Métodos in vitro ascendentes para evaluar la organización ultraestructural, la remodelación de la membrana y el comportamiento de sensibilidad a la curvatura de las septinas

Usando este protocolo, visualizamos la organización de proteínas filamentosas citoesqueléticas en sustratos de patrón que muestran varias curvaturas. Podemos probar la sensibilidad de la curvatura. La resolución de las imágenes de microscopio electrónico de barrido es lo suficientemente alta como para que se visualicen las organizaciones a escala nanométrica.

Los métodos que utilizamos para la fijación son lo suficientemente suaves como para preservar la organización intraestructural de la proteína. Esto permanece en el ámbito de la investigación fundamental para comprender el comportamiento de los filamentos citoesqueléticos. Comience diseñando un adhesivo óptico Norland ondulado, o réplica de NOA, en un entorno de sala limpia a partir de patrones ondulados de polidimetilsiloxano ondulado de 250 nanómetros de amplitud y periodicidad lateral de dos micrómetros.

Para ello, deposite cinco microlitros de NOA líquido en un cubreobjetos de vidrio circular de un centímetro de diámetro y luego coloque la plantilla PDMS en la gota. Trate el conjunto con luz UV a 320 nanómetros durante cinco minutos para fotopolimerizar el NOA líquido en una película delgada de polímero. Una vez hecho esto, retire suavemente la plantilla PDMS de la cubierta con el NOA recién polimerizado.

Trate la película de NOA con un filtro de plasma de aire durante cinco minutos para hacer que la superficie sea hidrófila. Prepare una solución de pequeñas vesículas unilamelares, o SUV, como se describe en el manuscrito, y obtenga los SUV resuspendiendo una película lipídica seca en el tampón de observación bajo la sonicación en un sonicador de baño durante cinco a 10 minutos hasta que la solución sea transparente. Más tarde, inserte los cubreobjetos que soportan los patrones de NOA dentro de los pocillos de las cajas de cultivo celular e incube los patrones de NOA recién descargados con 100 microlitros de una solución SUV de un miligramo por mililitro durante 30 minutos a temperatura ambiente para generar una bicapa lipídica soportada.

Para retirar el SUV sin fusionar, enjuague bien los lados seis veces con el tampón de sepina baja en sal sin dejar que la muestra se seque completamente entre dos lavados. Diluir la solución madre de septina octomérica en un tampón de septina baja en sal hasta concentraciones finales, que van de 10 a 100 nanomolares y volúmenes de un mililitro. Luego, incubar la solución de proteína en los portaobjetos durante una hora a temperatura ambiente.

Lave los portaobjetos NOA que contienen bicapas lipídicas soportadas fusionadas e incube proteínas con tampón de septina baja en sal. Reemplace el tampón de septina baja en sal con solución fijadora de glutaraldehído al 2% en tampón de cacodilato de sodio molar de 0.1, precalentado a 37 grados centígrados, y deje que la reacción continúe durante 15 minutos, y lave la muestra fija tres veces, cinco minutos cada uno con cacodilato de sodio 0.1 molar. Después del lavado, incube la muestra en la solución fijadora de tetróxido de osmio, luego el ácido tánico filtrado y finalmente el acetato de uranilo filtrado durante 10 minutos cada uno.

Lave la muestra tres veces en agua destilada después de cada solución. Incubar la muestra en serie en soluciones de etanol a partir del 50% al 100% durante dos o tres minutos cada una. Transfiera los portaobjetos de vidrio dentro del secador de punto crítico precargado con etanol y siga las instrucciones del fabricante para el secado.

Como las muestras secas son altamente hidroscópicas, cúbralas inmediatamente uniendo el cubreobjetos a los talones. Luego agregue una tira de pintura plateada a la cara superior del deslizamiento de la cubierta sin crear deglomerados de pintura. Asegúrese de que la conexión con el talón sea satisfactoria.

Cuando la muestra se evapore por completo, utilice un aparato equipado con un cabezal de pulverización catódica de magnetrón de plasma y una etapa planetaria rotativa, y siga los protocolos estándar proporcionados por el fabricante. Realice la pulverización catódica a 120 miliamperios durante 60 segundos para eliminar la capa de óxido en la superficie. Luego deposite 1,5 nanómetros de tungsteno con un monitor de espesor de película a 90 miliamperios y una distancia de trabajo de 50 mililitros.

Posteriormente, almacene las muestras al vacío para protegerlas del aire ambiente hasta y durante los análisis SEM. Para lograr una alta solución de imágenes mediante la detección de los electrones secundarios con el detector interior, ajuste el voltaje de aceleración a tres kilovoltios y la corriente del haz a una apertura de 20 micrómetros. Para las observaciones, use resoluciones que van desde 21.25 nanómetros por píxel hasta 1.224 nanómetros por píxel.

Utilice una resolución de 5,58 nanómetros por píxel para el análisis de datos. Establezca la distancia de trabajo entre uno y dos milímetros para la observación de alta resolución y alrededor de tres milímetros si se requiere una mayor profundidad de campo. Ajuste la velocidad de escaneo y la integración de la línea continuamente para garantizar una relación señal / ruido constante con un tiempo de adquisición de alrededor de 30 a 45 segundos por imagen.

El análisis representativo ilustra el efecto del material depositado sobre los filamentos de septina sobre patrones PDMS ondulados con 1,5 nanómetros de platino y 1,5 nanómetros de tungsteno. Se observó que las vesículas unilamelares gigantes desnudas, o GUV, eran perfectamente esféricas. Después de la deformación inducida por septina, las vesículas aparecieron facetadas y las deformaciones permanecieron estáticas, y por lo tanto no fluctuaron.

A concentraciones más altas de las septinas, se observaron deformaciones periódicas en las vesículas. El autoensamblaje de los filamentos de septina unidos a grandes vesículas unilamelares, o LUV, se examinó con una imagen de microscopía crioelectrónica y se obtuvo la reconstrucción 3D a partir de una serie inclinada. La disposición dependiente de la curvatura de los filamentos de septina se visualizó mediante microscopía electrónica de barrido.

A baja magnificación, un patrón ondulado con la periodicidad de curvaturas negativas y positivas era visible. La organización ultraestructural de los filamentos de septina se observó con mayor aumento. Los NOA deben despegarse suavemente para evitar la degradación.

Después de la obtención de imágenes, se puede realizar un análisis de imágenes para cuantificar las características de la ultraestructura visualizadas por SCM, como el espaciado del filamento y la orientación del filamento. El presente método se ha aplicado a las septinas, pero también podría usarse para otras proteínas citoesqueléticas o proteínas que se organizan como filamentos largos y, por lo tanto, son sensibles a la curvatura.