Name: Herramientas microfluídicas para sondear las interacciones fúngico-microbianas a nivel celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprende a utilizar dispositivos microfluídicos para estudiar interacciones fúngico-microbianas con control espaciotemporal preciso. Esta técnica permite imagen de alta resolución a nivel celular para comprender la microbioma del suelo.

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Reconocemos el apoyo financiero del Departamento de Bioingeniería del Imperial College de Londres y The Leverhulme Trust (Referencia de la subvención de investigación: RPG-2020-352).

Los autores no declaran intereses contrapuestos.

Este artículo presenta un protocolo para el estudio de las interacciones fúngico-microbianas utilizando microfluídica de canal. Los autores tienen como objetivo demostrar la versatilidad de estos dispositivos y fomentar la adaptación para adaptarse a los intereses del investigador. Utilizando los dispositivos ejemplares BFI y FFI, las interacciones fúngico-microbianas se pueden estudiar con más detalle de lo que se podía acceder anteriormente. Al eliminar la complejidad de fondo y la heterogeneidad del suelo, moderar el ...

El suelo es un entorno excepcionalmente diverso que contiene una gran cantidad de microorganismos que son fundamentales para los ciclos de carbono y fósforo 1,2. Los hongos filamentosos son un componente importante de numerosos ecosistemas como descomponedores de materia orgánica e inorgánica y pueden mejorar la nutrición de las plantas a través de la formación de relaciones simbióticas 3,4. Dentro del suelo, los hongos interactúan dinámicamente con multitud de microbios como otros hongos5, bacterias6, virus7 y nematodos8. Estas interacciones tienen consecuencias significativas para la salud del suelo y las plantas. Sin embargo, debido a la falta de sistemas experimentales apropiados capaces de obtener imágenes de microorganismos que interactúan con alta resolución, muchos permanecen indefinidos.
Las investigaciones sobre las interacciones bacteriano-fúngicas (BFI) y las interacciones fúngico-fúngicas (FFI) tienen aplicaciones valiosas en una variedad de campos, incluidos los antimicrobianos en medicina y los agentes de control biológico en la agricultura. Por ejemplo, el hongo Coprinopsis cinerea produce el péptido copsina, que se ha demostrado que exhibe actividad antibacteriana contra el patógeno humano Listeria monocytogenes9. Del mismo modo, el compuesto derivado de hongos, griseofulvina, es ampliamente utilizado como tratamiento para las infecciones fúngicas humanas y, además, es capaz de inhibir el crecimiento del hongo patógeno de plantas Alternaria solani10,11. También se ha demostrado que varias cepas de la bacteria habitada en el suelo Bacillus subtilis son agentes de control biológico efectivos del patógeno fúngico de las plantas Rhizoctonia solani12,13. Sin embargo, debido a las limitaciones asociadas con las metodologías tradicionales, los BFI y los FFIs son poco conocidos a nivel de células individuales.
Los estudios convencionales suelen explorar BFI y FFIs a macroescala utilizando placas de agar con dos o más especies en confrontación. Su interacción se evalúa midiendo las tasas de crecimiento y la producción de metabolitos de las especies enfrentadas 14,15,16; sin embargo, esta metodología solo se resuelve a nivel de colonia. Para estudiar las interacciones a nivel celular, los inoculantes bacterianos y fúngicos se pueden cultivar en portaobjetos de microscopio de vidrio recubiertos con agar que luego se toman imágenes bajo un microscopio17. Sin embargo, puede ser difícil seguir a una sola hifa usando portaobjetos de microscopio debido a la falta de confinamiento, lo que significa que las imágenes de lapso de tiempo son más difíciles de obtener. Además, la oportunidad de confinar espacialmente otros microorganismos dentro de regiones definidas del micelio fúngico o crear entornos químicos definidos que puedan ser perturbados, por ejemplo, no es posible en tales configuraciones. La naturaleza de "caja negra" del suelo también se suma a la complejidad de estudiar las interacciones fúngico-microbianas a nivel de células individuales18. Al observar especies que interactúan lejos de la increíble diversidad del microbioma del suelo, se puede evaluar la forma exacta en que los miembros individuales interactúan. Por lo tanto, existe una necesidad continua de plataformas versátiles que permitan imágenes de alta resolución de una sola célula de BFI y FFIs.
