Name: Microfresado de control numérico computarizado de un dispositivo acrílico microfluídico con una restricción escalonada para inmunoensayos magnéticos basados en nanopartículas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprende a fabricar dispositivos microfluídicos de acrílico mediante microfresado CNC para inmunoensayos magnéticos cuantitativos. Este método de bajo costo no requiere sala limpia y ofrece resultados comparables a ELISA.

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Este trabajo fue apoyado por el Conacyt, México bajo la subvención 312231 del Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación, y por la AMEXCID y la Secretaría de Relaciones Exteriores de México (SRE) bajo la subvención "Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2". JAHO agradece a Conacyt México por su beca de doctorado.

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Se fabricó un dispositivo microfluídico acrílico para inmunoensayos utilizando nanopartículas como inmunosoporte utilizando una técnica de micromolienda. El método de fabricación directa sobre el sustrato tiene la ventaja de evitar el uso de un molde maestro y el tiempo y costes que ello implica. Sin embargo, se limita a la creación rápida de prototipos y la fabricación de dispositivos de alto volumen.
Aquí, utilizamos una plataforma piezoeléctrica accesoria previamente informada para la fresa...

En los últimos años, la microfluídica ha desempeñado un papel importante en las técnicas de inmunoensayo1. La tecnología de miniaturización tiene muchas ventajas sobresalientes en comparación con los inmunoensayos tradicionales, como la reducción del consumo de muestras y reactivos, tiempos de incubación más cortos, intercambio eficiente de soluciones y mayor integración y automatización2.
Además, los sistemas microfluídicos en inmunoensayos, en asociación con nanopartículas magnéticas como inmunosoporte, reducen considerablemente los tiempos de incubación, logrando una alta sensibilidad de detección debido al aumento de la relación superficie-volumen3. El movimiento browniano de las partículas mejora la cinética de reacción durante la formación del complejo antígeno-anticuerpo 4,5. Además, las propiedades magnéticas de las nanopartículas proporcionan la versatilidad para ser integradas en diferentes configuraciones de dispositivos microfluídicos, lo que las convierte en un candidato ideal para la señalización y captura de moléculas en sistemas de biodetección miniaturizados en chip5. Sin embargo, las fuerzas magnéticas son significativamente más débiles que las fuerzas de arrastre a escala nanométrica debido a la alta relación superficie-volumen6. Por lo tanto, la captura de nanopartículas para pasos cruciales de inmunoensayo, como el lavado y la detección, puede ser un desafío, y un imán convencional es insuficiente4.
Una forma eficiente de manipular las nanopartículas es el uso de una trampa magnética microfluídica formada por micropartículas de hierro, que se empaquetan en una estructura microfluídica3. Por lo tanto, cuando un imán externo se acerca, se crea una interacción compleja dentro del medio poroso magnetizado entre las fuerzas magnéticas y de flujo. La fuerza magnética que actúa sobre las nanopartículas es lo suficientemente fuerte como para capturarlas y resistir el arrastre de flujo 3,4,7. Este enfoque requiere técnicas de microfabricación que logren resoluciones del orden de unos pocos micrómetros para generar estructuras micrométricas que retengan las micropartículas.
Las técnicas actuales de microfabricación permiten la fabricación de alta resolución de estructuras desde unas pocas micras hasta cientos de nanómetros8. Sin embargo, muchas de estas técnicas requieren equipos especializados, costosos o complicados. Una de las principales dificultades es la necesidad de una sala limpia para la fabricación de moldes, que sigue siendo costosa y requiere mucho tiempo 8,9. Recientemente, los ingenieros microfluídicos han superado este inconveniente mediante el desarrollo de una variedad de métodos de fabricación alternativos, con varias ventajas, como costos reducidos, tiempos de respuesta más rápidos, materiales y herramientas más baratos y una mayor funcionalidad8. De esta manera, el desarrollo de nuevas técnicas de microfabricación trajo métodos de bajo costo, no de sala limpia, que logran resoluciones tan bajas como 10 μm8. El modelado se puede utilizar directamente sobre un sustrato sin generar un patrón de moldeo costoso, evitando así un proceso que consume mucho tiempo. Los métodos de fabricación directa incluyen fresado CNC, ablación láser y litografía directa8. Todos estos métodos son adecuados para producir canales de alta relación de aspecto en una amplia gama de materiales, independientemente de su dureza9, lo que permite geometrías, comportamientos físicos y cualidades nuevas y ventajosas en dispositivos microfluídicos8.
