Name: Purificación y control de calidad de complejos de septina recombinante para la reconstitución libre de células (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Aprende a purificar complejos de septina de alta calidad mediante cromatografía de afinidad para estudiar su función en la división celular. Este protocolo simplificado mejora la estabilidad y pureza de las proteínas.

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Agradecemos a Cecilia de Agrela Pinto, Tomás de Garay y Katharina Häußermann por su ayuda con los experimentos de fotometría de masas (iSCAT); Arjen Jakobi y Wiel Evers por su ayuda con TEM; Lucia Baldauf por su asistencia con TIRF; Pascal Verdier-Pinard por sus consejos sobre la electroforesis nativa; Agata Szuba y Marjolein Vinkenoog por su ayuda en la creación de los esfuerzos de purificación de septina de Drosophila, y el Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Institut Curie, miembro de la Infraestructura Nacional de Investigación de Francia-BioImaging (ANR10-INBS-04). Esta investigación recibió financiación de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO/OCW) a través de la subvención de gravitación 'BaSyC-Building a Synthetic Cell' (024.003.019) y de la Agence Nationale pour la Recherche (ANR grants ANR-17-CE13-0014: "SEPTIMORF"; ANR-13-JSV8-0002-01: "SEPTIME"; y ANR-20-CE11-0014-01: "SEPTSCORT").

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos o financieros.

El método descrito aquí permite la purificación robusta y el control de calidad de heterooligómeros de septina preformados. Algunas de las cuestiones clave a considerar para la correcta aplicación del método son las siguientes. Durante los pasos de elución en las separaciones cromatográficas, es importante utilizar el caudal recomendado (o inferior) para minimizar la dilución de los complejos de septina. Además, para maximizar la recuperación de proteínas durante el paso final de concentración, la columna del concentrador está orientada de tal manera que la solución no se empuja contra el filtro (cuando solo hay un filtro en un lado). Si la solución va directamente al filtro, la proteína se adhiere mucho más a él, disminuyendo sustancialmente el rendimiento final. También es importante considerar que el paso de concentración no siempre es necesario. La selección de fracciones solo de un rango estrecho alrededor del pico en el cromatograma generalmente da una concentración de stock suficientemente alta (>3,000 nM) para muchas aplicaciones de reconstitución (que generalmente operan entre 10-300 nM). Finalmente, para el control de calidad de la funcionalidad de los complejos de septina por microscopía de fluorescencia, es importante pasivar correctamente la superficie de los portaobjetos de microscopía, ya que los complejos de septina se adhieren ávidamente al vidrio. La pasivación de los portaobjetos de vidrio se puede realizar mediante funcionalización PLL-PEG o mediante la formación de bicapas lipídicas neutras (100% DOPC) soportadas11,32.
En comparación con el protocolo de purificación original descrito por primera vez en Iv et al.10, hay un cambio en las composiciones de los tampones (Tabla 2). La concentración de MgCl 2 se ha reducido de 5 mM a2 mM, y la concentración y el pH de Tris-HCl se han reducido de 50 mM a 20 mM y de 8,0 a 7,4, respectivamente. Estos cambios se realizaron para hacer compatibles las condiciones de amortiguación con los estudios de las interacciones de las septinas humanas con bicapas lipídicas, filamentos de actina y microtúbulos10,11,32. Esto se debe a que los autores formaron bicapas lipídicas soportadas y actina polimerizada en el F-buffer, cuya composición es idéntica a la de darkSPB, aparte de la presencia de ATP en el F-buffer. El cambio de tampón no produjo ningún cambio en la calidad o vida útil de las septinas purificadas en comparación con los tampones originales.
Este método de purificación todavía tiene varias limitaciones. En primer lugar, los diferentes intentos de purificación pueden variar en rendimiento (0,5-1 ml de complejos de septina de 2-5 μM) y calidad funcional, como lo comprueba la capacidad de formación del haz de los complejos de septina purificados. Es por eso que es muy importante realizar consistentemente los controles de calidad descritos en este documento. Controlar muy bien los tiempos de expresión y la densidad óptica del cultivo bacteriano puede ayudar a mitigar la diferencia en el rendimiento. En segundo lugar, esta tubería de purificación no puede distinguir entre trímeros y hexámeros o entre tetrámeros y octámeros (Figura 1B). Sin embargo, los experimentos de control de calidad se pueden utilizar para demostrar que la mayoría de los complejos de septina están en su forma de oligómero largo. En caso de que se requiera una distribución de tamaño de oligómero aún más estrecha, se puede insertar cromatografía de exclusión de tamaño entre el paso 1.6. y paso 1.7. del protocolo de purificación. Este paso opcional, sin embargo, disminuye drásticamente el rendimiento, y no se recomienda a menos que sea estrictamente necesario. Una última limitación, más fundamental, proviene del uso de E. coli como sistema de expresión para complejos de septina recombinantes. Naturalmente, este sistema no permite modificaciones postraduccionales (PTM), que han sido reportadas en células animales, como fosforilación, acetilación y sumoilación 6,51,52,53. Estas modificaciones postraduccionales podrían agregarse implementando una estrategia de purificación similar en células de insectos o humanas. Además, este documento solo ha discutido la reconstitución de septinas por sí mismas, pero los estudios en células indican que las proteínas reguladoras como las proteínas de la familia Borg 54,55 y la anillina 24,25,56 pueden tener efectos sustanciales pero poco conocidos sobre el ensamblaje y las funciones de las septinas y, por lo tanto, son importantes para incorporarlas eventualmente in vitro. Estudios. Los protocolos para la purificación de las proteínas Borg y la anillina han sido reportados54,57.
El protocolo de purificación de septina reportado aquí ofrece una forma estandarizada de purificar septinas en su forma de oligómero con la estequiometría de subunidades correcta, ofreciendo un avance importante sobre muchos estudios in vitro anteriores basados en subunidades de septina individuales. A pesar de que algunas septinas en contextos específicos pueden actuar como una sola subunidad2, el cuerpo actual de literatura sugiere fuertemente que, en las células animales, las septinas funcionan principalmente en complejos 9,58. Por lo tanto, el uso de heterooligómeros preformados, como los descritos en este trabajo y otros 10,11,18,32,35,36,37, es de gran importancia para estudiar las propiedades estructurales y biofísicas de las septinas vía in vitro. reconstitución para diseccionar sus funciones en la célula. Además, las septinas son proteínas autoensamblables con muchos socios de interacción, incluyendo la membrana y el citoesqueleto, lo que las hace de gran interés para la biología sintética ascendente 59,60,61 y estudios de cambios inducidos por proteínas en las propiedades biofísicas de la membrana como la curvatura42,62,63.

