Name: Sinapsis de cinta de inmunoetiquetado y conteo en cócleas de jerbos jóvenes y ancianos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprenda a evaluar la integridad sináptica en cócleas de jerbos jóvenes y ancianos mediante inmunoetiquetado y conteo de sinapsis de cinta. Este protocolo permite obtener datos cuantitativos sobre la degeneración sináptica relacionada con la edad.

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Los autores reconocen a Lichun Zhang por ayudar a establecer el método y a la Unidad de Servicio de Microscopía de Fluorescencia, Universidad Carl von Ossietzky de Oldenburg, para el uso de las instalaciones de imágenes. Esta investigación fue financiada por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania -EXC 2177/1.

<ol><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+and+age-related+hearing+loss%3A+new+perspectives+and+potential+therapies+%5Bversion+1%3B+peer+review%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review.</a> F1000Research. 6 (927), (2017).</li>
<li>Heeringa, A. N., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aging+cochlea%3A+Towards+unraveling+the+functional+contributions+of+strial+dysfunction+and+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing%22%5BJournal%5D)">The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy.</a> Hearing. 376, 111-124 (2019).</li>
<li>Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+gradients+of+ribbon+size+and+AMPA+receptor+expression+underlie+sensitivity+differences+among+cochlear-nerve%2Fhair-cell+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).</li>
<li>Khimich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+synaptic+ribbons+are+essential+for+synchronous+auditory+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling.</a> Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).</li>
<li>Pangršič, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+requires+otoferlin-dependent+efficient+replenishment+of+synaptic+vesicles+in+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells.</a> Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).</li>
<li>Meyer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+of+synapse+number%2C+structure+and+function+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea.</a> Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).</li>
<li>Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+gradients+of+ribbon+volume+and+AMPA-receptor+patch+volume+in+cochlear+afferent+synapses+on+gerbil+inner+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells.</a> Hearing Research. 364, 81-89 (2018).</li>
<li>Steenken, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+decline+in+cochlear+ribbon+synapses+and+its+relation+to+different+metrics+of+auditory-nerve+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity.</a> Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).</li>
<li>Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+differences+among+afferent+synapses+on+cochlear+hair+cells%3A+Correlations+with+spontaneous+discharge+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate.</a> Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).</li>
<li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li>
<li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li>
<li>Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olivocochlear+innervation+maintains+the+normal+modiolar-pillar+and+habenular-cuticular+gradients+in+cochlear+synaptic+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).</li>
<li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes%2C+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB%2FnJ+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6 (1), 25056(2016).</li>
<li>Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+gradients+in+inner+hair+cell-auditory+nerve+fiber+pre-+and+postsynaptic+proteins+differ+across+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains.</a> Hearing Research. 390, 107933(2020).</li>
<li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li>
<li>Bourien, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+auditory+nerve+fibers+to+compound+action+potential+of+the+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve.</a> Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).</li>
<li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+cochlear+synaptopathy%3A+An+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li>
<li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis%3A+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li>
<li>Batrel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+potentials+recorded+at+the+round+window+enable+the+detection+of+low+spontaneous+rate+fibers+in+gerbil+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0169890(2017).</li>
<li>Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -L., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss+in+gerbil%3A+Round+window+assays+of+synapse+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978(2021).</li>
<li>Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+auditory+thresholds+and+loss+of+ribbon+synapses+at+inner+hair+cells+in+aged+gerbils%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils.</a> Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).</li>
<li>Cheal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gerbil%3A+A+unique+model+for+research+on+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Aging+Research%22%5BJournal%5D)">The gerbil: A unique model for research on aging.</a> Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).</li>
<li>Gates, G. A., Mills, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presbycusis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Presbycusis.</a> The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).</li>
<li>Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+sensitivity+of+the+gerbil%2C+Meriones+unguiculatis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).</li>
<li>Müller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cochlear+place-frequency+map+of+the+adult+and+developing+gerbil%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+the+intact+rodent+organ+of+Corti+for+RNAscope+and+immunolabeling%2C+confocal+microscopy%2C+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100544(2021).</li>
<li>Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+migration+and+reorganization+after+noise+exposure+suggests+regeneration+in+a+mature+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19945(2020).</li>
<li>Gray, D. A., Woulfe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin+and+aging%3A+a+matter+of+toxic+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+Aging+Knowledge+Environment%3A+SAGE+KE%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste.</a> Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1(2005).</li>
<li>Li, H. -S., Hultcrantz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+degeneration+of+the+organ+of+Corti+in+two+genotypes+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22ORL%3B+Journal+for+Oto-rhino-laryngology+and+Its+Related+Specialties%22%5BJournal%5D)">Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice.</a> ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).</li>
<li>Kobrina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+anatomical+and+physiological+markers+of+auditory+system+degeneration+with+behavioral+hearing+assessments+in+a+mouse+%28Mus+musculus%29+model+of+age-related+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss.</a> Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).</li>
<li>Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+role+of+lipofuscin+in+age-related+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 464(2018).</li>
<li>Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+myocardial+tissue+with+digital+autofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+Informatics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy.</a> Journal of Pathology Informatics. 7, 15(2016).</li>
<li>Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+gradients+in+the+size+of+inner+hair+cell+ribbons+emerge+before+the+onset+of+hearing+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).</li>
<li>Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+neural+degeneration+in+the+human+cochlea%3A+Evidence+for+hidden+hearing+loss+in+the+aging+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear.</a> Neuroscience. 407, 8-20 (2019).</li>
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Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Con el método descrito en este protocolo, es posible inmunoetiquetar IHC y estructuras sinápticas en cócleas de jerbos adultos jóvenes y envejecidos, identificar presuntas sinapsis funcionales mediante la colocalización de elementos pre y postsinápticos, asignarlos a IHC individuales y cuantificar su número, volumen y ubicación. Los anticuerpos utilizados en este enfoque también etiquetaron las células ciliadas externas (OHC; myoVIIa) y sus cintas presinápticas. Además, una alternativa viable para el inmunoetiquetado de ...

