Name: Trifosforilación química de oligonucleótidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:40:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Aprende la trifosforilación química de oligonucleótidos para biotecnología y biología sintética usando salicil fosforocloridito. Este método permite sintetizar variantes no naturales como L-RNA para aplicaciones avanzadas.

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Los autores agradecen a Greg Springsteen, Natasha Paul, Charles Olea, Jr., Jonathan Sczepanski y Katrina Tjhung por las útiles discusiones sobre las mejores prácticas para las reacciones de trifosforilación química y a Gerald Joyce por sus útiles comentarios. Este trabajo fue apoyado por la subvención MCB 2114588 de la National Science Foundation.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El procedimiento de trifosforilación descrito aquí es ampliamente compatible con la síntesis de oligonucleótidos utilizando la química estándar de fosforamida. Las fosforamidatis nucleósidos deben tener grupos protectores lábiles de base compatibles con la desprotección rápida en AMA39, incluido el β-cianoetilo estándar en el fosfito, y los grupos isobutiril, dimetilformimidil, acetil, fenoxiacetilo o 4-isopropilfenoxiacetilo en las aminas exocíclicas de las nucleobases. Los grupos ribosa 2'-hidroxilo deben estar protegidos por grupos protectores de silil, ya sea t-butildimetilsilil (TBDMS) o tri-iso-propilsililoximetilo (TOM)40,41. También se ha informado que el grupo pivaloiloximetilometil (PivOM) base-lábil es compatible con la trifosforilación química30.
Se han descrito múltiples métodos para la trifosforilación química de oligonucleótidos sintéticos 28,29,30,31,32,33,34,35. Hemos encontrado que la trifosforilación utilizando el reactivoLudwig-Eckstein 37 es una de las más accesibles, ya que no requiere síntesis especializada de reactivos ni equipo especializado. Los oligonucleótidos 5′-trifosfatos preparados por este método se han utilizado rutinariamente como sustratos para ribozimas de ARN ligasa, incluido el uso de trifosfatos de oligonucleótidos de ARN L-ARN enzimáticamente inaccesibles para lograr la síntesis y replicación dependiente de plantillas de este ácido nucleico "imagen especular" 14,16,17,18 . El método también es adecuado para la preparación de pequeños ARN de asa del tallo trifosforilados de 5′ que son potentes activadores de la respuesta inmune innata en vertebrados 6,7.
El reactivo de Ludwig-Eckstein, salicil fosforocloridita37, es altamente reactivo al agua y elimina eficazmente cualquier agua introducida al disolver el reactivo antes de cargarlo en la columna de oligonucleótidos. Después de este punto, sin embargo, el oligonucleótido fosfitilado de 5′reaccionará preferentemente con cualquier agua introducida en el sistema sobre el pirofosfato, formando un producto lateral de 5′-H-fosfonato después del análisis 28,37,38. La preparación cuidadosa de los reactivos de trifosforilación y la cámara de reacción de trifosforilación aseguran que este producto secundario no se forme. Para el secado con disolvente, los tamices moleculares tipo 4 Å se venden preenvasados en bolsas de teflón compatibles con la mayoría de los disolventes orgánicos bajo diversas marcas por la mayoría de las empresas de reactivos de síntesis de oligonucleótidos. Las precauciones adicionales, como realizar la trifosforilación en una guantera bajo una atmósfera anhidra, generalmente no son necesarias.
La reacción del oligonucleótido 5′-fosfitilado con TBAP forma un intermedio cíclico de 5′-trimetafosfito, que luego se oxida al 5′-trimetafosfato cíclico utilizando una solución oxidante de síntesis de oligonucleótidos (yodo en agua / piridina / THF). Cabe señalar que las soluciones oxidantes comerciales utilizan cantidades variables de yodo, y es esencial utilizar la alta concentración de yodo de 0,1 M para garantizar la oxidación completa del trifosfato. El producto cíclico se hidroliza hasta el 5′-trifosfato lineal final en la misma solución37, y se deben utilizar soluciones oxidantes anhidras alternativas si se desea la linealización con nucleófilos distintos del agua (ver más abajo para aplicaciones)33. Cualquier trimetafosfato cíclico residual, sin embargo, se linealizará durante la posterior desprotección alcalina del oligonucleótido. La hidrólisis del 5′-trimetafosfato cíclico produce solo el trifosfato lineal, en lugar del ramificado37,46.
La desprotección de oligonucleótidos generalmente no necesita ser modificada para acomodar la trifosforilación de 5', pero se deben tomar algunas precauciones. El trifosfato es relativamente estable a la exposición breve a condiciones alcalinas, pero se debe tener cuidado de no exponer el trifosfato a AMA más tiempo del necesario. Se deben evitar los grupos protectores que requieren un tratamiento más prolongado en amoníaco o AMA durante más de 10 min a 65 °C. Los tratamientos más suaves, como 2 h en amoníaco a temperatura ambiente, son aceptables cuando son compatibles con otros grupos protectores de fosforamida. Un método común y rápido de desprotección para oligonucleótidos de ARN sintético protegido por sililo utiliza trihidrofluoruro de trietilamina y alta temperatura47; sin embargo, esto debe evitarse al preparar ARN 5′-trifosfatos, ya que las condiciones ácidas prolongadas aceleran la hidrólisis del trifosfato 31,32.
Preparative PAGE ha demostrado ser el método más simple y confiable para la purificación postdesprotección de oligonucleótidos trifosforilados de 5′ (Figura 3 y Figura 4). Sin embargo, la HPLC de fase inversa preparativa también se puede utilizar para purificar productos trifosforilados. La presencia de productos de 5′-difosfato y, en menor medida, de 5′-monofosfato se observa rutinariamente al verificar la trifosforilación por espectrometría de masas. Hemos observado fragmentación de 5′-trifosfato durante la espectrometría de masas a partir de material altamente puro preparado por síntesis química o transcripción, particularmente si el instrumento no está optimizado para el análisis de oligonucleótidos. Sin embargo, el análisis RP-LC a menudo muestra que el 10%-20% del producto secundario 5′-difosfato está presente en oligonucleótidos trifosforilados más largos (Figura 4). Las preparaciones comerciales de pirofosfato de tributilamonio pueden estar contaminadas con hasta un 20% de monofosfato, lo que producirá 5′-difosfato como producto secundario durante la trifosforilación30,31. La preparación cuidadosa de este reactivo internamente puede producir existencias de TBAP mucho más puras31. Sin embargo, hemos encontrado oligonucleótidos trifosforilados utilizando fuentes comerciales de TBAP que todavía muestran una reactividad comparable o mayor cuando se utilizan como sustratos en reacciones enzimáticas (Figura 5B), en comparación con el material preparado por transcripción in vitro.