El citoesqueleto se ha descrito clásicamente como un sistema de tres componentes que consiste en filamentos de actina, microtúbulos y filamentos intermedios 1, pero recientemente, las septinas han sido reconocidas como un cuarto componente del citoesqueleto1. Las septinas son una familia de proteínas de unión a GTP que se conservan en eucariotas2. Las septinas están involucradas en muchas funciones celulares como la división celular3, la adhesión célula-célula4, la motilidad celular5, la morfogénesis6, la infección celular7 y el establecimiento y mantenimiento de la polaridad celular8. A pesar de sus importantes funciones, la forma en que las septinas están involucradas en tales procesos es poco conocida.
La familia de proteínas de la septina se subdivide en varios subgrupos (cuatro o siete, dependiendo de la clasificación) basados en la similitud de la secuencia de proteínas2. Los miembros de diferentes subfamilias pueden formar complejos heterooligoméricos palindrómicos, que son los bloques de construcción de filamentos y que, a su vez, se ensamblan en estructuras de orden superior como haces, anillos y mallas 1,9,10,11,12. La complejidad molecular adicional surge de la presencia de diferentes variantes de empalme, un ejemplo es el SEPT9 humano, donde hay evidencia de funciones específicas de diferentes variantes de empalme13,14,15. Además, la longitud de los heterooligómeros depende de la especie y el tipo de célula. Por ejemplo, las septinas de Caenorhabditis elegans forman tetrámeros 16, las septinas de Drosophila melanogaster forman hexámeros 17 (Figura 1A), las septinas de Saccharomyces cerevisiae forman octameros 18 y las septinas humanas forman hexámeros y octámeros19 (Figura 1A). La capacidad de las isoformas de septina, las variantes de empalme y las septinas modificadas postraduccionalmente de la misma subfamilia para sustituirse entre sí en el complejo y la (co)existencia de heterooligómeros de diferentes tamaños han dificultado la delineación de las funciones celulares de diferentes complejos heterooligoméricos12.
Otra capacidad interesante de las septinas es su capacidad para interactuar con muchos socios de unión en la célula. Las septinas se unen a la membrana plasmática y a los orgánulos membranosos durante la interfase y la división celular20,21,22. En las células en división, las septinas cooperan con la anillina 23,24,25 y la actina y la miosina durante la citocinesis 26,27. En las últimas etapas de la citocinesis, las septinas parecen regular los complejos de clasificación endosomal requeridos para el sistema de transporte (ESCRT) para la abscisión del cuerpo medio28. Además, también hay evidencia de septina localizada en la corteza de actina y fibras de estrés de actina de las células en las células de interfase 29,30,31. En tipos celulares específicos, las septinas también se unen y regulan el citoesqueleto de microtúbulos32,33.
Todas estas características hacen que las septinas sean un sistema proteico muy interesante para estudiar, pero también desafiante. La combinación del gran número de subunidades de septina (13 genes en humanos sin contar las variantes de empalme2) con el potencial de las subunidades de septina de la misma subfamilia para sustituirse entre sí y formar heterooligómeros de diferentes tamaños hace que sea difícil sacar una conclusión sobre la función celular de una septina específica por manipulación genética. Además, las múltiples interacciones de las septinas hacen que interpretar los efectos de herramientas de investigación comunes, como los medicamentos34 dirigidos a los componentes citoesqueléticos o de membrana, sea una tarea difícil.
Una forma de superar esta situación es complementar la investigación en células con la reconstitución in vitro (libre de células) de septinas. La reconstitución in vitro permite el aislamiento de un solo tipo de heterooligómeros de septina con una composición de subunidad específica y longitud 18,35,36,37. Este complejo puede ser estudiado en un ambiente controlado, ya sea solo para descubrir las propiedades estructurales y fisicoquímicas básicas de las septinas 38,39,40, o en combinación con socios deseados como biomembranas modelo 11,41,42, filamentos de actina 10,27 o microtúbulos 32,36 para descifrar la naturaleza de sus Interacciones.
Por lo tanto, un método confiable para purificar diferentes complejos de septina de manera eficiente es vital para la investigación de septinas. Sin embargo, incluso usando el mismo protocolo, diferentes purificaciones pueden dar proteínas con diferente actividad / funcionalidad o incluso integridad. Para las proteínas disponibles comercialmente, como las enzimas, la funcionalidad y la actividad enzimática se validan cuidadosamente43. Implementar un control de calidad cuidadoso para las proteínas citoesqueléticas o estructurales como las septinas puede ser un desafío, pero es esencial hacer que los experimentos entre laboratorios sean comparables.
Este artículo describe un método robusto para purificar septinas recombinantes de alta calidad en su forma heterooligomérica basado en la expresión simultánea de dos vectores que contienen construcciones mono o bicistrónicas (Tabla 1) en células de Escherichia coli. El método consiste en un enfoque de cromatografía de afinidad de dos pasos para capturar heterooligómeros de septina que contienen tanto una septina marcada con his6 como una septina marcada con Strep-II (Figura 1B, C). Este protocolo, descrito por primera vez en Iv et al.10, se ha utilizado para purificar hexámeros de septina 11,27,35 de Drosophila, hexámeros de septina humana 10 y varios octámeros de septina humanos que contienen diferentes isoformas nativas (isoformas 1, 3 y 5)10,32 o SEPT9 mutadas 32 . Además, se describe un conjunto de técnicas para evaluar la calidad de las septinas purificadas. En primer lugar, se comprueba la integridad y la estequiometría correcta de las subunidades de septina mediante electroforesis desnaturalizante y microscopía electrónica de transmisión (TEM). Luego, la presencia de heterooligómeros de la masa molecular correcta y la presencia de monómeros u oligómeros más pequeños indicativos de inestabilidad compleja se examinan mediante electroforesis nativa y fotometría de masas mediante microscopía de dispersión interferométrica (iSCAT). Finalmente, el último paso consiste en la evaluación de la actividad polimerizante de las septinas mediante microscopía de fluorescencia y TEM.