La pérdida de audición relacionada con la edad es una de las enfermedades más prevalentes del mundo que afecta a más de un tercio de la población mundial de 65 años o más1. Las causas subyacentes aún están en debate y se están investigando activamente, pero pueden incluir la pérdida de las sinapsis especializadas que conectan las células ciliadas internas (IHC) con las fibras nerviosas auditivas aferentes2. Estas sinapsis de cinta comprenden una estructura presináptica que tiene vesículas llenas del neurotransmisor glutamato atado a ella, así como receptores postsinápticos de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico (AMPA) glutamato 3,4,5. En el jerbo, ~ 20 fibras nerviosas auditivas aferentes entran en contacto con un IHC 6,7,8. Las fibras en el IHC frente al modiolus se oponen a las cintas sinápticas grandes, mientras que las fibras que se conectan en el lado del pilar del IHC se enfrentan a pequeñas cintas sinápticas (es decir, en gatos9, jerbos7, conejillos de indias10 y ratones 3,11,12,13,14). Además, en el jerbo, el tamaño de las cintas presinápticas y los parches de glutamato postsináptico se correlacionan positivamente 7,14. Las fibras que se oponen a las cintas grandes en el lado modiolar de la IHC son de calibre pequeño y tienen bajas tasas espontáneas y umbrales altos15. Existe evidencia de que las fibras de baja tasa espontánea son más vulnerables a la exposición al ruido10 y a los fármacos ototóxicos16 que las fibras de bajo umbral altamente espontáneas, que se encuentran en el lado del pilar de los IHC15.
La pérdida de sinapsis de cinta es el evento degenerativo más temprano en la pérdida auditiva relacionada con la edad neuronal coclear, mientras que la pérdida de células ganglionares espirales y sus fibras nerviosas auditivas aferentes se queda atrásde 17,18. Los correlatos electrofisiológicos incluyen registros de respuestas auditivas del tronco encefálico17 y potenciales de acción compuesto8; sin embargo, estos no reflejan las sutilezas de la pérdida de sinapsis, ya que las fibras de baja tasa espontánea no contribuyen a estas medidas16. Las métricas electrofisiológicas más prometedoras son el índice neuronal derivado del potencial de masa19 y la respuesta de tiempo periestímulo20. Sin embargo, estos solo son confiables si el animal no tiene otras patologías cocleares, más allá de la pérdida de fibras nerviosas auditivas, que afecten la actividad de las fibras nerviosas auditivas restantes8. Además, los umbrales evaluados conductualmente en el jerbo no se correlacionaron con los números de sinapsis21. Por lo tanto, la cuantificación confiable de las sinapsis de cinta sobrevivientes y, por lo tanto, el número de fibras nerviosas auditivas funcionales solo es posible mediante el examen directo del tejido coclear.
El jerbo mongol (Meriones unguiculatus) es un modelo animal adecuado para estudiar la pérdida auditiva relacionada con la edad. Tiene una vida útil corta, tiene audición de baja frecuencia similar a la humana, es fácil de mantener y muestra similitudes con patologías humanas relacionadas con la pérdida auditiva relacionada con la edad 2,22,23,24. Los jerbos se consideran envejecidos cuando alcanzan los 36 meses de edad, que está cerca del final de su vida útil promedio22. Es importante destacar que se ha demostrado una pérdida de sinapsis de cinta relacionada con la edad en jerbos criados y envejecidos en ambientes tranquilos 8,21.
Aquí, se presenta un protocolo para inmunoetiquetar, diseccionar y analizar cócleas de jerbos de diferentes edades, desde adultos jóvenes hasta ancianos. Se utilizan anticuerpos dirigidos contra componentes del presinaptaso (CtBP2), parches de receptores de glutamato postsinápticos (GluA2) y IHC (myoVIIa). Se aplica un silenciador de autofluorescencia que reduce el fondo en las cócleas envejecidas y deja intacta la señal de fluorescencia. Además, se da una descripción de cómo diseccionar la cóclea para examinar tanto el epitelio sensorial como la estría vascular. La longitud coclear se mide para permitir la selección de distintas ubicaciones cocleares que corresponden a las mejores frecuencias específicas25. La cuantificación de los números de sinapsis se lleva a cabo con el software gratuito ImageJ26. La cuantificación adicional de los volúmenes y ubicaciones de sinapsis dentro del HC individual se realiza con un software personalizado escrito en Matlab. Este software no se pone a disposición del público, ya que los autores carecen de los recursos para proporcionar documentación y soporte profesional.