Las tecnologías microfluídicas, los llamados sistemas de laboratorio en un chip, proporcionan una plataforma ideal para el estudio de BFI y FFIs a nivel de células individuales. El campo de la microfluídica, originado a partir de tecnologías desarrolladas para el análisis químico y la microelectrónica, ha sido adoptado por las ciencias biológicas19. Las tecnologías microfluídicas regulan pequeños volúmenes de fluidos dentro de una red a medida de canales miniaturizados, que tienen al menos una dimensión en la escala micrométrica, y su uso en la investigación biológica se está expandiendo20. En particular, se han desarrollado dispositivos microfluídicos para examinar el crecimiento de hongos filamentosos 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Un beneficio del uso de esta tecnología es que el confinamiento de las hifas y la distribución de nutrientes dentro de los microcanales se asemeja más a la estructura del ambiente del suelo que los métodos convencionales de agar31. Recientemente, se han utilizado plataformas microfluídicas para investigar las interacciones entre neutrófilos humanos y patógenos fúngicos32, bacterias y raíces de plantas33, así como hongos y nematodos34,35.
Una de las muchas ventajas de usar microfluídica para estudiar las interacciones microbianas incluye el control específico del entorno del microcanal. Por ejemplo, los regímenes de flujo laminar se pueden explotar para generar gradientes de concentración definidos, lo cual es especialmente útil cuando se examina la quimiotaxis bacteriana36. Otra ventaja es que la naturaleza transparente del poli(dimetilsiloxano) (PDMS), un polímero elastomérico biocompatible y económico comúnmente utilizado en la fabricación de dispositivos microfluídicos, facilita la obtención de imágenes de alta resolución de células individuales utilizando microscopía de campo brillante y fluorescencia37. Del mismo modo, el confinamiento de microbios dentro de microcanales significa que se pueden realizar experimentos de lapso de tiempo que rastrean células individuales, lo que permite registrar y cuantificar las respuestas celulares individuales37. Por último, como los dispositivos microfluídicos pueden diseñarse para ser fáciles de usar, pueden ser fácilmente empleados por no expertos38.
Fomentar el conocimiento de las interacciones entre los microorganismos que habitan en el suelo es importante para mejorar las prácticas de gestión sostenible de los ecosistemas que mantienen la biodiversidad y para mitigar el impacto del cambio climático en los entornos terrestres39. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas herramientas microfluídicas es fundamental para ampliar la comprensión de los hongos y sus interacciones a nivel celular. El protocolo aquí se centrará en dos dispositivos microfluídicos producidos para el estudio de los BFIs40 y FFIs41 como se representa en la Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig01.jpg"> Figura 1: Representación visual y esquemática de los dispositivos de interacción bacteriano-fúngica (BFI) e interacción fúngico-fúngico (FFI ). (A) Imagen del dispositivo BFI. Se coloca un tapón micelial en la entrada de un extremo de los microcanales para permitir el crecimiento hifal en el dispositivo. La entrada bacteriana está en el extremo opuesto. Barra de escala = 5 mm. (B) Visión general esquemática del dispositivo BFI, que representa el posicionamiento de las entradas bacterianas y la dirección del crecimiento hifal a través de los microcanales de interacción. Los canales tienen 10 μm de profundidad, 100 μm de ancho y 7 mm de largo, con 28 canales de observación en total. (C) Ensayo de confrontación en placa de agar entre Coprinopsis cinerea y Bacillus subtilis NCIB 3610, barra de escala = 20 mm (izquierda). Imágenes de microscopía que muestran la interacción entre C. cinerea y B. subtilis NCIB 3610 dentro del microcanal (centro y derecho), es decir, la unión polar de las bacterias a las hifas fúngicas. Barra de escala = 25 μm (centro) y 10 μm (derecha). (D) Imagen del dispositivo FFI unido a una placa de Petri con fondo de vidrio, inoculada dualmente con tapones miceliales. Barra de escala = 1 cm. (E) Descripción general esquemática del dispositivo FFI. Se introducen dos tapones inoculantes de hongos en las entradas en cada extremo del dispositivo, lo que permite la exploración hifal de los microcanales. Los canales de control están conectados a una sola entrada de hongos y tienen un canal sin salida, lo que evita las interacciones entre los hongos de prueba. Los canales de interacción conectan ambas entradas de hongos y permiten interacciones hifales entre los sujetos de prueba dentro del microcanal. Cada canal de interacción consta de 18 secciones en forma de diamante, que miden una longitud total de 8,8 mm (490 x 430 μm por diamante), 10 μm de profundidad y tienen una región de conexión entre cada diamante de 20 μm. Los tipos de canales están duplicados, barras