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig01v2.jpg"> Figura 1: Estrategia de purificación. (A) Esquemas de los heterooligómeros de septina que existen en células humanas (izquierda) y Drosophila (derecha). Los números denotan subunidades de septina de los grupos indicados, y P denota maní. El SEPT9 humano puede ser cualquiera de sus isoformas. Las subunidades de septina tienen una forma asimétrica y están asociadas longitudinalmente con dos interfaces distintas, la interfaz NC: NC y la interfaz G: G, como se indica por NC y G, respectivamente, en la parte superior del hexámero humano. (B,C) Ilustración esquemática de la estrategia de cromatografía en dos pasos, mostrada para (B) hexámeros de septina humanos y (C) octamers. H indica las etiquetas his, mientras que S indica las etiquetas Strep-II. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig01v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Combinador láser de 488 nm Microscopio iLAS2</td><td>Gataca</td><td></td><td>TIRF</td></tr><tr><td>Líneas de láser de zafiro de 488 nm</td><td>Microscopio confocal</td><td>coherente</td><td></td></tr><tr><td>4k X 4k F416 Cámara CMOS</td><td>TVIPS</td><td></td><td>PARA JEM-1400plus</td></tr><tr><td>4x tampón de muestra nativePAGE</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>BN2003</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico (TROLOX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td>Para evitar el parpadeo</td></tr><tr><td>AKTA pure 25 M1</td><td>GE</td><td>1680311</td><td></td></tr><tr><td>sanitaria Ampicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-25G</td><td></td></tr><tr><td>Carbono Tipo-B, malla 300 Rejilla EM</td><td>Ted pella</td><td>01813-F</td><td></td></tr><tr><td>Carbono Tipo-B, malla 300 Rejilla EM</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>CF300-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos #1.5H</td><td>Thorslabs</td><td>CG15KH</td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1-M1 unidad confocal</td><td>Yokogawa</td><td></td><td>Microscopio confocal</td></tr><tr><td>Desthiobiotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1411-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Lípidos polares</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti2-E</td><td>Nikon instruments</td><td></td><td>Microscopio confocal</td></tr><tr><td>Cóctel inhibidor de proteasa sin EDTA</td><td>Roche</td><td>481761</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap HP, 5 mL</td><td>GE healthcare</td><td>29-0588-3</td><td></td></tr><tr><td>iLAS2 sistema de iluminación azimutal TIRF&nbsp;</td><td>Microscopio Gataca</td><td></td><td></td> TIRF</tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1202-1KG</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue Tinción de gel proteico</td><td>Westburg Life Sciences</td><td>EP ab119211</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>10849040</td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 888 Cámara EMCCD</td><td>Andor</td><td></td><td>Microscopio</td></tr> <tr>confocal<td>iXon Ultra 897 EM-CCD&nbsp;</td><td>Microscopio</td> <td>Andor</td><td></td> TIRF</tr><tr><td>JEM-1400plus</td><td>JOEL</td><td></td><td>Microscopio TEM TUDelft</td></tr><tr><td>kappa-cassein&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>LB caldo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022-6X1KG</td><td></td></tr><tr><td>Lyzozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971-10G-F</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746452-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Metileclulosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8074844</td><td></td></tr><tr><td>Sistema MilliQ (Integral 10)</td><td>Merck-Millipore</td><td></td><td>I-dispensador de agua</td></tr><tr><td>Mini geles TGX proteicos</td><td>BIORAD</td><td>4561086</td><td></td></tr><tr><td>NativeMark estándar de proteínas sin tinción</td><td>Invitrogen</td><td>LC0725</td><td>Para iSCAT y geles nativos</td></tr><tr><td>Geles NativePAGE 4-16%</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>BN1002BOX</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Kit de tampón de ejecución</td><td>Thermo Fisher científico</td><td>BN2007</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti2-E&nbsp;</td><td>Nikon instruments</td><td></td><td>Microscopio TIRF</td></tr><tr><td>Nr. 1 Menzel cubreobjetos</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>11961988</td><td></td></tr><tr><td>parafilm&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7668</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo &times; 100/1.45 NA objetivo de inmersión en aceite</td><td>Nikon instruments</td><td></td><td>Microscopio confocal</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>Poly(L-lisina)-injerto-biotinilado PEG (PLL-PEG)</td><td>SuSoS</td><td>CHF560.00</td><td></td></tr><tr><td>Solución de poli-L-lisina 0.01%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td>Para portaobjetos de vidrio iSCAT</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación para geles nativos</td><td>CONSORT</td><td>S/N 71638</td><td></td></tr><tr><td>POWERPAC UNIVERSAL</td><td>BIORAD</td><td>042BR31206</td><td></td></tr><tr><td>Protocatecuato 3,4-Dioxigenasa (PCD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279-25UN</td><td>eliminador de oxígeno - enzima</td></tr><tr><td>Ácido protocatecuico (PCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03930590-50MG</td><td>eliminador de oxígeno - reactivo</td></tr><tr><td>Q500 Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q500-110</td><td></td></tr><tr><td>Cámara Quemesa</td><td>Olympus</td><td></td><td>Para Tecnai Spirit</td></tr><tr><td>Refeyn OneMP</td><td>Refeyn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón de muestra, laemmli 2x concentrado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3401-10vl</td><td></td></tr><tr><td>Juntas de silicona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL103250-10EA</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Casetes de diálisis 30k MWCO 3mL</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>66381</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1441-1G</td><td></td></tr><tr><td>StrepTrap HP, 1 mL</td><td>GE healthcare</td><td>28-9075-46</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Tecnai Spirit Microscopio</td><td>Thermo Scientific, FEI</td><td></td><td>TEM Institute Curie</td></tr><tr><td>Caldo Terrific</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0918-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tampón Tris/Glyine/SDS</td><td>BIORAD</td><td>1610772</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador ultrasónico</td><td>Branson</td><td>CPX2800H-E</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 6, 30.000 MWCO PES</td><td>Sartorius</td><td>VS0622</td><td></td></tr></tbody></table>