El microfresado CNC crea estructuras a microescala utilizando herramientas de corte que eliminan el material a granel de un sustrato y es un método de fabricación eficaz para dispositivos microfluídicos10,11. La técnica de microfresado puede ser útil en aplicaciones microfluídicas para crear microcanales y características directamente en la superficie de trabajo, ofreciendo una ventaja clave: una pieza de trabajo se puede fabricar en poco tiempo (menos de 30 min), reduciendo significativamente el tiempo de respuesta desde el diseño hasta el prototipo12. Además, la amplia disponibilidad de accesorios de corte de diferentes materiales, tamaños y formas hace de las fresadoras CNC una herramienta adecuada que ha permitido la fabricación de diferentes características en muchos tipos de materiales desechables de bajo costo13.
Entre todos los materiales comúnmente utilizados en micromolienda, los termoplásticos siguen siendo una opción líder debido a sus muchas propiedades favorables y compatibilidad con aplicaciones biológicas10,14. Los termoplásticos son un sustrato atractivo para los sistemas microfluídicos debido a sus importantes ventajas para el desarrollo de sistemas analíticos desechables de bajo costo9. Además, estos materiales son altamente susceptibles a procesos de fabricación de alto volumen, lo que los hace adecuados para la comercialización y la producción en masa. Por estas razones, los termoplásticos como el PMMA han sido considerados materiales confiables y robustos desde los primeros años de la microfluídica10. Se han descrito diferentes protocolos para fabricar canales cerrados en termoplásticos, como la unión con solventes15, la unión térmica 16 y la unión de tratamiento superficial ultravioleta (UV) / ozono17.
En muchos casos, la resolución de posicionamiento alcanzada con las microfresadoras convencionales no es suficiente para algunas aplicaciones microfluídicas que requieren estructuras menores de 10 μm. La micromolienda de gama alta tiene suficiente resolución. Desafortunadamente, debido a los altos precios, su uso está limitado a un puñado de usuarios12. Anteriormente, nuestro grupo de investigación informó de la fabricación y manipulación de una herramienta de bajo coste que permite mecanizar estructuras de menos de 10 μm, superando la resolución de las fresadoras convencionales12. El accesorio es una plataforma fabricada mediante impresión 3D con electrónica simple, que contiene tres actuadores piezoeléctricos. La superficie contiene juntas en forma de bisagra que permiten levantarla cuando los elementos piezoeléctricos actúan simultáneamente. El desplazamiento del eje Z se puede controlar con una resolución de 500 nm y una precisión de ±1,5 μm12.
Este artículo presenta los pasos del proceso de fabricación de un dispositivo acrílico (PMMA) a través de una técnica de microfresado. El diseño del chip consiste en un canal principal de 200 μm de ancho y 200 μm de alto y un canal lateral con las mismas dimensiones para purgar el flujo de los reactivos. En la región central, el canal está interrumpido por una restricción física de solo 5 μm de altura, fabricada con la plataforma piezoeléctrica impresa en 3D hecha por este grupo12, para capturar micropartículas magnéticas que forman una trampa magnética para nanopartículas colocando un imán externo. Mostramos el funcionamiento del dispositivo microfluídico realizando un inmunoensayo para detectar un anticuerpo comercial utilizando lisozima como antígeno modelo conjugado a nanopartículas magnéticas de 100 nm. Este dispositivo combina diferentes características que lo hacen único4: el uso de nanopartículas magnéticas como soporte inmunológico reduce el tiempo total de prueba de horas a minutos; el uso de una enzima fluorogénica para la detección permite límites de detección que son comparables a los de los ensayos estándar de inmunoadsorción ligada a enzimas (ELISA); y el uso de un termoplástico como material de fabricación lo hace compatible con la producción en masa, lo que no fue el caso de las trampas magnéticas de nanopartículas microfluídicasanteriores 3, y lo convierte en un excelente candidato para desarrollar POCT.