de escala = 1 mm. (F) Zona de interacción entre dos frentes hifales que se acercan, creciendo desde extremos opuestos del canal de interacción interconectado. Imagen de microscopía de contraste de fase, barra de escala = 250 μm. Los paneles de esta figura han sido modificados a partir de Stanley et al., 2014 (A-C)40 y Gimeno et al., 2021 (D-F)41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63917/63917fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Difco Laboratories</td><td>214010</td><td>Se utiliza para solidificar el medio de cultivo para el cultivo de bacterias y hongos dentro de placas de Petri</td></tr><tr><td>Papel de aluminio</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11759408</td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD 2021</td><td>Autokey, Autoclave de Autodesk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(VX-75)</td><td>Centrífuga Systec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(5810R)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorotrimetisilano</td><td>Merck Life Sciences</td><td>386529</td><td>PRECAUCIÓN: El clorotrimetilsilano es una sustancia peligrosa. Use el EPP adecuado y manéjelo con cuidado. Evite el contacto con la piel y los ojos y evite la inhalación. Manténgalo alejado de fuentes de ignición y úselo en un área bien ventilada.</td></tr><tr><td>Barrenador de corcho</td><td>SLS COR1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de revelador (mr-Dev 600)</td><td>Microresist Technologies</td><td></td><td>ATENCIÓN: La solución de revelador mr-Dev 600 es inflamable</td></tr><tr><td>Matraces Erlenmeyer</td><td>VWR</td><td>214-1108</td>, <td>por ejemplo, 200 mL; elija el tamaño que se adapte a sus necesidades exactas</td></tr><tr><td>Etanol (70% v/v)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>E/0650DF/15</td><td>Diluido al 99,8 % (grado de reactivo analítico)</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Paquete de software ejemplar para el procesamiento de imágenes</td></tr><tr><td>Aire comprimido filtrado Disponible</td><td></td><td></td><td>de serie en la mayoría de los laboratorios. Alternativamente, se puede utilizar un compresor exento de aceite con regulador de aire.</td></tr><tr><td>Pinzas de oblea de cabeza plana</td><td>INS5026</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10008051</td><td>Doblado, afilado</td></tr><tr><td>Placa de Petri con fondo de vidrio</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>Placa de Petri con fondo de vidrio</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD5040-100</td><td>50 mm</td></tr><tr><td>Placas de cristalización de vidrio</td><td>VWR</td><td>216-1865</td><td>Usado para el lavado de losas de PDMS</td></tr><tr><td>Placas de cristalización de vidrio</td><td>VWR</td><td>216-1866</td><td>Utilizado en el desarrollo de moldes maestros</td></tr><tr><td>Frascos de medios de vidrio</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15456113</td><td>p. ej. 250 mL; elija el tamaño que mejor se adapte a sus necesidades exactas</td></tr><tr><td>Jeringa de vidrio (Hamilton)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10625251</td><td>Se utiliza para dispensar clorotrimetilsilano</td></tr><tr><td>Placa calefactora (HP 160 III BM)</td><td>SAWATEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asa de inoculación</td><td>VWR</td><td>COPA175CS01</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>Campana de flujo laminar</td><td>Air Science (PCR)</td><td></td><td>Ejemplar de campana de flujo laminar utilizada para la fabricación de dispositivos</td></tr><tr><td>LB medio Fisher</td><td>Scientific Ltd</td><td>BP9723-500</td><td>Caldo de nutrientes ejemplar para el cultivo</td></tr> <tr><td>bacteriano durante la nocheMotor de luz de diodo emisor de luz (LedHUB)</td><td>Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH</td><td></td><td>Fuente de luz ejemplar que se puede utilizar para obtener imágenes de interacciones fúngico-microbianas (fluorescencia)</td></tr><tr><td>MA6 Alineador de máscara ultravioleta</td><td>Suss Microtec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extracto de malta</td><td>VWR</td><td>84618</td><td>Se utiliza para hacer un medio de cultivo de hongos ejemplar (agar extracto de malta)</td></tr><tr><td>Mask Writer</td><td>Applied Materials</td><td>4700DP</td><td>Ejemplo de un escritor de mascarillas que se puede utilizar para imprimir fotomascarillas para fotolitografía Soporte a</td></tr><tr>medida de<td>molde maestro de plástico</td><td></td><td></td><td>impreso en 3D Armario</td></tr> de <tr><td>seguridad microbiológica de fabricación propia&nbsp; (BioMat2)</td>Soluciones <td></td><td>de aire contenido</td><td>Exemplar MSC utilizado para el cultivo microbiano y la inoculación de dispositivos</td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td> purificada Milli-Q <td>Disponible como estándar en los laboratorios de biología.