purificación y control de calidad de complejos de septina recombinante para la reconstitución libre de células

Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution

Las septinas son una familia de proteínas eucariotas conservadas de unión a GTP que pueden formar filamentos citoesqueléticos y estructuras de orden superior a partir de complejos heterooligoméricos. Interactúan con otros componentes citoesqueléticos y la membrana celular para participar en funciones celulares importantes como la migración y la división celular. Debido a la complejidad de las muchas interacciones de las septinas, el gran número de genes de septina (13 en humanos) y la capacidad de las septinas para formar complejos heterooligoméricos con diferentes composiciones de subunidades, la reconstitución libre de células es una estrategia vital para comprender los conceptos básicos de la biología de la septina. El presente artículo describe primero un método para purificar septinas recombinantes en su forma heterooligomérica utilizando un enfoque de cromatografía de afinidad de dos pasos. Luego, se detalla el proceso de control de calidad utilizado para verificar la pureza e integridad de los complejos de septina. Este proceso combina electroforesis en gel nativo y desnaturalizante, microscopía electrónica de tinción negativa y microscopía de dispersión interferométrica. Finalmente, se proporciona una descripción del proceso para verificar la capacidad de polimerización de los complejos de septina utilizando microscopía electrónica de tinción negativa y microscopía fluorescente. Esto demuestra que es posible producir hexámeros y octámeros de septina humana de alta calidad que contienen diferentes isoformas de septin_9, así como hexámeros de septina de Drosophila .