Un uso adicional notable de la trifosforilación de oligonucleótidos con el reactivo de Ludwig-Eckstein aprovecha el intermedio cíclico trimetafosfito33. Si la etapa de oxidación posterior se lleva a cabo con peróxido de 1 M de t-butilo en hexanos, que a menudo se usa para la oxidación de oligonucleótidos en condiciones anhidras, la oxidación del fosfito ocurre sin hidrólisis de apertura de anillo, produciendo el trimetafosfato cíclico. Este intermediario puede reaccionar con nucleófilos primarios de amina o alcohol para producir 5′-trifosfatos con modificaciones en el γ-fosfato. Estas modificaciones incluyen la adición de una etiqueta lipofílica unida por un enlace fosforamidato, que facilita la rápida purificación específica de trifosfato por RP-LC, seguida de hidrólisis ácida de la etiqueta del trifosfato33. También se pueden introducir modificaciones fluorescentes en la posición de γ-fosfato para su uso como reporteros fluorescentes en tiempo real para reacciones de ligadura catalizadas por ribozimas15,33.

La forma 5′ trifosforilada de ARN es omnipresente en biología, ya que es generada por la transcripción de ARN en todos los dominios de la vida y por la replicación de ARN durante el ciclo de vida de muchos virus de ARN. Estos trifosfatos sirven como sustrato para la formación de ARNm con tapa de 7-metilguanilato en eucariotas y, por lo tanto, desempeñan un papel esencial en la expresión de proteínas1. En contraste, el trifosfato se retiene en bacterias y virus; por lo tanto, los ARN 5′-trifosfatos son reconocidos por reguladores de respuesta de inmunidad innata en eucariotas 2,3,4,5,6,7. Fuera de la biología, una gran cantidad de ribozimas de ARN ligasa han sido evolucionadas para usar el 5′-trifosfato in vitro8 y modificadas para su uso en ensayos de diagnóstico 9,10,11,12,13,14,15. Una de estas ribozimas se puede utilizar para la síntesis dependiente de plantillas de L-ARN, el enantiómero no biológico de "imagen especular" del ARN D natural, a partir de pequeños oligonucleótidos de L-ARN 5′-trifosfatos 16,17,18. La preparación rutinaria de oligonucleótidos trifosforilados de secuencia variable y composición de la columna vertebral es esencial para investigar estos sistemas.
El método más común y accesible para preparar ARN 5′-trifosfatos en el laboratorio es la transcripción in vitro. Sin embargo, el ARN producido por este método está restringido en secuencia y tamaño por los requisitos de promotor y sustrato de la enzima ARN polimerasa. La ARN polimerasa T7 y sus derivados especializados son las polimerasas más comunes utilizadas para este fin 19,20,21,22. El ARN transcrito in vitro preparado con estas enzimas debe iniciarse con una purina 5′-terminal y está fuertemente sesgado hacia las purinas en los primeros 10 nucleótidos23,24. Además, la incorporación enzimática de nucleótidos modificados por la base o la columna vertebral es, en el mejor de los casos, ineficiente y más a menudo imposible con las polimerasas naturales, lo que limita la oportunidad de producir oligonucleótidos 5′-trifosfatos compuestos de cualquier cosa menos D-ARN natural. Otro factor limitante es que el ARN generado por la transcripción in vitro puede contener una heterogeneidad sustancial de 5′ y 3′ y se produce como productos extremadamente heterogéneos cuando es inferior a 20 nt 23,24,25,26,27.
Por el contrario, la trifosforilación química de oligonucleótidos preparados por síntesis de fosforamidadito en fase sólida 28,29,30,31,32,33,34,35 puede utilizarse para preparar oligonucleótidos 5′-trifosfatos de 3-50 nt de largo, de cualquier secuencia. Además, se puede agregar una amplia gama de modificaciones de ácidos nucleicos accesibles a la síntesis de fosforamidas a los oligonucleótidos antes de la trifosforilación 5′-14,15,16,17,18,29,36. Muchos de estos métodos utilizan el reactivo fosfocloridita de fosfocloridita de fosfilofilación, que fue desarrollado por Ludwig y Eckstein para la trifosforilación en fase de solución de mononucleósidos37. La trifosforilación de oligonucleótidos con este reactivo se logra en la fase sólida por fosfilación del oligonucleótido 5′-hidroxilo, conversión al trifosfato por reacción con pirofosfato y oxidación, seguido de procedimientos estándar para la escisión del oligonucleótido del soporte sólido, desprotección y purificación (Figura 1)28.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig01v2.jpg"> Figura 1: Esquema para la trifosforilación de oligonucleótidos sintéticos. En el primer paso, el oligonucleótido 5ʹ-hidroxilo se fosfitila con SalPCl. En el siguiente paso, el fosfito de 5ʹ-salicil se reacciona con TBAP para formar el metafosfito cíclico, luego en el tercer paso se oxida para generar el 5ʹ-trimetafosfato cíclico en la solución de oxidación del sintetizador de ADN / ARN (0.1 M de yodo / piridina / H2O / THF), que se hidroliza rápidamente para producir el 5ʹ-trifosfato lineal en la misma solución28,33, 37. La escisión alcalina posterior del soporte sólido de la CPG y la desprotección del oligonucleótido en MeNH2/amoníaco acuoso hidrolizarán cualquier trimetafosfato cíclico residual a la forma lineal. Abreviaturas: SalPCl = salicil fosforocloridita; TBAP = pirofosfato de tributilamonio; THF = tetrahidrofurano; CPG = vidrio de poro controlado; MenH2 = metilamina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Aunque los primeros informes publicados que utilizan este método a menudo sufrían de bajos rendimientos y productos secundarios no deseados 28,37,38, el mantenimiento cuidadoso de las condiciones anhidras es todo lo que se necesita para obtener rutinariamente altos rendimientos. Esto se puede lograr mediante la preparación cuidadosa de reactivos y el uso de un dispositivo de reacción simple ensamblado a partir de componentes de plástico estándar. Aquí, demostramos los pasos apropiados para la trifosforilación química de oligonucleótidos, incluida la preparación de reactivos, el ensamblaje de la cámara de reacción, la reacción de trifosforilación y la posterior desprotección y purificación de los oligonucleótidos trifosforilados. También se incluye el uso representativo de oligonucleótidos trifosforilados de 5′ como sustratos para ribozimas ligasas para la síntesis de productos de ácido nucleico más grandes con columna vertebral natural de D-ARN y L-ARN abiótico.