<table><tbody><tr><td>0.008 Fresa</td><td>KYOCERA SGS&nbsp;</td><td>2204</td><td>2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12</td></tr><tr><td>0.032 Fresa</td><td>KYOCERA SGS&nbsp;</td><td>2228</td><td>2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12</td></tr><tr><td>Micropartículas de carbonilo-hierro&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44890</td><td>7 &mu; m&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Fermont</td><td>6201</td><td>Peligro para la salud: Moderado Inflamabilidad: Ninguno Reactividad: Ninguna Peligro de contacto: Moderado&nbsp;</td></tr><tr><td>Cámara CMOS Moment</td><td>Teledyne Photometrics</td><td></td><td>Tecnología de sensor: CMOS Eficiencia cuántica: 73% Tamaño de píxel: 4.5 y micro; m x 4.5 y micro; m Interfaces compatibles: USB 3.2 Gen 2</td></tr><tr><td>Dr Engrave Software</td> de grabado <td>Roland DGA Corporation</td><td></td><td>para diseñar y crear la trayectoria de grabado en la superficie</td></tr><tr><td>Campana de extracción</td><td>Desconocido</td><td>Desconocido</td> Tubo <td></td></tr><tr><td>de plástico flexible</td><td>Tygon</td><td>AAD04103</td><td>ID = 0.020, OD = 0.060</td></tr><tr><td>Microsope de fluorescencia&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>Axio Vert.A1</td><td></td></tr><tr><td>Aguja dispensadora de alta precisión</td><td>Loctite</td><td>98612</td><td></td></tr><tr><td>Aplicación de controlador piezoeléctrico casero</td><td>LabView&nbsp;</td><td></td><td>Consulte la referencia 12 para obtener más detalles.</td></tr><tr><td>Loctite 495 adhesivo instantáneo</td><td>Henkel</td><td>49503</td><td>Aplicar con punta de micropipeta o aguja dosificadora&nbsp;</td></tr><tr><td>MagJET Rack</td><td>de separación termocientífico</td><td></td><td>12 x 1,5 mL</td></tr><tr><td>Prensa mecánica</td><td>Fresadora</td><td></td><td></td>casera</tr><tr><td></td><td>Roland</td><td>MDX-50</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma piezoeléctrica&nbsp;</td><td>Hecho en</td><td></td> casa <td>Ver referencia 12</td></tr><tr><td>Polimetilmetacrilato - Lámina - PMMA, Acrílico</td><td>Goodfellow</td><td>ME303018/1</td><td>Espesor: 1,3 mm, Transparencia: Claro/Transparente</td></tr><tr><td>PVCamSoftware de prueba</td><td>Teledyne Photometrics</td><td>Versión 3.10.107&nbsp;</td><td>Software de adquisición de imágenes</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon</td><td>SMZ 7457</td><td></td></tr><tr><td>SuperMag Carboxyl Beads</td><td>Ocean NanoTech</td><td>KSC0100</td><td>100 nm</td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>kd Scientific</td><td>&nbsp; KDS200</td><td>Puede contener hasta dos jeringas</td></tr><tr><td>Baño Utrasonic</td><td>Branson</td><td>2800</td><td></td></tr><tr><td>VPanel software&nbsp;</td><td>Sistema operativo Windows</td><td>versión 1.0.3.0</td><td>Software para el control de la microfresadora</td></tr></tbody></table>

microfresado de control numérico computarizado de un dispositivo acrílico microfluídico con una restricción escalonada para inmunoensayos magnéticos basados en nanopartículas

Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-Based Immunoassays

Los sistemas microfluídicos han mejorado enormemente las técnicas de inmunoensayo. Sin embargo, muchas técnicas de microfabricación requieren equipos especializados, costosos o complicados, lo que hace que la fabricación sea costosa e incompatible con la producción en masa, que es una de las condiciones previas más importantes para que las pruebas en el punto de atención (POCT) se adopten en entornos de bajos recursos. Este trabajo describe el proceso de fabricación de un dispositivo de acrílico (polimetilmetacrilato, PMMA) para pruebas de inmunoensayo enzimático conjugado con nanopartículas utilizando la técnica de microfresado de control numérico computarizado (CNC). El funcionamiento del dispositivo microfluídico se demuestra mediante la realización de un inmunoensayo para detectar un anticuerpo comercial utilizando lisozima como antígeno modelo conjugado a nanopartículas magnéticas de 100 nm. Este dispositivo integra una restricción física escalonada de solo 5 μm de altura, utilizada para capturar micropartículas magnéticas que forman una trampa magnética colocando un imán externo. De esta manera, la fuerza magnética sobre el inmunosoporte de las nanopartículas conjugadas es suficiente para capturarlas y resistir el arrastre de flujo. Este dispositivo microfluídico es particularmente adecuado para la producción en masa de bajo costo sin pérdida de precisión para el rendimiento del inmunoensayo.

Se logró establecer un protocolo de fabricación altamente reproducible que mejora la resolución de la técnica convencional de micromolienda. Usando este protocolo, se logra la fabricación de un canal tan pequeño como 5 μm de altura que opera como una restricción escalonada en un canal de 200 μm de altura. El diseño simple de la restricción escalonada captura micropartículas de hierro de 7,5 μm de diámetro que, cuando se compactan en el microcanal, permiten la creación de una trampa magnética cuando un imán externo se ace...

La microfluídica es una poderosa herramienta para el desarrollo de pruebas diagnósticas. Sin embargo, a menudo se requieren equipos y materiales costosos, así como técnicas laboriosas de fabricación y manipulación. Aquí, detallamos el protocolo de fabricación de un dispositivo microfluídico acrílico para inmunoensayos magnéticos basados en micro y nanopartículas en un entorno de bajo costo y fácil de usar.

Microfresado de control numérico computarizado de un dispositivo acrílico microfluídico con una restricción escalonada para inmunoensayos magnéticos basados en nanopartículas

Microfluidic systems have greatly improved immunoassay techniques. However, many microfabrication techniques require specialized, expensive, or ...