Como se mencionó en el protocolo, se cultivaron 5 L de células de E. coli co-transformadas con los dos plásmidos que expresan septina, y la expresión de septinas se indujo mediante la adición de IPTG. Después de 3 h, las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en tampón de lisis y se lisaron por sonicación. El lisado se clarificó por centrifugación y la solución clarificada se aplicó a una columna HisTrap (Figura 2A). Después de la primera purificación, las fracciones que contenían septina se agruparon y se aplicaron a una columna StrepTrap (Figura 2B). Esto típicamente produce alrededor de 3-5 ml de ~ 1 μM de complejo de septina. Antes de agrupar las fracciones que contienen septina, se puede utilizar la electroforesis en gel desnaturalizante para verificar la integridad de las subunidades de septina y la relación estequiométrica equimolar entre las diferentes subunidades de septina que forman el complejo. (Figura 3A). Si el gel muestra bandas igualmente intensas correspondientes a los pesos moleculares (Tabla 3) de las subunidades de septina, se puede continuar con el protocolo. Si no es así, se recomienda iniciar el protocolo de nuevo. En el ejemplo mostrado para el octámero de septina humana con SEPT9_i1, la Figura 3A muestra claramente las bandas correspondientes a SEPT9_i1, SEPT6, SEPT7 y SEPT2 (en el orden de arriba a abajo) con intensidades similares; el intervalo de confianza del 99% de la intensidad normalizada fue de 1,128 ± 0,048 para SEPT2, 1,092 ± 0,034 para SEPT6, 1,108 ± 0,040 para SEPT7 y 1,067 ± 0,029 para SEPT9. Si SEPT2 está etiquetado con msfGFP, se desplazará muy cerca de debajo de SEPT9_i1. Dependiendo del sistema de electroforesis utilizado y de la presencia de la etiqueta C-terminal TEV-Strep para SEPT7 (lo que hace que migre más lentamente que SEPT7 sin etiquetar), las bandas SEPT7 y SEPT6 a veces se fusionan debido a sus pesos moleculares comparables. El siguiente paso es agrupar las fracciones y dializarlas contra el tampón septina con TDT. Después de la diálisis, si la concentración es demasiado baja (&lt;2 μM) o se necesita una concentración más alta para los experimentos, se puede incluir un paso de concentración, como se describe en el protocolo. Las concentraciones por debajo de 1 μM suelen indicar una mala calidad funcional de las septinas. Una concentración final del complejo de septina entre 3,5 μM y 7 μM funciona bien para la mayoría de los ensayos in vitro . Estas concentraciones generalmente se obtienen cuando el volumen después de la concentración alcanza 0.5-1 mL.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig02.jpg"> Figura 2: Ejemplo de cromatogramas correspondientes a la purificación de septina humana oscura octamers_9i1. (A) Cromatograma en columna HisTrap. Después del pico de elución de septina, la absorbancia no vuelve a cero, probablemente debido a la presencia de imidazol en el tampón. La fracción agrupada fue desde el inicio del pico de elución hasta que la absorbancia se estabilizó en alrededor de 250 ml. (B) Cromatograma en columna StrepTrap. La fracción agrupada fue desde el inicio del pico de elución hasta que la absorbancia volvió a alrededor de 0 a 50 ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para continuar con el control de calidad, se realizó electroforesis nativa, como se describe en el protocolo, (Figura 3B). En los geles, se puede observar una banda mayor correspondiente a los heterooligómeros intactos y, normalmente, una banda menor correspondiente a los dímeros. Los hexámeros humanos se encuentran un poco por encima de la banda de marcadores de 242 kDa, mientras que los octámeros se encuentran por encima de la banda de 480 kDa, por encima de su masa molecular calculada. La localización de estas bandas fue verificada por análisis de Western blot de extractos de células eucariotas32. El etiquetado con msfGFP acopla cada SEPT2 con una proteína msfGFP. Esto provoca un aumento en el peso molecular de los complejos de septina de 53,4 kDa (26,7 kDa/msGFP molécula). Sin embargo, en el gel de electroforesis nativo, el peso molecular aparente de los complejos marcados con msfGFP es indistinguible del de los complejos no etiquetados.
Una técnica complementaria para probar si los complejos de septina están intactos es la fotometría de masas mediante microscopía iSCAT. iSCAT monitorea la dispersión de luz de las moléculas que aterrizan en un portaobjetos de vidrio amplificado por la interferencia con la luz de referencia, típicamente el reflejo del láser en la parte inferior del portaobjetos de vidrio. Luego, se utiliza un enfoque de sustracción de fondo para dar contraste a las partículas. Debido a esta corrección, la señal muestra valores positivos y negativos dependiendo de si las partículas aterrizan en el vidrio o se alejan de él49. La señal detectada es directamente proporcional al peso molecular de las proteínas50. Por lo tanto, una calibración de señal a masa con un estándar de masa puede determinar la masa de las proteínas de la muestra. La Figura 3C muestra un ejemplo de octámeros de septina humanos que contienen SEPT9_i1. La mayoría de las partículas individuales detectadas (~ 50%) tienen un peso molecular esperado para octámeros completos que contienen SEPT9_i1 (423 kDa) (Figura 3C). También hay partículas con masas entre 150-300 kDa, pero no se observa un pico claro, lo que indica la posible presencia de otras especies de septina en baja abundancia. Del mismo modo, la mayoría de las partículas individuales detectadas para los hexámeros de Drosophila marcados con mEGFP tienen un peso molecular esperado para los hexámeros intactos (361 kDa) (Figura 3D). Un pico claro adicional a 241 kDa indica la presencia de tetrámeros estables que contienen dos proteínas de cacahuete, una DSep1 y una mEGFP-DSep2. Finalmente, tanto el complejo de septina humana como el de mosca muestran un pico alrededor de 80 kDa que podría ser una mezcla de monómeros y dímeros, posiblemente amplificados por un rastro de TDT o cualquier otra molécula pequeña que se agregue, mostrando un pico en el lado positivo de la gráfica45.