<table><tbody><tr><td>Fracción de albúmina V sin biotina</td><td>Carl Roth</td><td>0163.2</td><td></td></tr><tr><td>anti-CtBP2 (ratón monoclonal IgG1)</td><td>BD Biosciences, Eysins</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>anti-GluA2 (ratón monoclonal IgG2a)</td><td>Millipore</td><td>MAB39</td><td></td></tr><tr><td>antiratón (IgG1)-AF 488</td><td>Molecular Probes Inc.</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>anti-MyosinVIIa (conejo policlonal IgG)</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25e6790</td><td></td></tr><tr><td>Portacuchillas & Martillo - Mandíbulas planas</td><td>Fine Science Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>Bonn Tijeras de arteria - Punta esférica</td><td>Fine Science Tools</td><td>14086-09</td><td></td></tr><tr><td>Espesor del cubreobjetos 1,5H, 24 x 60 mm</td><td>Carl Roth</td><td>LH26.1</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla quirúrgica desechable</td><td>Henry Schein</td><td>0473</td><td></td></tr><tr><td>anti-conejo para burro (IgG)-AF647</td><td>Life Technologies-Sondas moleculares</td><td>A-31573</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Pinzas finas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de #5SF Dumont</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, absoluto 99.8%</td><td>Fisher Scientific</td><td>12468750</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético</td><td>Carl Roth</td><td>8040.2</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feather Cuchilla de doble filo</td><td>PLANO</td><td>112-9</td><td></td></tr><tr><td>G19 Cánula</td><td>Henry Schein</td><td>9003633</td><td></td></tr><tr><td>cabra anti-ratón (IgG2a)-AF568</td><td>Invitrogen</td><td>A-21134</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Ratiopharm</td><td>N68542.04</td><td></td></tr><tr><td>Huygens Essentials</td><td>Scientific Volume Imaging ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fiji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersol, Aceite de inmersión 518F</td><td>Carl Zeiss</td><td>10539438</td><td></td></tr><tr><td>Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)</td><td>Braun</td><td>4062957E</td><td></td></tr><tr><td>ISM596D</td><td>Ismatec</td><td></td><td>bomba peristáltica</td></tr><tr><td>KL 1600 LED</td><td>Schott</td><td>150.600</td><td>fuente de luz para microscopio estereoscópico</td></tr><tr><td>Leica Application suite X</td><td>Leica Microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema Leica TCS SP8</td><td>Leica Microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The Mathworks Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Mayo Carburo de tungsteno ToghCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14512-17</td><td></td></tr><tr><td>Mini-100 Orbital-Genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-M100</td><td>para uso en entornos fríos</td></tr><tr><td>Narcoren (pentobarbital)</td><td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ni-Ei</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon Europe B.V.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri sin respiraderos</td><td>Avantor VWR</td><td>390-1375</td><td></td></tr><tr><td><solución salina tamponada con fosfato fuerte> </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fosfato disódico</td><td>AppliChem</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monopotásico</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434-M</td><td></td></tr><tr><td>Envases con tapón de rosca</td><td>Sarstedt</td><td>75.562.300</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Carl Roth</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>Estudiante Pinzas Adson</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>91106-12</td><td></td></tr><tr><td>Estudiante Halsted-Mosquito Hemostático</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>91308-12</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de adherencia Superfrost</td><td>Epredia</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X</td><td>Carl Roth</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>TrueBlack Lipofuscina Autofluorescencia Quencher</td><td>Biotium</td><td>23007</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Tijeras de resorte, 3 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Medio de montaje</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vibrax VXR básico</td><td>IKA</td><td>0002819000</td><td></td></tr><tr><td>VX 7 Accesorio de plato para Vibrax VXR basic</td><td>IKA</td><td>953300</td><td></td></tr><tr><td>Wild TYP 355110 (Microscopio estereoscópico)</td><td>Wild Heerbrugg</td><td></td><td>ya no está disponible</td></tr></tbody></table>