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Software de imagen de investigación avanzada</td><td>Paquete de software Nikon</td><td></td><td>Exemplar para la adquisición</td></tr><tr><td>de imágenes NIS-Elements Free Viewer</td> Paquete <td>de software Nikon</td><td></td><td>Exemplar para la visualización de imágenes adquiridas</td></tr><tr><td>Horno (aglutinante BD115)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15602126</td><td>Se utiliza para curar poli(dimetilsiloxano) (PDMS)</td></tr><tr><td>Horno (CLO-2AH-S)</td><td>KOYO</td><td></td><td>Se utiliza para preparar obleas de silicona</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>HS234526B</td><td></td></tr> placas de Petri de película transparente<tr><td>, cuadradas estériles</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11708573</td> placas de Petri de <td>120,5 mm</td></tr><tr><td>, estériles</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15370366</td><td>90 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Máscara de fotolitografía</td><td>Micro Lithography Services Ltd. España Limpiador de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plasma (Zepto)</td><td>Diener Electrónica</td><td>100012601</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de plástico</td><td>Semadeni</td><td>8323</td><td></td></tr><tr><td>Espátula de plástico</td><td>Semadeni</td><td>3340</td><td></td></tr><tr><td>Balanza de precisión portátil (OHAUS Scout)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15519631</td><td>Se utiliza para pesar PDMS, medios componentes, etc.</td></tr><tr><td>Fresa de precisión</td><td>Syneo HS1251135P1183</td><td></td><td>Diámetro del filo de corte: 3,18 mm</td></tr><tr><td>Fresa de precisión&nbsp;</td><td>Syneo</td><td>HS1871730P1183S</td><td>Diámetro del filo de corte: 4,75 mm</td></tr><tr><td>Perfilómetro&nbsp;</td><td>Bruker</td><td></td><td>Dektak XT-stylus</td></tr><tr><td>Cuchillas de afeitar</td><td>H&auml; berle Labortechnik</td><td>9156110</td><td></td></tr><tr><td>Frigorífico</td><td>Haden</td><td></td><td>4-6 &deg; C</td></tr><tr><td>Cámara CCD Retiga R1</td><td>Qimaging</td><td></td><td>Cámara ejemplar que se puede utilizar para obtener imágenes de interacciones entre hongos y microbios</td></tr><tr><td>Cinta mágica escocesa</td><td>Office Depot</td><td>3969954</td><td>cinta invisible de 19 mm; cinta transparente</td></tr><tr><td>Incubadora agitadora (Cole-Parmer SI500)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10257954</td><td></td></tr><tr><td>Oblea de silicona</td><td>Inseto</td><td></td><td>100 mm</td></tr><tr><td>Vidrio sódico-cálcico placa</td><td>Inseto</td><td></td><td>125 mm x 125 mm x 2 mm. Se utiliza para sujetar la máscara de fotolitografía en el alineador de máscaras</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Spincoater&nbsp;</td><td>SAWATEC</td><td>SM-180-BM</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2010 fotorresistencia</td><td>MicroChem</td><td></td><td>PRECAUCIÓN: La fotorresistencia SU-8 es peligrosa, tenga cuidado al manipularla y evite la inhalación y el contacto con la piel. Inflamable, potencialmente cancerígeno y tóxico para el medio ambiente.</td></tr><tr><td>Kit de elastómero Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>634165S</td><td>Se utiliza para la preparación de dispositivos de poli(dimetilsiloxano) (PDMS)</td></tr><tr><td>Incubadora de temperatura controlada</td><td>Incubadora Okolab</td><td></td><td>Exemplar que se puede utilizar para obtener imágenes de interacciones fúngico-microbianas</td></tr><tr><td>Microscopio de epifluorescencia invertida Ti2-E</td><td>Nikon MEA54000</td><td></td><td>Microscopio ejemplar que se puede utilizar para obtener imágenes de interacciones entre hongos y microbios</td></tr><tr><td>Limpiador ultrasónico S-Line Fisher</td><td>Scientific Ltd</td><td>FB15050</td><td></td></tr><tr><td>Desecador al vacío</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10528861</td><td>La silianización y la desgasificación del PDMS deben realizarse en desecadores separados</td></tr><tr><td>x10/0.3 Lente de objetivo NA CFI Plan Fluor DL</td><td>Nikon MRH20105</td><td></td><td>Lente de objetivo ejemplar que se puede utilizar para obtener imágenes de interacciones entre hongos y microbios</td></tr><tr><td>x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL lente objetivo</td><td>Nikon</td><td>MRH48230</td><td>Lente objetivo ejemplar que se puede utilizar para obtener imágenes de las interacciones entre hongos y microbios</td></tr></tbody></table>