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig03v2.jpg"> Figura 3: Ejemplos de resultados del control de calidad del oligómero . (A) Ejemplo de gel desnaturalizante que muestra diferentes fracciones del pico de elución de la purificación de la octamers_9i1 de septina humana oscura. (B) Ejemplo de electroforesis nativa de diferentes complejos de septina. (C,D) Diferentes ejemplos de histograma resultados de fotometría de masas a 12,5 nM de complejos de septina: (C) septina humana oscura octamers_9i1 y (D) DSep1-msfGFP Drosophila septina hexámeros. Las líneas son ajustes gaussianos. (E) Imagen TEM de 25 nM de octamers_9i1 de septina humana oscura en tampón de septina. Barra de escala = 200 nm. (F) Imagen promedio de clase de SEPT2-msfGFP octamers_9i1 de septina humana. Las etiquetas msfGFP son visibles como densidades difusas en los dos extremos. Barra de escala = 10 nm. Los paneles (E) y (F) son propiedad de The Company of Biologists y han sido adaptados de Iv et al.10 con permiso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig03v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Dado que tanto los geles nativos como el iSCAT proporcionan solo información promediada por conjuntos, se utilizó el promedio de clase de imágenes de microscopía electrónica de transmisión de oligómeros de septina individuales para verificar la integridad y pureza de los complejos mediante visualización directa. En imágenes TEM de complejos de septina en tampón septina, se pueden observar varillas de 24 nm (hexámeros) o 32 nm (octameros) de longitud. Un ejemplo de un octámero de septina humano que contiene SEPT9_i1 se puede ver en la Figura 3E. Cuando la clase los promedia, cada una de las subunidades se puede observar y contar, como se ve para el octámero humano marcado con msfGFP con SEPT9_i1 en la Figura 3F. En caso de que el oligómero esté marcado con fluorescencia, se pueden observar densidades adicionales que corresponden al SEPT2-msfGFP al final de las varillas (Figura 3F).
La combinación de las técnicas anteriores demuestra que los octameros (o hexámeros) con la relación estequiométrica correcta y alta pureza pueden purificarse utilizando el protocolo descrito. Finalmente, el último control de calidad es para la funcionalidad de los complejos de septina en términos de su capacidad de polimerización. En presencia de baja concentración de sal (&lt;150 mM KCl con el tampón9 descrito), si las septinas no están en presencia de otras proteínas o membranas lipídicas cargadas negativamente, se autoensamblan en haces9. Se evita que las septinas se polimericen manteniéndolas en el tampón de almacenamiento, que tiene una alta concentración de KCl (300 mM). Los heterooligómeros de septina se diluyen a una proporción de volumen de 1:6 en un tampón de la misma composición pero sin KCl para lograr una concentración final de KCl de 50 mM. Para hacer imágenes de fluorescencia, este tampón se complementa con un sistema de eliminación de oxígeno para proteger del fotoblanqueo y con un supresor de parpadeo. En microscopía TIRF, se pueden observar pequeños grupos de proteínas dentro del campo TIRF poco profundo (~100 nm; Figura 4A,B). En un microscopio confocal, se pueden ver grandes grupos de estructuras filamentosas flotando más arriba en solución (Figura 4C). Finalmente, con TEM, se pueden observar pequeños haces de septina (Figura 4D), correspondientes a los grupos observados por TIRF, y grandes haces (Figura 4E), correspondientes a las estructuras observadas por microscopía confocal. Los recuadros de la Figura 4D,E revelan que ambos tipos de estructuras consisten en filamentos largos y delgados que corren en paralelo, formando haces con extremos cónicos. Juntas, las imágenes de fluorescencia y TEM demuestran que los complejos de septina purificados pueden polimerizarse en filamentos, que a su vez se autoensamblan en paquetes.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig04.jpg"> Figura 4: Ejemplos de resultados de la capacidad de polimerización de control de calidad. (A) Imagen TIRF de 300 nM hexámeros de septina humana (10% hexámeros marcados con msfGFP) en fluoSPB. (B) Imagen TIRF de 300 nM octámeros de septina humana que contienen SEPT9_i1 (10% de octamers9_i1 marcados con msfGFP) en fluoSPB. (C) Proyecciones confocales de intensidad máxima de pilas Z a través de ~ 30 μm con 0.5 μm de espaciamiento de 300 nM de septina humana octamers_9i3 en fluoSPB. (A-C) Barra de escala = 10 μm y escala de grises invertida. (D,E) Ejemplo de imágenes TEM de (D) pequeños y (E) grandes haces de septina humana octamers_9i1 en SPB oscuro. Los recuadros muestran regiones donde se pueden observar filamentos transparentes que corren paralelos dentro del haz. Barras de escala = 500 nm. Los paneles (C-E) son propiedad de The Company of Biologists y han sido adaptados de Iv et al.10 con permiso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Lista de plásmidos. Plásmidos para purificar oligómeros de septina siguiendo este protocolo. Todos los plásmidos han sido depositados en Addgene (primera columna). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%201_V2.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 2: Lista de buffers. Composiciones tampón utilizadas para la purificación y control de calidad de oligómeros de septina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%202(1).xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 3: Pesos moleculares y coeficientes de extinción. Lista de pesos moleculares (MW) y coeficientes de extinción óptica (ε) a una longitud de onda de 280 nm calculada con ProtParam basada en las secuencias del complejo, asumiendo la fusión lineal de las subunidades de septina, los diferentes complejos de septina y las subunidades únicas de septina (solo MW) que pueden purificarse con los plásmidos enumerados en la Tabla 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%203.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