sinapsis de cinta de inmunoetiquetado y conteo en cócleas de jerbos jóvenes y ancianos

Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae

Se supone que la pérdida de sinapsis de cinta que conectan las células ciliadas internas y las fibras nerviosas auditivas aferentes es una de las causas de la pérdida auditiva relacionada con la edad. El método más común para detectar la pérdida de sinapsis de cinta es el inmunoetiquetado porque permite el muestreo cuantitativo de varias ubicaciones tonotópicas en una cóclea individual. Sin embargo, las estructuras de interés están enterradas profundamente dentro de la cóclea ósea. Los jerbos se utilizan como modelo animal para la pérdida de audición relacionada con la edad. Aquí, se describen los protocolos de rutina para la fijación, el inmunoetiquetado de montajes enteros cocleares de jerbos, las imágenes confocales y la cuantificación de los números y volúmenes de sinapsis de cinta. Además, se destacan los desafíos particulares asociados con la obtención de buen material de personas valiosas que envejecen. 
Los jerbos son sacrificados y perfundidos cardiovascularmente, o sus bullas timpánicas se diseccionan cuidadosamente fuera del cráneo. Las cócleas se abren en el ápice y la base y se transfieren directamente al fijador. Independientemente del método inicial, las cócleas se fijan posteriormente y posteriormente se descalcifican. Luego, el tejido se etiqueta con anticuerpos primarios contra estructuras pre y postsinápticas y células ciliadas. A continuación, las cócleas se incuban con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia que son específicos contra sus respectivos primarios. Las cócleas de los jerbos envejecidos se tratan con un silenciador de autofluorescencia para reducir la fluorescencia de fondo típicamente sustancial de los tejidos de los animales más viejos. 
Finalmente, las cócleas se diseccionan en 6-11 segmentos. Toda la longitud coclear se reconstruye de tal manera que las ubicaciones cocleares específicas se pueden determinar de manera confiable entre individuos. Las pilas de imágenes confocales, adquiridas secuencialmente, ayudan a visualizar las células ciliadas y las sinapsis en las ubicaciones elegidas. Las pilas confocales se descontorbanican, y las sinapsis se cuentan manualmente utilizando ImageJ, o se lleva a cabo una cuantificación más extensa de las estructuras sinápticas con procedimientos de análisis de imágenes escritos a medida en Matlab.

Las cócleas se cosecharon después de la perfusión cardiovascular con fijador de todo el animal o se diseccionaron rápidamente después de la eutanasia del animal y se fijaron por inmersión. Con este último método, los IHC permanecieron en su lugar durante la disección, mientras que, en casos de perfusión fallida y, por lo tanto, de tejido insuficientemente fijo, el epitelio sensorial a menudo se destruyó. Tenga en cuenta que los autores encontraron casos en los que la fijación de las cócleas después de la perfusión transc...