Nuestro protocolo describe un método de micromolienda de alta resolución para fabricar un dispositivo microfluídico acrílico para la inmunodetección cuantitativa de concentraciones de analitos comparable a la técnica ELISA estándar de oro. Lo más destacado es la fabricación de un dispositivo microfluídico termoplástico simple y de bajo costo sin sala limpia, que permite tiempos de ensayo más cortos y buenos límites de detección de manera cuantitativa. Comience por la molienda de la superficie.Corte rectángulos de 9 x 25 milímetros de PMMA de 1,3 milímetros de espesor con la broca final de 800 micrómetros. Fije uno de estos rectángulos cuidadosamente con cinta adhesiva de doble cara a la plataforma piezoeléctrica. Conecte y coloque el sensor Z en la superficie del rectángulo de PMMA.Seleccione el pin de detección y muévalo sobre la superficie del sensor. Baje el pin manualmente sin entrar en contacto con el sensor. Active el modo de detección Z-zero.Gire la broca de 200 micrómetros a 14, 500 rpm. Baje lentamente hasta la coordenada de origen en el eje z. Luego reinicie el eje z 30 micrómetros por debajo del origen.Establezca esta coordenada como el nuevo origen Z. Haga clic en el botón Cortar en el software de la microfresadora para activar el panel de corte. Haga clic en el botón Agregar y seleccione el archivo TXT con un código creado previamente para el rectificado de la superficie acrílica.Haga clic en el botón Salida para iniciar el proceso. Para el fresado de la restricción de cinco micrómetros, primero, establezca la velocidad de rotación de la broca final en 11, 000 rpm. Luego, eleve la plataforma en 6.5 micrómetros con la interfaz de la plataforma piezoeléctrica.Mueva la broca final a lo largo del eje y en 500 micrómetros. Devuelva la plataforma piezoeléctrica a su valor inicial en el eje z con la interfaz de control. A continuación, realice el fresado de microcanales abriendo el archivo de diseño creado previamente desde el software de diseño.Haga clic en el botón Imprimir, acceda al menú de propiedades y haga clic en la ventana de color correspondiente a la capa que contiene el diseño a mecanizar. Defina los parámetros de fabricación en el panel de herramientas. Para el fresado de orificios, cambie a la broca final de 800 micrómetros.Active la capa de diseño de los orificios de 1,2 milímetros de diámetro haciendo clic en la ventana de color correspondiente y seleccionando los parámetros de fabricación correspondientes. Mecanizar dos orificios adicionales en las esquinas contralaterales del rectángulo para la alineación del acrílico de manera invertida en una nueva plataforma. Voltea el acrílico y pégalo con cinta adhesiva de doble cara sobre el adaptador con los pilares mecanizados.Abra el archivo con el diseño de los orificios para la cara opuesta del software de diseño. Moler la mitad restante de los orificios de entrada y salida del reactivo con un diámetro de 1,5 milímetros y una profundidad de 0,7 milímetros. Limpie ambas láminas rectangulares de acrílico con alcohol isopropílico y enjuague con agua destilada.Sumerja el acrílico en un baño ultrasónico durante 10 minutos. Seque ambas láminas de acrílico y péguelas con cinta adhesiva al interior de una tapa de placa de Petri de vidrio con cinta adhesiva de doble cara. Luego coloque la base de la placa de Petri de vidrio dentro de una placa de Petri de vidrio más grande.Vierta un mililitro de cloroformo en la base de la placa de Petri y coloque rápidamente la tapa con las láminas de acrílico. Agregue inmediatamente agua destilada a la base de la placa de Petri más grande hasta el nivel de la tapa de la placa de Petri. Permita la exposición del acrílico al gas cloroformo durante un minuto.Luego incline la placa de Petri para romper el sello de agua e inmediatamente descubra la placa de Petri. Para la unión, alinee ambos acrílicos con los lados expuestos al cloroformo cara a cara y forme un sándwich. Coloque los acrílicos en la prensa durante dos intervalos de dos minutos, cambiando la alineación del acrílico.Luego, conecte de dos a tres centímetros de manguera a cada uno de los orificios del dispositivo con adhesivo líquido de secado instantáneo. Llene los canales con agua destilada usando una jeringa. Sumerja el dispositivo en un baño ultrasónico durante 10 minutos.Luego vacíe el agua dentro de los canales del dispositivo y use una jeringa para introducir una solución BSA al 5%. Preparar una suspensión de micropartículas de hierro de diámetro a 7,5 micrómetros en 