<table><tbody><tr><td>0,22 y micro; m filtro de jeringa de polietersulfona</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLMP025SS</td><td>Filtro de jeringa para eliminar partículas de gel de poliacrilamida trituradas (Sección 5)</td></tr><tr><td>0.22 &micro; m Filtro de jeringa de PTFE</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLLG013SL</td><td>Filtro de jeringa para la eliminación de resina CPG (Sección 5)</td></tr><tr><td>Jeringas de plástico de 1</td><td>mL ThermoFisher Scientific</td><td>14-823-434 (BD 309659)</td><td>Componentes de los aparatos de trifosforilación (secciones 2&ndash; 4)</td></tr><tr><td>1,4-Dioxano,</td><td>MilliporeSigma</td> anhidro <td>296309</td><td>disolvente de trifosforilación (secciones 2&ndash; 4)</td></tr><tr><td>2-cloro-4H-1,3,2-benzodioxafosforina-4-ona, fosforilorita de salicilo (SalPCl)</td><td>MilliporeSigma</td><td>324124</td><td>reactivo de trifosforilación (secciones 2&ndash; 4)</td></tr><tr><td>Frascos de vidrio de 30 mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>23232</td><td>Frascos para la preparación de disolventes de trifosforilación y solución TBAP (sección 2)</td></tr><tr><td>Llave de paso de 3 vías, policarbonato/polipropileno</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>7328103</td><td>Componente del aparato de trifosforilación (secciones 2 y dising; 4) 4)</td></tr> <tr><td>40% de acrilamida / solución de bis-acrilamida, 19: 1</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610144</td><td>para PAGE (secciones 5 y ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Acetonitrilo, anhidro, 100 mL</td><td>Glen Research</td><td>40-4050-50</td><td>Solvente de trifosforilación (secciones 2 y ndash; 4)</td></tr><tr><td>Trampa neutralizante de amoníaco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ANT100 y ANS121</td><td>Para uso con Speedvac DNA130 (sección 5)</td></tr><tr><td>Persulfato de amonio (APS)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610700</td><td>Para PAGE, catalizador para la polimerización de acrilamida (secciones 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Amoníaco acuoso, 28%</td><td>MilliporeSigma</td><td>338818</td><td>Para la preparación del reactivo de desprotección AMA (sección 5)</td></tr><tr><td>Metilamina acuosa, 40%</td><td>TCI America</td><td>TCI-M0137</td><td>Para la preparación del reactivo de desprotección AMA (sección 5)</td></tr><tr><td>Sintetizador automatizado de oligonucleótidos de ADN/ARN</td><td>PerSeptive Biosystems</td><td>Expedite 8909 Sintetizador de ADN/ARN</td><td>Cualquier sintetizador basado en columna es aceptable (sección 1)</td></tr><tr><td>Imán de captura de perlas</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12320D</td><td>Para la captura de perlas de estreptavidina (sección 7)</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>1610404 Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td>Para tampón de carga de urea PAGE (sección 5)</td></tr><tr><td>Bomba de aceite de vacío profundo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VLP200-115</td><td>Para uso con liofilizador (sección 5)</td></tr><tr><td>Desecante de drierita, malla 10-20</td><td>MilliporeSigma</td><td>737828</td><td>Desecante para almacenar productos químicos y equipos de trifosforilación (secciones 1 y siguientes; 2)</td></tr> <tr><td>D-RNA 27.3t polimerasa quiral cruzada</td><td>preparada en casa18</td><td>5&prime;-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3&prime;</td><td>Para reacciones de ribozima quiral cruzada (sección 7)</td></tr><tr><td>Soportes sólidos D-RNA CPG, 1.000&Aring;, preempaquetados 1 &micro; columnas de síntesis de moles</td><td>Glen Research</td><td>20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E</td><td>representativo, para la síntesis de oligonucleótidos de D-ARN (sección 1)</td></tr><tr><td>Fosforamiditas protegidas por TOM de D-RNA ChemGenes</td><td></td><td>ANP-3201, 3202, 3203, 3205</td><td>representativo, para la síntesis de oligonucleótidos de D-ARN (sección 1)</td></tr><tr><td>Columnas de síntesis vacías y expeditas, 1&micro; m</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-01</td><td>Columnas de síntesis para uso con el sintetizador de ADN/ARN Expedite (sección 1)</td></tr><tr><td>EPPS, N-(2-hidroxietil)piperazina-N&prime;-(ácido 3-propanosulfónico), sólido</td><td>MilliporeSigma</td><td>E1894</td><td>Componente tampón de reacción de ribozima (sección 6)</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sólido</td><td>MilliporeSigma</td><td>EDS</td><td>Quelante de iones metálicos divalente para uso en varios tampones ( secciones 5ª y siguientes; 7)</td></tr><tr><td>Filtros para columnas de síntesis Expedite</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-0F</td><td>Filtros de columna de síntesis de estilo Expedite, para uso con columnas de síntesis vacías (sección 1)</td></tr><tr><td>Escáner de gel fluorescente/fosforescente</td><td>Cytiva</td><td>Amersham Typhoon RGB, 29187193</td><td>Para visualizar PAGE analítica (secciones 6&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Formamida, desionizada</td><td>VWR Life Science</td><td>97062</td><td>para el tampón de carga de gel de formamida PAGE (secciones 6&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Software de cuantificación de imágenes en gel</td><td>Cytiva</td><td>ImageQuant TL</td><td>Para cuantificar imágenes de gel escaneadas (sección 6)</td></tr><tr><td>Desecador de vidrio</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3121150</td><td>Almacenamiento de disolventes de trifosforilación (sección 2)</td></tr><tr><td>Soportes sólidos de L-RNA CPG, 1.000&Aring;, a granel</td><td>ChemGenes</td><td>N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10</td><td>Síntesis de oligonucleótidos de L-ARN (sección 1)</td></tr><tr><td>Plantilla de cabeza de martillo de L-RNA</td><td>preparada en casa18</td><td>5&prime;-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3&prime;</td><td>Para reacciones de ribozima quiral cruzada (sección 7)</td></tr><tr><td>Imprimación de L-RNA</td><td>preparada internamente18</td><td>5&prime;-fluoresceína-GGCUCGA-3&prime;</td><td>Para reacciones de ribozima quiral cruzada (sección 7)</td></tr><tr><td>Fosforamiditas protegidas por L-RNA TOM ChemGenes</td><td></td><td>OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205</td><td>Síntesis de oligonucleótidos de L-RNA (sección 1)</td></tr><tr><td>Liofilizador/liofilizador</td><td>VirTis</td><td>Benchtop K</td><td>Para la concentración de