Se presenta un protocolo para el procesamiento de cócleas de jerbos adultos jóvenes y ancianos mediante el inmunoetiquetado de las estructuras sinápticas aferentes y las células ciliadas, el apagado de la autofluorescencia en el tejido envejecido, la disección y estimación de la longitud de las cócleas y la cuantificación de las sinapsis en pilas de imágenes obtenidas con imágenes confocales.

Sinapsis de cinta de inmunoetiquetado y conteo en cócleas de jerbos jóvenes y ancianos

The loss of ribbon synapses connecting inner hair cells and afferent auditory nerve fibers is assumed to be one cause of age-related hearing loss. The ...

Este protocolo permite la evaluación de la integridad sináptica en la cóclea del jerbo de todas las edades. Esto es importante para la investigación fundamental sobre los problemas de audición, en particular, debido al envejecimiento. El protocolo es relativamente rápido y produce datos cuantitativos de varias ubicaciones a lo largo de la cóclea.Además, aborda un problema específico del envejecimiento del tejido mediante el uso de un silenciador de autofluorescencia. La degeneración de las sinapsis es el signo más temprano de pérdida de función en la cóclea. Cuantificarlo es una herramienta importante en la investigación hacia el desarrollo de herramientas de diagnóstico no invasivas para la sinaptopatía.La disección coclear es la parte más crucial que necesita práctica, por lo que es mejor comenzar con cocleíes no experimentales. Comience por quitar las ampollas. Cortar el hueso con tijeras o romper el hueso con fórceps y retirarlo con fórceps para llegar a la cóclea.Retire el malleus, el incus y los canales semicirculares. Retire con cuidado el hueso que cubre el ápice de la cóclea y rasque el hueso coclear con fórceps para hacer pequeños agujeros en el ápice y en el giro basal o haga agujeros con cuidado en ambos lugares. Transfiera inmediatamente las ampollas a al menos 50 mililitros de fijador frío.Para cortar el cochli por la mitad, coloque un trozo de cuchilla de afeitar más largo que la longitud enrollada de la cóclea en un soporte de cuchilla. Luego, coloque la cóclea en una placa de Petri bajo un microscopio estereoscópico. Corte el exceso de tejido con una cuchilla de afeitar o con tijeras finas.Sostenga la cóclea en su lugar con fórceps finos y córtela por la mitad a lo largo del modiolus. Prepare una solución al 5% del calmante de autofluorescencia mezclándolo con etanol al 70%. Coloque el cochli en esta solución e incube durante un minuto a temperatura ambiente en un agitador seguido de lavar tres veces con un mililitro de PBS durante cinco minutos.Para la disección de la cóclea, recoja dos pinzas finas, pinzas súper finas, vannas, tijeras de resorte, un soporte de cuchilla, una hoja de afeitar y llene la placa de Petri de poliestirol y su tapa con PBS. Rompe piezas de la cuchilla de afeitar para obtener una superficie de corte de dos a cuatro milímetros. Corte la cóclea por la mitad como se muestra en la sección para la preparación del tejido.Fije cuidadosamente la mitad coclear con las pinzas de tal manera que el borde cortado esté orientado hacia arriba. Use tijeras finas de resorte para cortar el hueso de la cóclea por encima del helicotrema que cubre el ápice. Luego, use tijeras para aislar el giro apical cortando a través del modiolus y el nervio auditivo y los vestibuli de la scala.Haga dos cortes a cada lado del hueso coclear por encima, o si la estría vascular no es necesaria para una evaluación adicional, directamente a través de la estría vascular del giro medio. Usa la hoja de afeitar para separar las piezas cocleares. Alternativamente, corte entre el órgano de Corti y la estría vascular.Deje la estría vascular conectada al ligamento espiral y retire el hueso descalcificado con fórceps. A continuación, transfiera las piezas cocleares a una tapa de placa de Petri llena de PBS. Retire el exceso de tejido en el pilar y los lados modiolares de modo que todos los soportes se queden más tarde en la corredera lo más plano posible.Las piezas cocleares grandes, en particular, las que se originan en el giro basal, deben cortarse en dos pedazos. Retire con cuidado la membrana tectorial con pinzas súper finas. Coloque las piezas cocleares en una diapositiva en una gota de medio de montaje, asegurándose de que el Órgano de Corti esté hacia arriba.Desplace la pieza coclear hacia el plano sagital y busque la invaginación del limbo espiral