5% BSA. Incubar el chip y la suspensión de micropartículas con la solución de bloqueo durante al menos una hora a temperatura ambiente.A continuación, inserte las micropartículas en el chip con una aguja de jeringa a través de la manguera de salida del canal lateral. Coloque el chip verticalmente, luego gire el chip en dos pasos de 90 grados de modo que las micropartículas se dirijan y compacten en la restricción de cinco micrómetros. Selle todas las mangueras del dispositivo acrílico con calor.Corte la manguera de entrada hasta que solo queden unos pocos milímetros. Llene la aguja dispensadora con un tampón de lavado e insértela en la manguera de corte. Deje que la solución gotee y luego conecte la aguja al dispositivo.Corte la manguera de salida del canal lateral y, a continuación, conéctela a la bomba de la jeringa. A continuación, repita el mismo procedimiento para la manguera de salida del canal principal. Luego conecte el chip al imán.Para la inmunodetección, mantenga el tampón de lavado fluyendo durante 10 minutos a 50 microlitros por hora. Retire el tampón de lavado restante de la aguja dispensadora con una micropipeta y agregue 50 microlitros de la suspensión de nanopartículas. Fluya la suspensión de nanopartículas durante siete minutos a un caudal de 100 microlitros por hora.Luego cambie el caudal a 50 microlitros por hora y continúe el flujo durante otros 15 minutos. Cambie la aguja dispensadora y haga fluir el tampón de lavado durante 10 minutos a la misma velocidad. Retire el tampón de lavado restante de la aguja dispensadora con una micropipeta y agregue 100 microlitros del sustrato fluorogénico.Ajuste los parámetros de caudal y tiempo para la entrada de sustrato, la medición de fluorescencia y el paso de lavado. Activar el flujo de entrada del sustrato fluorogénico durante seis minutos a 50 microlitros por hora. 15 segundos antes de que se detenga el flujo del sustrato, encienda la fluorescencia del microscopio.Inicie la captura de imágenes con el software de la cámara del microscopio 10 segundos antes de que el sustrato se detenga con un tiempo de exposición de 1.000 milisegundos. Haga clic en el botón Inicio del parámetro de caudal deseado inmediatamente después de que se detenga el lavado del sustrato. Realice imágenes durante seis minutos a un fotograma por segundo.Haga clic en el botón Inicio del flujo de lavado inmediatamente después de que se detenga el flujo de medición seleccionado. Para el inmunoensayo se utilizaron nanopartículas conjugadas con lisozima y anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante. Se observó un aumento en la intensidad de fluorescencia para diferentes concentraciones de anticuerpos primarios comparando regiones antes y después de la trampa, mostrando que el cambio en la fluorescencia del sustrato es directamente proporcional a la concentración de anticuerpos primarios.Para una concentración dada de anticuerpo primario, la intensidad de fluorescencia se trazó en función del tiempo a diferentes velocidades de flujo del sustrato fluorogénico. La capacidad de conversión del sustrato por la enzima HRP fue inversamente proporcional al caudal, se obtuvo una intensidad máxima para un caudal de un microlitro por hora. Para las diferentes tasas de flujo para varias concentraciones de anticuerpos primarios, las curvas de las diferencias de fluorescencia después y antes de la inmunorreacción mostraron que para una concentración de 1, 000 nanogramos por mililitro, la fluorescencia se satura para todas las tasas de flujo evaluadas.Se preparó una curva de calibración utilizando el valor máximo de las diferencias en la intensidad de fluorescencia obtenidas con respecto a la concentración de anticuerpos primarios para cada caudal. La alta variabilidad y los altos niveles de fluorescencia a un microlitro por hora sugieren que la velocidad no favorece el flujo del sustrato que reacciona y tiende a acumularse justo después de la trampa. Se debe prestar especial atención a los pasos de sellado de los microcanales, ya que la exposición al cloroformo es muy sensible a la temperatura.Para obtener resultados reproducibles, la temperatura debe ser siempre la misma. Nuestro sistema ayuda a comprender dónde la compacidad y el tamaño de las micropartículas, el tamaño de las nanopartículas, los antígenos, el anticuerpo de detección y el sustrato son factores determinantes para el límite de detección en el inmunoensayo microfluídico basado en nanopartículas.

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