oligonucleótidos (sección 5)</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado, sólido</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2670</td><td>Para reacciones de ribozima (secciones 6 y ndash; 7)</td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida, anhidra</td><td>MilliporeSigma</td><td>227056</td><td>disolvente de trifosforilación (sección 2)</td></tr><tr><td>NAP-25 Columna de desalinización (resina Sephadex G-25)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45000150</td><td>Columnas desechables de cromatografía de exclusión por tamaño de flujo por gravedad que contienen resina Sephadex G-25 (sección 5)</td></tr><tr><td>Aguja de acero inoxidable sin extracción de núcleo, 20 G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-815-410</td><td>Agujas para perforar tabiques de goma (secciones 2&ndash; 4)</td></tr><tr><td>Calculadora del coeficiente de extinción de oligonucleótidos</td><td>Herramienta OligoAnalyzer</td> de <td>tecnologías de ADN integradas</td><td>Modelo del vecino más cercano Calculadora de coeficiente de extinción de oligonucleótidos cortos de 260 nm (sección 5)</td></tr><tr><td>Solución oxidante, 0,1 M Yodo en THF/piridina/agua</td><td>Reactivo de trifosforilación</td> <td>ChemGenes</td><td>RN-1456</td> (sección 4)</tr><tr><td>Placas PAGE</td><td>Timberrock/CBS</td><td>NGP-250-BO y NO</td><td>Para PAGE (secciones 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Fuente de alimentación</td><td>de PAGE Bio-Rad Laboratories</td><td>PowerPac HV 1645056</td><td>para PAGE (secciones 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Espaciadores y peines PAGE (analíticos)</td><td>Timberrock/CBS</td><td>VGS-0725 y VGC-0714</td><td>para PAGE (secciones 6&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Espaciadores y peines PAGE (preparativos)</td><td>Timberrock/CBS</td><td>VGS-3025R y VGC-3001</td><td>para PAGE (sección 5)</td></tr><tr><td>Soporte PAGE</td><td>Timberrock/CBS</td><td>ASG-250</td><td>para PAGE (secciones 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-374-12 (Bemis PM999)</td><td>Película de sellado de cera para aparatos de trifosforilación (secciones 2&ndash; 4)</td></tr><tr><td>Termociclador PCR</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>C1000 Touch Termociclador</td><td>Para reacciones de ribozima quiral cruzada (sección 7)</td></tr><tr><td>PD 10 Columna de desalinización (resina Sephadex G-10)</td><td>MilliporeSigma</td><td>GE17-0010-01</td><td>Columnas de cromatografía de exclusión por tamaño de flujo gravitacional desechables que contienen resina Sephadex G-10, para oligonucleótidos < 15 nt (sección 5)</td></tr><tr><td>Pantallas de fósforo</td><td>Cytiva</td><td>28956480</td><td>Para la visualización de 32P ARN marcado (sección 6)</td></tr><tr><td>Reactivos de síntesis de fosforamidita</td><td>Glen Research</td><td>30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62</td><td>representativo, para la síntesis estándar de ARN/ADN (sección 1)</td></tr><tr><td>Tubo sellable con tapón de rosca de polipropileno</td><td>MilliporeSigma</td><td>BR780752</td><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL con tapón de rosca y junta tórica de silicona, para una desprotección segura de AMA ( sección 5)</td></tr><tr><td>Piridina anhidra</td><td>MilliporeSigma</td><td>270970</td><td>Disolvente de trifosforilación (sección 2)</td></tr><tr><td>Cromatografía líquida en fase reversa/espectrometría de masas de ionización por electrospray (RP-LC/ESI-MS)</td><td>Novatia</td><td>n/a</td><td>Servicio comercial para LC/MS especializado en oligonucleótidos (sección 5)</td></tr><tr><td>Septos de caucho (ID x OD 7,9 mm x 14 mm), blanco</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z564702</td><td>Septos para la preparación de disolventes de trifosforilación y TBAP (sección 2)</td></tr><tr><td>Ribozima E autorreplicante</td><td>preparado en casa14</td><td>5&prime;-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3&prime;</td><td>Para reacciones de ribozima autorreplicante (sección 6)</td></tr><tr><td>Sustrato autorreplicador A</td><td>preparado en casa14</td><td>5&prime;-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3&prime;-OH</td><td>Para reacciones de ribozima autorreplicante (sección 6)</td></tr><tr><td>Sustrato autorreplicador B, transcrito</td><td>preparado en casa14</td><td>5&prime;-pppGAGACCGCAA CUUA-3&prime;</td><td>Para reacciones de ribozima autorreplicante (sección 6)</td></tr><tr><td>Trampas de secado pequeñas, tamices moleculares de 4 & Aring;</td><td>ChemGenes</td><td>DMT-1975</td><td>Trampas de secado para fosforamiditas sintetizadoras de ADN/ARN y reactivos de trifosforilación (secciones 1&ndash; 2)</td></tr> <tr><td>Cloruro de sodio (NaCl), sal sólida</td><td>MilliporeSigma</td><td>S7653</td><td>para uso en varios tampones (secciones 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH), sal sólida</td><td>MilliporeSigma</td><td>S8045</td><td>para uso en varios tampones (secciones 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Software de ajuste de datos estadísticos</td><td>GraphPad</td><td>Prism</td><td>Para ajustar datos de PAGE analíticos a modelos cinéticos (sección 6)</td></tr><tr><td>Perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65002</td><td>Para capturar ARN marcado con biotina en reacciones de ribozima quiral cruzada (sección 7)</td></tr><tr><td></td><td>Sacarosa MilliporeSigma</td><td>84097</td><td>Para tampón de carga de urea PAGE (sección 5)</td></tr><tr><td>TBE búfer de ejecución, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific AAJ62788K3</td><td></td><td>para PAGE (secciones 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Fluoruro de tetrabutilamonio, solución 1.0 M en tetrahidrofurano</td><td>Aldrich</td><td>216143</td><td>Para eliminar los grupos protectores de 2&prime;-silil (sección 5)</td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamina (TEMED)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610801</td><td>Para polimerizar acrilamida para PAGE (secciones 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Tributilamina</td><td>MilliporeSigma</td><td>90781</td><td>Reactivo de trifosforilación (sección 2)</td></tr><tr><td>Pirofosfato de tributilamonio (TBAP)</td><td>MilliporeSigma</td><td>P8533</td><td>Reactivo de trifosforilación (sección 2)</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>MilliporeSigma</td><td>T6666</td><td>Agente tampón para uso en varios tampones (secciones 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>TWEEN20 detergente de polisorbato</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7949</td><td>Detergente neutro para uso con perlas magnéticas (Sección 7)</td></tr><tr><td>Urea</td><td>MilliporeSigma</td><td>U5378</td><td>Para PAGE y tampón de carga de gel (secciones 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-Vis</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific NanoDrop 2000, ND2000</td><td>Para medir concentraciones de oligonucleótidos (sección 5)</td></tr><tr><td>Centrífuga de vacío</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Savant Speedvac DNA130-115 Concentrador de vacío</td><td>Para eliminar AMA y THF (sección 5)</td></tr><tr><td>Xileno cianol</td><td>Bio-Rad Laboratories 1610423</td><td></td><td>Para tampón de carga de urea PAGE (sección 5)</td></tr></tbody></table>