muy cerca de las células ciliadas internas. Esta invaginación del limbo espiral se puede ver más claramente en las piezas cocleares medias y basales. Transfiera toda la cóclea y toda la estría vascular al portaobjetos del microscopio repitiendo estos pasos.Cubra el deslizamiento de la diapositiva y agregue esmalte de uñas negro alrededor de los bordes para el sellado. Secar en la oscuridad y almacenarlos a cuatro grados centígrados. Abra una copia de las pilas descontorneadas en el software ImageJ cargado con el complemento BioVoxxel.Divida los canales haciendo clic en Imagen, luego en Color y luego en Dividir canales. Combínalos haciendo clic en Imagen, luego en Color y luego en Combinar canales para asignar diferentes colores. Convierta la imagen en una pila RGB haciendo clic en Imagen, luego vaya a Color y haga clic en Pila a RGB.Ajuste el brillo y el contraste haciendo clic en Imagen, Ajustar y, a continuación, Brillo/Contraste. Use auto o control deslizante para asegurarse de que las estructuras pre y postsinápticas y las etiquetas internas de las células ciliadas sean distintas del fondo. Etiquete cinco células ciliadas internas con la herramienta de texto haciendo clic en la ubicación deseada dentro de la pila.A continuación, vaya a Analizar, luego a Herramientas y seleccione ROI Manager. Marque las etiquetas de las casillas de verificación para etiquetar los puntos con un número. Haga zoom en la célula ciliada interna de interés.Haga clic derecho en la herramienta de punto para elegir el modo multipunto. Desplácese por la dimensión Z y cuente las sinapsis funcionales de la cinta, que se identifican mediante una cinta presináptica en yuxtaposición a un parche de glutamato postsináptico. Después de seleccionar todas las estructuras de interés, haga clic en Agregar el Administrador de ROI, luego haga clic en el nombre arbitrario y elija Cambiar nombre.Con la herramienta manual, ajuste la imagen para mostrar completamente la siguiente célula ciliada interna. Cambie de la herramienta Multipunto a la herramienta Punto para evitar agregar más puntos a los datos almacenados anteriormente. Haga clic en una estructura de interés dentro de la siguiente célula ciliada interna y cambie a la herramienta Multipunto.Continúe agregando la sinapsis de cinta funcional en el ROI Manager hasta que se evalúen todas las células ciliadas internas. Haga clic en un conjunto de datos en el Administrador de ROI y luego en Medir. Espere a que aparezca una nueva ventana que enumere los puntos de datos medidos y haga clic en Archivo y Guardar como para guardar esta lista como una hoja de cálculo.Guarde la imagen activando Mostrar todo en el Administrador de ROI. Haga clic en Aplanar para agregar permanentemente las etiquetas de punto a la pila y haga clic en Aceptar cerrar guardando los cambios. Las proyecciones de la pila Z de la cóclea de un jerbo joven de 10 meses de edad muestran que las células ciliadas internas marcadas con miosina 7A delineadas aquí por líneas discontinuas blancas estaban en marcado contraste con el fondo.Las cintas presinápticas se etiquetaron con anti-CtBP2 dos que se muestran en verde, mientras que los parches de glutamato post-sináptico se etiquetaron con anti-GluA2 que se muestra en rojo. La cóclea de un viejo jerbo de 38 meses fue tratada con el bloqueador de autofluorescencia y mostró distintas células ciliadas internas con estructuras pre y postsinápticas claramente visibles. Para probar la estabilidad del inmunoetiquetado, se tomó la imagen de la misma pieza de cóclea del jerbo joven después de tres meses y 29 meses y medio.A pesar de la reducción de la relación señal-ruido, las sinapsis funcionales eran distintas y cuantificables. Incluso si un corte falla, monte la pieza restante de tejido para luego estimar la longitud coclear completa con mayor precisión. Los datos de este protocolo son particularmente valiosos si están precedidos por, y luego correlacionados individualmente con, pruebas de audición electrofisiológicas o psicofísicas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se demuestra el uso de la pistola de genes para introducir tintes fluorescentes, como DII, en las neuronas en secciones de cerebro de los roedores y primates no humanos de diferentes edades. En este caso particular, utilizamos ratones adultos (3-6 meses de edad) y adultos de los monos cynomologus (9-15 años). Esta técnica, descrita originalmente por el laboratorio del Dr. Lichtman...

