego corte la piel entre las piernas y la región abdominal para revelar el par de depósitos adiposos femorales. Use fórceps curvos con una mano para sostener la piel alrededor de la pierna y retire suavemente la grasa subcutánea femoral.
con la otra mano. Más tarde, use pinzas curvas para alejar suavemente el depósito de la pierna. Transfiera los tejidos a un tubo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de medios de recolección y repita la disección para el otro lado de la almohadilla de grasa.
Ahora, transfiera las almohadillas de grasa recolectadas a una placa de Petri de 60 milímetros que contenga solución de esterilización y enjuague brevemente girando la placa varias veces. Luego enjuague la solución de esterilización transfiriendo las almohadillas de grasa a una placa de Petri de 60 milímetros que contenga PBS. Revuelva suavemente el plato y una vez más, lávese con PBS.
Para la digestión de los tejidos adiposos, transfiéralos a un tubo de 15 milímetros que contenga una solución enzimática precaliente. Luego sumerja un par de tijeras largas y rectas en el tubo y finalmente pica los tejidos adiposos en la solución en pedazos lo más pequeños posible. Transfiera el tejido picado y la solución enzimática a un matraz en autoclave de 25 mililitros.
Envuelva el matraz con una película de parafina y colóquelo en una incubadora de agitadores orbitales a 37 grados centígrados para la digestión. Después de la digestión, pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Luego, elimine cualquier trozo de tejido no digerido y escombros filtrando a través de un colador de tejido de 250 micrómetros en un tubo de 15 mililitros mediante pipeteo.
Ahora, retire las células adheridas al matraz enjuagando el matraz con cuatro mililitros de medios de crecimiento y filtre la suspensión celular en el mismo tubo de 15 mililitros. A continuación, enjuague el colador pipeteando los medios de crecimiento nuevamente para eliminar las células atrapadas en el filtro. Centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente para granular la fracción celular y aspirar el sobrenadante sin perturbar el gránulo celular.
Resuspeda suavemente el pellet en un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos, mezcle bien mediante pipeteo e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego diluya las células agregando cinco mililitros de medios de crecimiento al tubo que contiene las células y mézclelas suavemente mediante pipeteo. Ahora, pipetee las células en un colador de células de 40 micrómetros y filtre en un nuevo tubo de 50 mililitros.
Luego enjuague el colador con cinco mililitros adicionales de medios de crecimiento y gule las células centrifugando a 300 veces G durante siete minutos a temperatura ambiente. Aspirar con cuidado el sobrenadante. Resuspend el pellet celular restante en un mililitro de medios de crecimiento mediante pipeteo Para determinar la densidad celular y la viabilidad, mezcle 10 microlitros de cada muestra en azul tripano mediante pipeteo.
Cargue 10 microlitros de la mezcla en el hemocitómetro y cuente las células. El análisis de los preadipocitos después de 24, 48 y 72 horas mostró una morfología y un número celular normales. La inducción adipogénica de preadipocitos mostró una rápida diferenciación y acumulación de gotas lipídicas.
El manejo agresivo de los preadipocitos durante el aislamiento resultó en daño celular y bajo número de células. La contaminación microbiana se puede observar a pesar de tomar medidas preventivas. La tinción lipídica con aceite rojo O indicó que los preadipocitos comienzan a desarrollar rápidamente gotas lipídicas bajo inducción adipogénica y la acumulación progresa con el tiempo como se observa en 24, 48 y 72 horas.
La acumulación de lípidos en relación con el número de células se cuantificó utilizando tinciones de lípidos y ADN. Tanto la acumulación de lípidos como la proliferación celular aumentaron con el tiempo. Se puede observar un bajo número de células o células dañadas cuando las fracciones de tejido se digieren demasiado tiempo.
Por ello, se recomienda que no se supere una hora y media de digestión. Los preadipocitos aislados se pueden utilizar para estudios de expresión génica. Se puede obtener suficiente ARN para su uso en la síntesis de ADNc y la qPCR o RNAseq de seguimiento.
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Visión general
Este protocolo describe un método para aislar preadipocitos del tejido adiposo del embrión de pollo de engorde, facilitando un aislamiento de alto rendimiento, cultivo primario y diferenciación adipogénica. El potencial adipogénico de las células aisladas se evalúa mediante tinción Oil Red O y tinción de lípidos/ADN.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Biología del desarrollo
Antecedentes
- Los preadipocitos son cruciales para estudiar el metabolismo de los adipocitos.
- Los embriones de pollo permiten el aislamiento de preadipocitos en etapas tempranas del desarrollo.
- El proceso de diferenciación en pollos es comparable al de los humanos.
- Los preadipocitos aislados pueden servir como modelo tanto para estudios humanos como avícolas.
Propósito del estudio
- Aislar preadipocitos con alta viabilidad y capacidad de diferenciación.
- Analizar el crecimiento y desarrollo de la grasa en etapas tempranas de la vida en los pollitos.
- Proporcionar un modelo de doble propósito para estudios relevantes.
Métodos utilizados
- Aislamiento de preadipocitos de embriones de pollo de engorde.
- Uso de medio de diferenciación para inducir diferenciación adipogénica.
- Evaluación de la capacidad adipogénica mediante tinción Oil Red O.
- Medición del contenido de lípidos y ADN en las células aisladas.
Principales resultados
- Se logró un alto rendimiento de preadipocitos viables.
- Las células aisladas demostraron una diferenciación adipogénica significativa.
- Los resultados indican el potencial para el análisis funcional del desarrollo de la grasa.
- La metodología es aplicable tanto para estudios avícolas como humanos.
Conclusiones
- El método descrito es efectivo para aislar y diferenciar preadipocitos.
- Los preadipocitos aislados pueden ser utilizados para diversos estudios biológicos.
- Esta investigación contribuye a la comprensión del desarrollo de los adipocitos tanto en pollos como en humanos.