trifosforilación química de oligonucleótidos

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

El 5′-trifosfato es una modificación esencial del ácido nucleico que se encuentra a lo largo de toda la vida y se utiliza cada vez más como una modificación funcional de los oligonucleótidos en biotecnología y biología sintética. Los oligonucleótidos 5′-trifosfatos se han preparado históricamente in vitro por métodos enzimáticos. Sin embargo, estos métodos se limitan a los oligonucleótidos naturales de ARN, tienen fuertes preferencias de secuencia y tienden a producir productos heterogéneos. Los nuevos métodos de trifosforilación química complementan tanto el costo reducido de la síntesis automatizada de oligonucleótidos por la química de la fosforamida como la amplia gama de modificaciones de nucleótidos ahora disponibles. Por lo tanto, la síntesis de trifosfatos de oligonucleótidos de secuencia y longitud arbitrarias, y que opcionalmente contienen varias modificaciones no naturales, es ahora accesible.
Este artículo presenta los métodos y técnicas apropiadas para la trifosforilación química de oligonucleótidos utilizando fosforocloridina de salicil y pirofosfato. Este método utiliza reactivos disponibles comercialmente, es compatible con la mayoría de los oligonucleótidos preparados por métodos estándar de síntesis en fase sólida y se puede completar en 2 h después de la síntesis de oligonucleótidos, antes de la desprotección y purificación. Se han demostrado dos usos de oligonucleótidos trinucleótidos químicamente trifosforilados como sustratos para enzimas catalíticas de ARN, incluida la síntesis de una versión de imagen especular de la ribozima hammerhead a partir de trifosfatos de L-ARN no biológicos.

Los oligonucleótidos deben sintetizarse utilizando protocolos estándar apropiados para las fosforamidas y el sintetizador automatizado de ADN/ARN, dejando el oligonucleótido del producto extraído del soporte sólido en la columna de síntesis plástica original, con el grupo dimetoxitritil 5ʹ-terminal eliminado para producir el 5ʹ-hidroxilo libre (sección 1). Todos los oligonucleótidos utilizados en esta demostración se prepararon utilizando resina de vidrio de poro controlado (CPG) de 1.000 Å como soporte sólido y se realizaron a escala de 0,2 o 1 μmol. Ejemplos representativos de columnas de sintetizador, resinas, reactivos y fosforamidatis se proporcionan en la Tabla de Materiales. Para reacciones a mayor escala, es posible que sea necesario ajustar los volúmenes y los tiempos utilizados en los pasos posteriores.
La reacción de trifosforilación se lleva a cabo en columna en una cámara de reacción personalizada (Figura 2, sección 3) utilizando componentes estándar disponibles comercialmente enumerados en la Tabla de Materiales y sigue el esquema ilustrado en la Figura 1 (sección 4)28. Es esencial que las condiciones se mantengan estrictamente anhidras durante la trifosforilación, y que todos los disolventes y reactivos se preparen previamente sobre tamices moleculares y se dejen secar completamente antes de su uso (sección 2). La trifosforilación suele tardar 2 h en producirse y, posteriormente, la columna lavada y seca puede tratarse de acuerdo con los procedimientos estándar de desprotección y purificación de oligonucleótidos (sección 5).
Después de la desprotección, los trifosfatos de oligonucleótidos se purifican mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante (PAGE), mostrando una sola banda principal del producto mediante retrosombrecimiento UV que se puede extirpar y eludir del gel. El producto 5′-trifosfato se separa fácilmente de los productos secundarios de reacción para oligonucleótidos cortos, como se muestra para el trinucleótido de ADN 5ʹ-trifosfatos, pppAAA y pppCCC, y el trinucleótido L-ARN 5ʹ-trifosfato pppGAA en la Figura 3A, B. Tanto los productos de 5′-hidroxilo como 5′-trifosfato para los trímeros de ADN AAA y CCC fueron extirpados e identificados por espectrometría de masas y etiquetados correspondientemente en la Figura 3A. Las bandas adicionales, como son visibles para el trímero de ADN AAA, generalmente no contienen suficiente material para recuperarse e identificarse. La presencia de estas bandas, sin embargo, se correlaciona con masas de producto adicionales en los productos de reacción no purificados (Figura 3C), que típicamente representan productos secundarios de 5′-difosfato, monofosfato y H-fosfonato, como se discute a continuación.
Después de la purificación de PAGE, se pueden eluvir oligonucleótidos más grandes utilizando el método de trituración y remojo42 y la posterior precipitación de etanol. Sin embargo, los oligonucleótidos inferiores a 15 nt no pueden precipitarse etanol de manera eficiente y, por lo tanto, requieren un procedimiento modificado para la elución en gel (paso 5.11.3). La columna de exclusión de tamaño desechable enumerada en la Tabla de materiales está clasificada solo para su uso con oligonucleótidos de más de 10 nt. Sin embargo, hemos encontrado que los oligonucleótidos tan cortos como los trímeros se pueden desalinizar de manera efectiva utilizando el protocolo recomendado por el fabricante. Sin embargo, se recomienda al desalinizar oligonucleótidos cortos (como en los pasos 5.6 y 5.11.3) que el eluido de la columna se recoja en fracciones y las fracciones de producto se identifiquen por absorbancia a 260 nm utilizando un espectrofotómetro UV-Vis. Una columna de exclusión de tamaño optimizada para oligonucleótidos más cortos se proporciona en la Tabla de Materiales como una opción alternativa. El rendimiento final de la síntesis de oligonucleótidos a escala de 1 μmole después de la purificación es de 50-300 nmol.