Etiquetado DiOLISTIC de las neuronas de los roedores y no humanos rodajas de cerebro de los primates

Este protocolo detalla la forma de cuantificar el número de sinapsis en cultivos neuronales disociadas y en las secciones del cerebro utilizando inmunocitoquímica. Utilizando anticuerpos específicos contra el compartimiento, que etiqueta los terminales presinápticos, así como los sitios de especialización post-sináptica. Se define como puntos de sinapsis de colocalización entre las señales generadas por estos marcadores.

Las sinapsis cuantificar: un ensayo basado en inmunocitoquímica para cuantificar número de sinapsis

Plenario de células patch-clamp grabaciones de las dendritas de fibras nerviosas auditivas en la sinapsis cinta del pelo interior de células de la cóclea de los mamíferos.

Grabaciones postsinápticos en las dendritas aferentes cocleares ponerse en contacto con las células ciliadas internas: Comunicado de Vigilancia multivesiculares en una sinapsis cinta

Este video muestra un método para evaluar las sinapsis de cinta en regiones específicas de la cóclea del ratón. Utiliza técnicas de inmunotinción e imágenes confocales para identificar sinapsis funcionales en diferentes regiones de frecuencia en cada turno coclear.

Evaluación de sinapsis en cinta en regiones de frecuencia específicas de la cóclea de ratón

La localización y distribución de proteínas proporcionan información importante para entender sus funciones celulares. La resolución espacial superior de la microscopía electrónica (EM) se puede utilizar para determinar la localización subcelular de un antígeno dado después de inmunohistoquímica. Para los tejidos del sistema nervioso central (SNC), la preservación de la integridad estructural, mientras que el mantenimiento de la antigenicidad ha sido especialmente difícil en los estudios de EM.

Post-Etiquetado Inmunoelectrónica incorporación de proteínas sinápticas en cultivos de cortes de hipocampo

Este artículo de video ilustra un protocolo completo para detectar y cuantificar todas las etapas de la neurogénesis del hipocampo adulto dentro de la misma sección de tejido. Elaboramos un método para superar las limitaciones de la inmunofluorescencia múltiple indirecta que surgen cuando no se dispone de anticuerpos adecuados de diferentes especies de huéspedes.

La inmunohistoquímica y Etiquetado múltiple con anticuerpos de la misma especie anfitrión para adultos estudio del hipocampo neurogénesis

Se presenta un método para aislar el órgano de Corti adultos como tres vueltas intactas cocleares (ápice, medio y de base). También demostramos un procedimiento de inmunotinción con anticuerpos marcados con fluorescencia. En conjunto, estas técnicas permiten el estudio de las células ciliadas, células de soporte, y otros tipos de células que se encuentra en la cóclea.

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Imunocoloración Cuádruple del Bulbo Olfativo para la Visualización de Códigos de Identidad Molecular del Axón Sensorial Olfativo

Este manuscrito describe un protocolo experimental para evaluar las características morfológicas y el estado funcional de las sinapsis de cinta en ratones normales. El modelo actual también es adecuado para modelos de sinaptopatía coclear inducidas por ruido y relacionados con la edad. También se discuten los resultados correlativos de estudios anteriores del ratón.

Evaluación morfológica y funcional de sinapsis de cinta en regiones de frecuencia específica de la Cóclea de Ratones

Este artículo presenta un método de preparación de superficie coclear modificado que requiere descalcificación y uso de un adhesivo celular y tisular para adherir las piezas de epitelía coclear a 10 mm de resbalones de cubierta redonda para inmunohistoquímica en cocleares de ratón adultos.

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Aprenda a evaluar la integridad sináptica en cócleas de jerbos jóvenes y ancianos mediante inmunoetiquetado y conteo de sinapsis de cinta. Este protocolo permite obtener datos cuantitativos sobre la degeneración sináptica relacionada con la edad.

Sinapsis de cinta de inmunoetiquetado y conteo en cócleas de jerbos jóvenes y ancianos

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