La reconstitución in vitro de proteínas citoesqueléticas es una herramienta vital para comprender las propiedades funcionales básicas de estas proteínas. El presente artículo describe un protocolo para purificar y evaluar la calidad de los complejos de septina recombinantes, que desempeñan un papel central en la división y migración celular.

Purificación y control de calidad de complejos de septina recombinante para la reconstitución libre de células

Septins are a family of conserved eukaryotic GTP-binding proteins that can form cytoskeletal filaments and higher-order structures from hetero-oligomeric ...

Este protocolo permite purificar complejos de septinas de alta calidad, y esto es esencial para estudiar los muchos roles de las septinas en la célula. La principal ventaja de este enfoque es la síntesis de un procedimiento simple para purificar septina de alta calidad utilizando plásmidos Addgene. Las septinas son difíciles de estudiar en las células debido a sus muchas interacciones.La reconstitución de azufre nos ayuda a desentrañar esta complejidad estudiándolas en un sistema simple. Recomendamos hacer la purificación en un solo día para evitar la degradación. En nuestra experiencia, esto aumentará la vida útil y la calidad de la proteína.Para comenzar, cultive el cultivo bacteriano transformado a 37 grados centígrados en una incubadora agitadora hasta que la densidad óptica a una longitud de onda de 600 nanómetros alcance dos o tres para septinas no marcadas, o 0.6 a 0.8 para septinas marcadas con msfGFP o mEGFP. Después de la incubación, inducir la expresión de proteínas agregando IPTG a una concentración final de 0.5 milimolar e incubar las células que expresan heterooligómeros de septina no marcados a 37 grados Celsius durante tres horas, o las células que expresan heterooligómeros marcados con msfGFP a 17 grados Celsius durante la noche. Luego pellet las células a 4, 000 veces G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.Deseche el sobrenadante y disuelva el pellet en 100 mililitros de tampón de lisis para lisar las células. A continuación, use un sonicador de punta a 30% de amplitud para sonicar la celda. Aclarar el lisado celular centrifugando a 20, 000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados y guardar el sobrenadante.Opcionalmente, tome una muestra para desnaturalizar la electroforesis como se describe en el manuscrito. Para la cromatografía de afinidad de septinas marcadas con His, equilibre una columna de cromatografía de alta resolución de níquel sefarosa preempaquetada con todos los tampones necesarios. Cargue el sobrenadante clarificado hasta la columna e inicie el sistema de cromatografía.Luego eluya los complejos de septina con un tampón de elución 50% HisTrap a un caudal de un mililitro por minuto. Para obtener una concentración de imidazol de 250 milimolar, recoja fracciones de 0,5 mililitros. Ahora monitoree la absorbancia óptica del eluido a 280 nanómetros con un sistema rápido de cromatografía líquida de proteínas y elija las fracciones que contienen complejos de septina.Para la cromatografía de afinidad de proteínas marcadas con Strep-II, equilibre una columna de cromatografía de alta resolución de StrepTactin sepharose preempaquetada con tampón septina. Cargue las fracciones que contienen septina recuperadas de la columna de níquel a una velocidad de un mililitro por minuto e inicie el sistema de cromatografía. Luego lave la proteína unida y eluya los complejos de septina con tampón de elución 100% StrepTrap a una velocidad de flujo de un mililitro por minuto.Para producir una concentración de 2.5 milimolar destiobiotina, recolecte fracciones de 0.5 mililitros. Elija las fracciones que contienen complejos de septina como lo indica la absorbancia óptica del eluido a 280 nanómetros monitoreados en línea con un sistema rápido de cromatografía líquida de proteínas. Después de eliminar la destiobiotina por alícuota de diálisis, coloque los complejos de proteínas en el tamaño de alícuota deseado, congele rápidamente la alícuota y guárdela a menos 80 grados centígrados.Para la microscopía de dispersión interferométrica, lave los portaobjetos de vidrio número 1.5 sonicándolos en un limpiador ultrasónico durante cinco minutos cada uno en agua, isopropanol y nuevamente en agua desionizada. Seque dos portaobjetos de vidrio con una suave corriente de gas nitrógeno. Luego coloque una gota de siete microlitros de solución de poli-L-lisina al 0,01% en el centro de uno de los portaobjetos y coloque el centro del otro portaobjetos encima de la gota de poli-L-lisina, orientando los dos portaobjetos ortogonalmente para una fácil separación.Después de incubar durante 30 segundos, lave el portaobjetos sumergiéndolo en un vaso de precipitados que contenga agua desionizada una vez y aplicando directamente un chorro de agua dos veces. Séquelos con un flujo de gas nitrógeno y estos portaobjetos se pueden almacenar durante aproximadamente seis semanas a temperatura ambiente en condiciones secas. Antes del experimento, corte una pieza de juntas de dos en dos, tres por dos o tres por tres y péguelas en la parte tratada con poli-L-lisina de un portaobjetos de vidrio, evitando que la diapositiva de vidrio y las juntas entren en contacto con cualquier superficie sucia colocando la diapositiva sobre un pañuelo limpiaparabrisas de servicio ligero.Ahora presione las juntas con una punta de pipeta para pegarlas con el plástico protector presente en las juntas. A continuación, caliente el tampón de septina a temperatura ambiente. Descongele las proteínas en la mano y manténgalas en hielo después.Luego coloque la diapositiva con juntas en el sistema de fotometría de masa comercial que contiene 19 microlitros de tampón de septina y enfoque el microscopio usando la opción de enfoque automático. Vuelva a enfocar con la nueva configuración, utilizando la opción de enfoque automático. Para crear una carpeta de proyecto, haga clic en Archivo seguido de Nuevo proyecto y, para cargar una carpeta de proyecto para almacenar datos, haga clic en Archivo seguido de Cargar proyecto.Luego pipete un microlitro de muestra a 19 microlitros de gota tampón del tabique. Mezcle, y mientras mezcla, evite tocar cualquier cosa para evitar el movimiento de la diapositiva. Luego grabe un video de 6, 000 cuadros haciendo clic en Grabar.Analice los videos utilizando el software del fabricante para obtener la distribución de masa de proteínas. Si los picos de diferentes tamaños de heterooligómeros de septina se superponen demasiado o se detectan demasiados eventos, disminuya la concentración final de septina y mida nuevamente. Y cuando no se midan suficientes recuentos de moléculas individuales, aumente la concentración de septina y mida nuevamente.Para el análisis de septina, prepare el 5X darkSPB y una mezcla de septina que consista en septina oscura al 100% a una concentración seis veces mayor que la concentración final deseada en tampón de septina y un ditiothreitol milimolar. Luego polimerizar la septina mezclando agua, 20% 5X darkSPB y 16.67% mezcla de septina, en este orden específico, e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Agregue de tres a cinco microlitros de muestra a una rejilla de microscopía electrónica descargada incandescente e incube durante un minuto.Ahora, lave la rejilla dos veces agregando una gota de tampón SPB oscuro y absorba el líquido con un papel de filtro. Lavar una vez con agua e incubar durante 30 segundos con acetato de uranilo al 2%. A continuación, seque la mancha y seque al aire la muestra durante unos minutos.Luego obtenga una imagen de los haces de septina a 120 kilovoltios y aumentos entre 5, 000X y 60, 000X con un desenfoque de uno a dos micrómetros. El cromatograma HisTrap y StrepTrap mostraron que la fracción agrupada fue desde el inicio del pico de elución hasta que la absorbancia se estabilizó en alrededor de 250 mililitros y 50 mililitros respectivamente. Las bandas de septina mostraron intensidades similares en la electroforesis en gel desnaturalizante, lo que sugiere que las septinas están intactas.En la electroforesis nativa, se observó la banda mayor correspondiente a los heterooligómeros intactos y una banda menor correspondiente a los trimores o tetrámeros. El peso molecular aparente de los complejos marcados con msfGFP es indistinguible del de los complejos no marcados. La fotometría de masas detectó octámeros y hexámeros intactos de septinas.Un pico adicional a 241 kilodaltons indicó la presencia de dos proteínas de maní, DSep1 y mEGFP-DSep2. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de complejos de septina mostraron varillas de hexámeros y octámeros. Las etiquetas msfGFP son visibles como densidades difusas en los dos extremos en septina 2 msfGFP septina humana octamers_9i1.Se pueden observar pequeños grupos de proteínas en el campo TIRF poco profundo. La microscopía confocal reveló grandes grupos de estructuras filamentosas flotantes. La microscopía electrónica de transmisión mostró haces de septina pequeños y grandes correspondientes a los grupos observados por microscopía de fluorescencia de reflexión interna total y microscopía confocal.Recomendamos trabajar sobre hielo en todo momento durante las purificaciones y añadir reactivos frescos que especifiquemos en el protocolo. Estamos interesados en las interacciones de las septinas en el contexto de la citocinesis. Reconstituimos septina junto con membranas modernas de actina y microtúbulos para estudiarlos con microscopía y varios ensayos biofísicos.Utilizamos las septinas purificadas para estudiar cómo interactúan las septinas con filamentos de actina, microtúbulos y lípidos. Y también usamos las septinas purificadas para construir células sintéticas donde las septinas facilitan la división celular.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