La trifosforilación puede confirmarse mediante espectrometría de masas, donde el producto trifosforilado tiene una masa +239,94 Da mayor que el oligonucleótido 5′-hidroxilo, aunque a menudo se observa la presencia de materiales correspondientes al 5′-di- y monofosfato (+159,96 y +79,98 Da, respectivamente). También se puede observar un producto lateral de 5′-H-fosfonato con una masa +63.98 Da de la masa 5′-OH, y los altos niveles de este producto indican que las condiciones durante la trifosforilación no fueron lo suficientemente anhidras. Antes de la purificación, los oligonucleótidos desprotegidos generalmente mostrarán todos estos productos (Figura 3C), mientras que el material purificado mostrará un pico correspondiente al producto 5′-trifosfato junto con 5'-di- y monofosfatos (Figura 3D, E).
La espectrometría de masas por sí sola generalmente no dará una medida rigurosa de la pureza de 5'-trifosfato debido a las tasas diferenciales de ionización y fragmentación del trifosfato durante la ionización. Para medir la pureza del producto final, se recomienda la cromatografía líquida de fase inversa y la ESI-MS en tándem (RP-LC/ESI-MS), especialmente para oligonucleótidos más largos. El análisis de D-RNA 5ʹ-trifosfatos pppACGAGG y pppGAGACCGCAACUUA por RP-LC/ESI-MS (Figura 4A,B, respectivamente) muestra la pureza típica del producto final, que contiene 20% de 5ʹ-difosfato ya que estas dos especies son difíciles de separar cuando están presentes en oligonucleótidos más largos.
Los oligonucleótidos sintéticos de 5′-trifosfato suelen funcionar tan bien o mejor que los materiales preparados enzimáticamente en estudios bioquímicos. En la sección 6, a modo de ejemplo, se compararon sustratos de ARN de 5′-trifosfato de 14 nt preparados sintéticamente o mediante transcripción in vitro en una reacción de autorreplicación catalizada por ARN 14,15,43,44,45. La ribozima E cataliza la unión de los sustratos A y B para producir una nueva copia de E en una reacción autocatalítica capaz de crecimiento exponencial (Figura 5A). Los componentes E y 32A marcados con P se prepararon mediante transcripción in vitro, y el sustrato trifosforilado B se preparó sintéticamente, como se describió anteriormente, o mediante transcripción in vitro 14. El progreso de la reacción de autorreplicación se monitoreó mediante la toma de muestras periódicas que se analizaron mediante la desnaturalización de PAGE y se cuantificaron a través de un escáner de gel fluorescente / fosforescente. Los datos resultantes, ajustados a una función de crecimiento logístico, revelaron que el sustrato B transcrito o sintético soporta un crecimiento exponencial, pero el B sintético da una cantidad ligeramente mayor de producto (Figura 5B). Este resultado puede reflejar heterogeneidad compositiva en el extremo 5′ del ARN preparado por transcripción in vitro 23,24.
La trifosforilación química también permite la síntesis de trifosfatos de oligonucleótidos que no se pueden preparar biológicamente, ya sea in vitro o en células. En la sección 7, se utilizaron trifosfatos de oligonucleótidos no biológicos compuestos de L-ARN, el enantiómero del ARN-D natural, preparado como en las secciones 1-5, como sustratos para la ribozima 27.3t de la polimerasa D-ARN "cross-quiral" (Figura 6A), que cataliza la polimerización dirigida por plantilla de un producto de L-ARN más largo a partir de oligonucleótidos cortos de L-ARN 5′-trifosfatos de manera general de secuencia. Como ejemplo, la ribozima puede sintetizar una versión L-ARN del motivo de autoesclava del martillo (Figura 6B)18. Los trifosfatos de trinucleótidos de L-ARN purificados se combinaron con un cebador de L-ARN marcado con fluoresceína y una plantilla de L-ARN (Figura 6C) y reaccionaron con la ligasa quiral cruzada. Las muestras en el transcurso de la reacción fueron analizadas por PAGE y fotografiadas utilizando un escáner de gel fluorescente / fosforescente para demostrar la síntesis de una versión de L-ARN de la ribozima de martillo codificada por la plantilla (Figura 6D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig03.jpg"> Figura 3: Purificación de trinucleótidos 5ʹ-trifosfatos. (A) Análisis PAGE (visualizado por UV-back-shadowing) de trifosforilación de trinucleótidos de ADN tri-desoxiadenosina (AAA, azul) y tri-desoxicitidina (CCC, rojo), sobrecargados intencionalmente para visualizar productos secundarios menores. Tanto el producto 5ʹ-trifosfato (ppp) como el material de partida 5ʹ-hidroxilo (OH) fueron extirpados e identificados por MALDI-MS. (B) PÁGINA preparatoria de trifosforilación de L-ARN trinucleótido GAA, con la banda principal del producto extirpada e identificada como el 5ʹ-trifosfato (ppp) por ESI-MS. (C) MALDI-MS de productos de reacción crudos después de la desprotección y (D) productos purificados de (A). 5ʹ-trifosfato (ppp; pppAAA esperado 1.119 Da, observado 1.118 Da; pppCCC esperado 1.047 Da, observado 1.046); 5ʹ-difosfato (pp), 5ʹ-monofosfato (p), 5ʹ-hidroxilo (OH) y 5ʹ-H-fosfonato (Hp) están etiquetados. (E) Espectro de masas descontornado de inyección directa ESI-MS de producto aislado de 5ʹ-trifosfato de (B), con picos identificados marcados (esperado 1,181.6 Da, observado 1,181.0 Da). También se observan productos de 5ʹ-difosfato (pp), al igual que picos de iones de sodio para los productos tri- y di-fosfato (+22 Da). Los picos de contaminantes comunes están etiquetados con un asterisco. Para facilitar la comparación, los espectros de masas se normalizaron a la intensidad más alta medida en cada espectro y se informan como un porcentaje relativo a ese valor. Abreviaturas: PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida; MALDI-MS = desorción/ionización láser asistida por matriz; ESI-MS = espectrometría de masas de ionización por electropulverización. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig04.jpg"> Figura 4: RP-LC analítico de 6 nt y 14 nt D-RNA oligonucleótidos trifosfatos. (A) 5ʹ-pppACGAGG-3ʹ y (B) 5ʹ-pppGAGACCGCAACUUA-3ʹ. Tandem ESI-MS identificó el pico principal de ambos (~ 70%) como el 5ʹ-trifosfato (ppp), con menores cantidades del 5ʹ-difosfato (pp). Abreviaturas: RP-LC = cromatografía líquida de fase inversa; nt = nucleótidos; ESI-MS = espectrometría de masas de ionización por electropulverización. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig05.jpg"> Figura 5: Comparación de sustratos de oligonucleótidos 5ʹ-trifosfato preparados por síntesis química o transcripción in vitro. (A) La ribozima E autorreplicante liga el ARN A y el ARN B trifosforilado 5′. (B) Comparación de reacciones de autorreplicación utilizando 10 μM A y 10 μM B, ya sea sintético (círculos abiertos) o transcrito in vitro (círculos llenos). (B) Los datos se ajustaron a la ecuación de crecimiento logístico: [E] = a / (1 + b e-ct), donde a es el rendimiento final, b es el grado de sigmoidicidad y c es la tasa de crecimiento exponencial. Las tasas de crecimiento para las dos reacciones fueron idénticas, a las 1.14 h-1, mientras que la extensión final fue un 10% más alta para las reacciones con B sintético. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig06.jpg"> Figura 6: Polimerización de L-ARN quiral cruzado con una ribozima. (A) La ribozima de la polimerasa D-RNA 27.3t, que cataliza la ligadura dependiente de plantillas de L-ARN. (B) El producto L-ARN sintetizado por 27.3t forma parte de un motivo de endonucleasa de martillo. (C) Polimerización de L-ARN catalizada por 27.3t utilizando una plantilla de L-ARN biotinilada (marrón), un cebador de L-ARN marcado al final (magenta) y cuatro trifosfatos de trinucleótidos de L-ARN (cian), preparados sintéticamente. (D) Análisis PAGE de productos de extensión de (B) a las 4 h y 24 h, mostrando cada incorporación de trinucleótidos hasta el producto de longitud completa (punto negro). El cebador de L-ARN no reaccionado se incluye como marcador de referencia. Abreviaturas: PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida; M = marcador de referencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Los oligonucleótidos 5′-trifosfatos son componentes ubicuos en vías biológicas esenciales y han visto un uso creciente en aplicaciones biotecnológicas. Aquí, describimos técnicas para la síntesis y purificación rutinaria de oligonucleótidos 5′-trifosfatos, a partir de oligonucleótidos preparados por técnicas de síntesis automatizadas estándar.

Trifosforilación química de oligonucleótidos

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

La trifosforilación es una modificación ubicua de 5'del ARN en biología y se utiliza cada vez más en aplicaciones biotecnológicas. El protocolo descrito aquí permite la 5'trifosforilación de cualquier oligonucleótido preparado por síntesis automatizada estándar. La trifosforilación química funciona en oligonucleótidos que contienen ARN, ADN o ácido nucleico no natural.Aquí, el L-ARN zurdo trifosforilado, el enantiómero del D-ARN biológico, se sintetiza purificado y se utiliza en una reacción de ribosoma. La trifosforilación se realiza después de la síntesis automatizada de oligonucleótidos y antes de la desprotección. Estos pasos no se muestran aquí, pero los investigadores deben estar familiarizados con los métodos estándar para ambos.Para comenzar, asegúrese de que el espacio de trabajo para la fosforilación tenga un colector de gas con al menos dos líneas y el burbujeador conectado a una fuente de argón seco con presión ajustable, ya que la reacción de trifosforilación debe realizarse bajo argón. Luego conecte jeringas de plástico de un mililitro a las líneas para facilitar la conexión al aparato de reacción. A continuación, recoja el equipo, incluidas jeringas de plástico de un mililitro, una llave de paso de polipropileno de tres vías, agujas no punteras, tubos de polipropileno de 1,5 mililitros, una pequeña espátula de metal, y guárdelos en un recipiente sellado o desecador con un desecante a temperatura ambiente durante al menos un día antes de su uso.Bajo presión de argón, retire 30 mililitros de 1, 4-dioxano anhidro de una botella sellada. Transfiera a una botella de vidrio seca de 30 mililitros y agregue una trampa de secado. Selle con septos de goma y guárdelo en un desecador con desecante.Del mismo modo, prepare 30 mililitros de N, N-dimetilformamida, acetonitrilo y la mezcla de tres partes de dioxano y una parte de piridina por volumen. Prepare la solución de TBAP mezclando pirofosfato de tributilamonio sólido con dimetilformamida y tributilamina en una botella de vidrio de 30 mililitros como se describe en el manuscrito. Agregue tres capturas de dibujo.Selle la botella con un tabique de goma bajo argón y burbujee con argón durante 30 minutos. Después de preparar un oligonucleótido con un 5'hidroxilo libre en una columna de síntesis utilizando un sintetizador automatizado de ADN/ARN. Prepare la cámara retirando el émbolo de una jeringa seca de un mililitro.Corte la parte superior de la jeringa con unas tijeras o una cuchilla de afeitar y conecte la jeringa a la columna de síntesis. En la parte superior de la jeringa, conecte la llave de paso de tres vías y conecte la entrada lateral de la llave de paso a la fuente de argón seco con el burbujeador para que la entrada superior de la llave de paso actúe como el puerto de inyección de reactivo. Asegure estos operadores a un soporte con abrazaderas y selle todas las juntas aguas arriba con una película de sellado de cera.Luego ajuste la llave de paso para que el puerto de inyección esté cerrado y el aparato esté abierto a la fuente de argón. Cierre el burbujeador y deje que el argón a baja presión fluya a través de la cámara de acción durante cinco minutos. Después de volver a abrir el burbujeador, coloque una jeringa en la parte inferior de la columna de síntesis, que será la jeringa de desecho.A continuación, tire del argón a través de la columna repetidamente usando la jeringa de desecho y luego vuelva a conectar la jeringa con el émbolo completamente empujado. Para agregar un reactivo o disolvente, conecte una aguja a la fuente de argón seco e insértela en el reactivo o en el tabique de la botella de disolvente, teniendo cuidado de no sumergir la aguja en el contenido de la botella. Luego, ensamble una jeringa seca con una aguja e insértela en el tabique del reactivo o del frasco de solvente sin sumergirlo en el contenido del frasco.Después, llene la jeringa con argón, retire la aguja del tabique y expulse el argón. Después de llenar la jeringa con argón y expulsar una vez más, llene la jeringa con el volumen requerido de disolvente o reactivo bajo presión de argón. Ajuste la llave de paso para que la fuente de argón esté cerrada y el puerto de inyección esté abierto.Una vez que la parada en el aparato se ajuste rápidamente, retire la jeringa llena y la aguja del frasco de origen, limpie cualquier disolvente pegado al costado o la punta de la aguja y luego inserte la aguja en el puerto de inyección. Después de expulsar un reactivo a la anticámara de los operadores, retire la aguja y cierre el