Herramientas microfluídicas para sondear las interacciones fúngico-microbianas a nivel celular

Utilizando los dispositivos microfluídicos presentados, podemos examinar las interacciones dinámicas entre hongos y otros microbios con un control espacial y ambiental preciso, así como imágenes de alta resolución a nivel de una sola célula. Es importante destacar que el crecimiento de hongos puede ser confinado y dirigido dentro del canal microfluídico. Permite obtener imágenes de lapso de tiempo de alta calidad.

Por lo tanto, se pueden explorar las complejidades de las interacciones fúngico-fúngico y fúngico-bacteriano. Comprender las interacciones microbianas fúngicas es un paso esencial para definir y preservar el microbioma del suelo. Este conocimiento puede ser explotado para el desarrollo de nuevos agentes de biocontrol con agricultura sostenible.

Para comenzar, prepare aproximadamente 40 gramos de poli(dimetilsiloxano) o PDM, mezclando bien la base y el agente de curado en una proporción de 10 a 1 usando una espátula en un vaso de plástico limpio. Para eliminar todas las burbujas de aire, coloque la taza en una cámara de vacío durante una hora. A continuación, con cinta transparente, asegure el molde maestro en un soporte de plástico y use aire filtrado comprimido para eliminar cualquier partícula de polvo, luego vierta los PDM en el centro del molde maestro y permita que se asiente.

Para evitar la sedimentación de partículas de polvo en la superficie de los PDM, cubra holgadamente el molde maestro con una tapa de plástico, luego transfiera el molde maestro a un horno y cure durante la noche a 70 grados centígrados. Después de quitar el molde maestro del horno y dejar que se enfríe, pele los PDM curados del molde maestro y el marco de plástico sin dañar el molde maestro en los PDM. Luego, para mantener una superficie libre de polvo, coloque cinta transparente sobre los microcanales en relieve en los PDM.

A continuación, use una guillotina montada o una cuchilla de afeitar para cortar los PDF en losas según lo designado por el diseño. Al cortar la abertura lateral de la losa de PDM utilizada para el dispositivo de interacción bacteriano-fúngica, o dispositivo BFI, asegúrese de que los microcanales estén completamente abiertos. Sin embargo, para las losas de PDM utilizadas en el ensamblaje del dispositivo de interacción fúngico-fúngico, o FFI, cada esquina debe recortarse para que quepa en una placa de Petri con fondo de vidrio.

A continuación, use un cortador de precisión para perforar los orificios de entrada o salida de acuerdo con el diseño del dispositivo. A continuación, sumerja las losas de PDM en una solución de hidróxido de sodio molar de 0,5. Enjuague las losas en agua destilada doble estéril antes de transferirlas a una solución de etanol al 70%.

Después de retirar el etanol y enjuagar las losas con agua estéril doble destilada nuevamente, sumerja las losas en agua destilada doble estéril y sonicato durante cinco minutos, luego retire la losa de PDM del agua, séquelas con aire filtrado comprimido y colóquelas en una placa de Petri cuadrada estéril. A continuación, incube la placa de Petri con la losa de PDM en un horno a 70 grados centígrados durante una hora. Una vez que las losas se hayan enfriado en un ambiente libre de polvo, limpie cualquier polvo de su superficie con cinta adhesiva y aire filtrado comprimido.

Para activar las superficies de las losas de PDM y las placas de Petri con fondo de vidrio, que posteriormente se unirán entre sí, colóquelas en un limpiador de plasma con las superficies a activar hacia arriba. Después de retirar la losa de PDM en las placas de Petri del limpiador de plasma, únalas suavemente colocando las superficies activadas en contacto conforme entre sí. Losa de PDM Bond BFI y FFI con placas de Petri de 35 milímetros y 55 milímetros de diámetros, respectivamente para comprobar la unión exitosa, intente sacar el laboratorio de PDM de su placa de Petri con pinzas.

Visualice el dispositivo cuidadosamente con el ojo o mediante microscopía genérica para garantizar que no se colapsen las entradas de inoculación o los microcanales. Para condiciones saturadas de agua o ricas en nutrientes, pipetee 100 microlitros de la solución deseada para llenar los dispositivos BFI inmediatamente después de la unión. Para dispositivos FFI, agregue 30 microlitros de los medios en cada entrada.

Finalmente, agregue de 100 a 200 microlitros de agua destilada doble estéril a la placa de Petri para mantener la humedad. Sin embargo, para condiciones de agua insaturada, simplemente agregue de 100 a 200 microlitros de agua destilada doble estéril a la placa de Petri para mantener la humedad. Para la inoculación de hongos, dentro de una campana de flujo laminar, utilizando un barrenador de corcho esterilizado, retire un tapón de agar de una colonia en la periferia de un cultivo de tres días de antigüedad, asegurándose de mantener intacto el frente hifal en crecimiento.

Luego introduzca el enchufe de agar en la entrada de hongos del dispositivo BFI y / o FFI con el lado del micelio hacia abajo en el frente hifal orientado hacia las aberturas del microcanal para fomentar la infiltración hifal de los canales. Para el dispositivo FFI, introduzca otro tapón de agar con una segunda especie de hongos en la entrada opuesta. A continuación, selle la placa de Petri con una película transparente e incube a 25 a 28 grados centígrados en la oscuridad hasta obtener la imagen.

Para la inoculación bacteriana, después de retirar el dispositivo BFI de la incubadora, pipetee 10 microlitros de una suspensión bacteriana en la entrada bacteriana en un ambiente estéril. Una vez que la placa de Petri está sellada con una película transparente, almacene el dispositivo en posición vertical a 25 grados Celsius en la oscuridad hasta que comiencen las imágenes. Utilizando este protocolo, se pudo visualizar con éxito la interacción entre el hongo Coprinopsis cinerea y la bacteria Bacillus subtilis.

Se observó que en presencia de la bacteria, la tasa de crecimiento del hongo comenzó a disminuir drásticamente después de aproximadamente cinco horas de coinoculación. Además, las hifas fúngicas asociadas con las bacterias tenían una apariencia delgada y transparente. La microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo también reveló el colapso de las hifas fúngicas después de cinco horas de coinoculación con Bacillus subtilis.

Sin embargo, a partir de las seis horas, la población bacteriana también comenzó a disminuir. La visualización de las interacciones fúngico-fúngico mostró que Fusarium graminearum inhibió fuertemente el crecimiento de Trichoderma rossicum, lo que fue evidente mediante microscopía de fluorescencia. Este protocolo reveló además cambios morfológicos significativos en el hongo Verticillium longisporum en presencia de las bacterias Pseudomonas synxantha y Pseudomonas fluorescens.

La técnica de imagen dinámica de alta resolución utilizada en el estudio también reveló la formación de septos en Fusarium graminearum en presencia del hongo Clonostachys rosea. El etiquetado de fluorescencia permitió la cuantificación dinámica de la proliferación hifal de Clonostachys rosea en el dispositivo FFI. Estos dispositivos pueden ser adaptados y modificados por el usuario para incorporar diferentes especies de interés y abordar sus preguntas experimentales específicas sobre las interacciones microbianas fúngicas.

Tanto los dispositivos BFI como FFI han empujado las fronteras científicas, revelando cómo los hongos propagan señales de defensa y nutrientes al ataque de hongos, virus, nematodos y permitiendo investigaciones sobre la dispersión bacteriana.