Electroporación del ADN plásmido en el músculo esquelético del ratón

La electroporación del ADN plásmido en el músculo esquelético es un método viable para modular la expresión génica sin comprometer la contractilidad muscular en ratones.

La transferencia de genes mediada por electroporación en el músculo es una técnica fácil y eficiente para investigar los cambios en la fisiología muscular. Encontramos que la electroporación no compromete la contractilidad muscular. La electroporación de construcciones de genes en músculo in vivo es un procedimiento simple y eficiente que no requiere un empaquetamiento más extenso de construcciones de genes en vectores virales.

Es difícil visualizar, aislar e inyectar el EDL debido a su ubicación y pequeño tamaño. La práctica en un cadáver de ratón y la inyección de tinta biológica como la tinta de la India puede ayudar a proporcionar evidencia de una inyección suficiente. Demostrando el procedimiento estará Brian Hain, un postdoctorado de mi laboratorio.

Antes de inyectar el ratón, confirme el plano quirúrgico de la anestesia con fórceps con la ausencia del reflejo de pellizco del dedo del pie, luego transfiera el ratón a un cono nasal que descansa sobre una placa de agua circulante a 37 grados centígrados durante el resto del procedimiento. Una vez que el ratón se coloca en posición supina, retire el vello de ambas extremidades posteriores con pequeños cortapelos, luego desinfecte el área de inyección con etanol y betadina alternados al 70%. Para la inyección, ubique el tendón tibial anterior o TA visible a través de la piel en el lado lateral de la parte inferior de la pierna y marque el extremo superior del músculo TA.

Luego inserte una aguja de calibre 30 montada en una micro jeringa de 50 microlitros en el músculo en un ángulo poco profundo de cinco grados de uno a dos milímetros superior a la unión miotendinosa hasta que la aguja alcance el extremo superior del músculo. Presione el émbolo mientras retrae lentamente la aguja a lo largo de la ruta de inyección para administrar 50 microlitros de la solución de plásmido en el músculo. El músculo debe hincharse.

Ajuste el temporizador durante un minuto y mida el grosor de la pierna en el músculo TA, luego ajuste los electrodos de la pinza al grosor medido. Luego ajuste el voltaje del electroporador a 12.5 voltios por milímetro. Después de un minuto, coloque los electrodos de la pinza cerca de la extremidad inferior sin estar demasiado apretados para entregar cinco pulsos de onda cuadrada con una duración de 20 milisegundos e intervalos de 200 milisegundos.

El músculo debe contraerse con cada pulso. Repita el procedimiento con la otra extremidad utilizando el vector plásmido de control. Cuando haya terminado, retire el mouse del cono de la nariz y permita que el mouse se recupere en una almohadilla térmica configurada a 37 grados centígrados.

Una vez recuperado, devuelva el ratón a su jaula. Con el ratón en posición supina, localice la cresta anterior del hueso de la tibia visualmente y a través de palpitaciones suaves. Use un bisturí para hacer una incisión poco profunda a través de la piel en el lado lateral de la cresta anterior de la tibia cinco milímetros inferior a la rodilla a dos milímetros superior a la unión miotendinosa TA.

Con la ayuda de pequeñas tijeras diseccionan sin rodeos la fascia, exponiendo el músculo TA, y luego separan el músculo TA de la tibia suavemente tirando del músculo para revelar el extensor digitorum longus o EDL. Mantenga la TA libre del EDL durante el procedimiento con pequeñas pinzas curvas. Inserte la aguja de calibre 30 en el EDL longitudinalmente hasta que la aguja alcance el extremo superior del músculo e inyecte 10 microlitros de la solución de plásmido como se demostró anteriormente.

El músculo EDL debe hincharse. Mida el grosor de la pata en el EDL y ajuste los electrodos de la pinza al grosor medido para entregar cinco pulsos de onda cuadrada como se explicó anteriormente. Cuando haya terminado, cierre la incisión con suturas de nylon desechables 4-0 no absorbibles.

Más tarde, retire el ratón del cono de la nariz y permita que se recupere en una almohadilla térmica configurada a 37 grados centígrados. Administrar un analgésico subcutáneo apropiado inmediatamente después de la cirugía y de 12 a 24 horas después de la cirugía. Una vez recuperado devuelve el ratón a la jaula de casa.

Después de la inyección y electroporación del plásmido pcDNA3-EGFP en los músculos TA y EDL, se observó la expresión de GFP que indica la absorción de ADN en las fibras musculares. Cuando se toman imágenes con un aumento más bajo, la eficiencia de la transfección muscular EDL se puede visualizar a través de la aparición de fibras verdes frente a fibras negras. Los EDL inyectados y electroporados tuvieron respuestas tetánicas similares a 100 Hertz en comparación con los músculos de control no inyectados o electroporados.

El EDL inyectado y electroporado, la fuerza muscular tetánica, la fuerza muscular tetánica específica, el tiempo hasta la tensión máxima y el tiempo de relajación media no se vieron comprometidos en comparación con el control intacto. Es importante identificar con precisión el músculo a inyectar y entregar eficientemente la solución de plásmido. Se pueden realizar una serie de mediciones histológicas y bioquímicas utilizando este protocolo.

Se puede realizar la localización celular de proteínas objetivo, la eliminación de genes objetivo, los reporteros transcripcionales y una variedad de tinciones de tejidos. Esta técnica se ha utilizado para identificar una amplia gama de cambios en la señalización molecular en el músculo durante condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. La investigación de la contractilidad muscular después de la transferencia de genes es factible utilizando esta técnica.