puerto de inyección mientras vuelve a abrir el aparato a la fuente de argón. Extraiga suavemente el líquido de la anticámara a través de la columna de síntesis utilizando la jeringa de desecho para que todo el líquido ahora se mantenga en la jeringa de desecho.Ahora empuje lentamente la solución hacia arriba en la columna de síntesis, asegurándose de que no haya burbujas de gas en la columna. Para mezclar o agitar, tire suavemente de la solución hacia arriba y hacia abajo sobre la columna con la jeringa de desecho. Para eliminar un reactivo o disolvente de la columna, tire lentamente de la solución hacia la jeringa de desecho.Después de que la mayor parte de la solución haya pasado a la jeringa de desecho, tire del argón para eliminar el disolvente restante de la columna. A continuación, retire la película de sellado de cera alrededor de la junta de la jeringa de desecho. A continuación, retire la jeringa y deseche la solución de desecho.Después, reemplace la jeringa de desecho con una jeringa seca nueva y vuelva a sellar la articulación. Después de ensamblar el aparato de trifosforilación, comience la reacción de trifosforilación agregando 200 microlitros de piridina dioxano a la anticámara como se demostró anteriormente. Pero no tire de la muestra a la columna de síntesis todavía.Después de disolver SalPCl en dioxano como se describe en el manuscrito, agréguelo a la anticámara y cárguelo en la columna de síntesis con una jeringa seca. Luego deje que reaccione durante 15 minutos y luego retire y deseche la solución de SalPCl con una jeringa de desecho como se demostró anteriormente. Inmediatamente después de retirar la solución de SalPCl, agregue 250 microlitros de solución TBAP a la anticámara y cárguelos en la columna de síntesis.Deja que reaccione 20 minutos con agitación y desecha como se describió anteriormente. Posteriormente, lave la columna con 0,5 mililitros de N, N-dimetilformamida, luego 0,5 mililitros de acetonitrilo, retirando el disolvente después de cada adición. Después de agregar la solución oxidante, retirarla y lavar la columna con acetonitrilo nuevamente utilizando el mismo procedimiento mostrado, desmonte el aparato y lave la columna con cinco mililitros de acetonitrilo.Después, seca la columna. Separar el oligonucleótido trifosforilado del soporte sólido y desproteger utilizando protocolos estándar como se describe en el manuscrito. A continuación, disuelva el oligonucleótido seco desprotegido en un tampón de carga de urea, se caliente a 80 grados centígrados, luego se cargue en un gel de poliacrilamida y se ejecute durante una o dos horas a 25 a 35 vatios.Al final de la electroforesis en gel, después de quitar la placa de gel, desensémbela y envuelva el gel en una película de cloruro de polivinilo. A continuación, identifique las bandas del producto mediante la sombra posterior con luz UV de 254 nanómetros e elimine la banda principal del producto con una cuchilla de afeitar. Triture el gel extirpado extruyéndolo a través de una jeringa de plástico o mecánicamente.Para oligonucleótidos inferiores a 15 nucleótidos, eluya en tres veces el volumen de gel de agua libre de nucleasa durante al menos 12 horas con agitación o agitación. Luego retire las piezas de gel sólido pasando la solución a través de una jeringa equipada con un filtro de 0,2 micrómetros y concéntrese por liofilización. Después de la concentración, elimine las sales residuales y los saludos utilizando una columna de exclusión de tamaño desechable y concéntrese por liofilización como se demostró anteriormente.Después de preparar 10 microlitros de una solución de ARN que contiene ribozima polimerasa y plantilla de imprimación de ARN-L y trinucleótidos de trifosfato como se describe en el manuscrito, recocirla calentándola a 90 grados Celsius durante un minuto y enfriándola a 23 grados Celsius a 0.2 grados Celsius por segundo en un termociclador pcR. Después de incubar la solución de ARN a 17 grados centígrados, detenga la reacción agregando 10 microlitros del doble de la concentración del tampón de inicio a medida que avanza la reacción, tome 10 alícuotas de microlitros y apague con cinco microlitros de EDTA molar de 0.5 a pH 8 y procese cada muestra para aislar el ARN como se describe en el manuscrito. Disuelva el ARN precipitado en 10 microlitros de tampón de carga de gel formalizado y prepare un cebador etiquetado final sin reaccionar como se describe en el texto.Una vez preparadas las muestras, calienta a 80 grados centígrados. Cargue cinco microlitros de la muestra en cada pozo y haga funcionar el gel a 40 vatios durante aproximadamente 40 minutos. Después de retirar la placa de gel del soporte, escanee con un escáner de gel fluorescente o fosforescente para visualizar los productos de extensión de L-ARN quiral cruzado.Después de la purificación en gel, el sombreado UV revela la presencia de 5'trifosfato como un solo producto principal como se muestra para los trímeros de ADN AAA y CCC y el trímero de ARN L-RNA GAA. El producto del lado 5'hidroxilo a menudo es visible como una banda de migración más lenta, que fue aislada e identificada por espectrometría de masas para trímeros de ADN. Las bandas adicionales durante la purificación del gel se correlacionan con los productos secundarios de 5'difosfato, monofosfato y H-fosfonato en espectrometría de masas de los productos de reacción no purificados.Los productos de 5'trifosfato muestran un pico de masa primaria correspondiente al 5'trifosfato junto con masas de 5'di y monofosfato. Los trinucleótidos de ARN L relacionados químicamente con el trifosfato se utilizaron con un cebador de L-ARN y una plantilla de L-ARN en una reacción de polimerización de ARN analizada por PAGE y fotografiada utilizando un escáner de gel fluorescente. El producto extendido marcado por círculos negros demostró la síntesis de una versión L-RNA de la ribozima hammerhead codificada por la plantilla.La exposición al agua durante la trifosforilación reducirá el rendimiento. Siga los pasos para preparar reactivos secos y ensamblar el aparato de reacción cuidadosamente. Mueva los fluidos a través del aparato lentamente para evitar la rotura de los sellos.La trifosforilación química es esencial para preparar trifosfatos de oligonucleótidos no biológicos, incluido el ARN zurdo. Esto ha permitido la síntesis cruzada de ribozimas quirales de las versiones de imagen especular de las moléculas de ARN que se encuentran en la biología.

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