La purificación por afinidad de las proteínas etiquetadas en combinación con espectrometría de masas (APMS) es un potente método para la asignación sistemática de las redes de interacción de proteínas y para la investigación de la base mecánica de los procesos biológicos. A continuación, se describe un péptido secuencial optimizado afinidad (SPA) APMS procedimiento desarrollado por la...

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Estudios biofísicos y bioquímicos de las interacciones entre los dominios de la proteína de membrana integrados se enfrentan a muchos desafíos técnicos, la primera de las cuales es la de conseguir material de estudio adecuado. En este artículo se describe un protocolo para producir y purificar estabilizadas por puentes disulfuro complejos de péptidos transmembrana que son adecuados para el análisis estructural por la solución de resonancia magnética nuclear (RMN) y otras aplicaciones analíticas.

La producción de disulfuro estabilizados complejos transmembrana de péptidos de Estudios Estructurales

Se describe un método para la purificación eficiente de proteínas de fusión doble-Strep-etiquetados y sus complejos específicos sobre estreptavidina modificada (Strep-Tactin) de resina covalentemente reticulado con bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3). El método tiene las ventajas de velocidad rápida, buena recuperación proteína diana y alta pureza, y es compatible con el análisis posterior por espectrometría de masas.

De un solo paso de purificación de proteínas etiquetadas-Twin-Strep y sus complejos de Strep-Tactin resina reticulado con Bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3)

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Expresión de proteínas recombinantes para la Biología Estructural en HEK 293F Suspensión Células: Un enfoque novedoso y accesible

El método de Purificación por Afinidad en Tándem (TAP) se ha utilizado ampliamente para aislar complejos nativos de extractos celulares, principalmente eucariotas, para proteómica. Aquí, presentamos un protocolo de método TAP optimizado para la purificación de complejos nativos para estudios estructurales.

Purificación de Complejos nativo para el estudio estructural se utiliza un método Tag Tandem Affinity

Aquí se describe protocolos para romper las células de mamíferos por molienda en estado sólido a una temperatura criogénica, producir un extracto celular a partir del polvo de células resultante, y aislar los complejos de proteínas de interés por captura de afinidad sobre perlas paramagnéticas a escala micrométrica de anticuerpos acoplados.

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Describimos aquí un novedoso, robusto y eficiente método de purificación de afinidad en tándem (TAP) para la expresión, aislamiento y caracterización de complejos de proteínas de células eucariotas. Este protocolo podría utilizarse para la caracterización bioquímica de complejos discretos, así como para la identificación de nuevos interactores y modificaciones postraduccionales que regulen su función.

Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

Este artículo presenta una serie de métodos consecutivos para la expresión y purificación de Salmonella typhimurium triptófano sintasa comp este protocolo un sistema rápido para purificar el complejo proteico en un día. Los métodos cubiertos son la mutagénesis dirigida al sitio, la expresión de proteínas en Escherichia coli,la cromatografía de afinidad, la cromatografía de filtración en gel y la cristalización.

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Las septinas son proteínas citoesqueléticas. Interactúan con las membranas lipídicas y pueden sentir, pero también generar curvatura de la membrana a escala de micras. Describimos en este protocolo metodologías in vitro ascendentes para analizar deformaciones de membrana, unión de septina sensible a la curvatura y ultraestructura de filamentos de septina.

Métodos in vitro ascendentes para evaluar la organización ultraestructural, la remodelación de la membrana y el comportamiento de sensibilidad a la curvatura de las septinas

La reconstitución libre de células ha sido una herramienta clave para comprender el ensamblaje del citoesqueleto, y el trabajo en la última década ha establecido enfoques para estudiar la dinámica de la septina en sistemas mínimos. Aquí se presentan tres métodos complementarios para observar el ensamblaje de la septina en diferentes contextos de membrana: bicapas planas, soportes esféricos y soportes de varilla.

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Este protocolo detalla los procedimientos para la producción recombinante de la holoenzima miosina-7a humana utilizando el sistema MultiBac Baculovirus y para el estudio de su motilidad mediante un ensayo de deslizamiento de filamento in vitro personalizado.

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Aprende a purificar complejos de septina de alta calidad mediante cromatografía de afinidad para estudiar su función en la división celular. Este protocolo simplificado mejora la estabilidad y pureza de las proteínas.

Purificación y control de calidad de complejos de septina recombinante para la reconstitución libre de células

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