herramientas microfluídicas para sondear las interacciones fúngico-microbianas a nivel celular

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Los hongos filamentosos son habitantes exitosos del suelo y desempeñan un papel importante en los ecosistemas del suelo, como en la descomposición de la materia orgánica e inorgánica, así como en la regulación de los niveles de nutrientes. Allí también encuentran numerosas oportunidades para interactuar con una variedad de otros microbios como bacterias u otros hongos. Sin embargo, estudiar las interacciones fúngicas a nivel celular puede ser un desafío debido a la naturaleza similar a una caja negra del suelo. Se están desarrollando nuevas herramientas microfluídicas para el estudio de las interacciones fúngicas; se destacan dos plataformas diseñadas para estudiar las interacciones bacteriano-fúngico y fúngico-fúngico. Dentro de estos microcanales, las interacciones fúngico-microbianas se pueden monitorear en entornos físico-químicos controlados a una resolución temporal y espacial más alta de lo que era posible anteriormente. La aplicación de estas herramientas ha producido numerosos conocimientos biológicos novedosos, como la observación de la unión polar bacteriana a las hifas o la revelación de antagonismos fúngicos-fúngicos no caracterizados. Una característica clave de estas metodologías se refiere a la facilidad de uso de esta herramienta por parte de no expertos, que produce tecnologías altamente traducibles para su uso en laboratorios de microbiología.

Se presentan resultados representativos de los dispositivos ejemplares BFI40 y FFI41. Las mediciones de la tasa de crecimiento hifal se pueden obtener fácilmente utilizando estos dispositivos en combinación con técnicas básicas de microscopía. La Figura 3A-B ilustra las interacciones bacteriano-fúngicas entre C. cinerea hyphae y B. subtilis NCIB 3610. La presencia de B. subtilis detie...

Debido a la opacidad del suelo, las interacciones entre sus microbios constituyentes no se pueden visualizar fácilmente con resolución celular. Aquí, se presentan dos herramientas microfluídicas, que ofrecen nuevas oportunidades para investigar las interacciones fúngico-microbianas. Los dispositivos son versátiles y fáciles de usar, lo que permite un alto control espaciotemporal e imágenes de alta resolución a nivel celular.

Herramientas microfluídicas para sondear las interacciones fúngico-microbianas a nivel celular

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Utilizando los dispositivos microfluídicos presentados, podemos examinar las interacciones dinámicas entre hongos y otros microbios con un control espacial y ambiental preciso, así como imágenes de alta resolución a nivel de una sola célula. Es importante destacar que el crecimiento de hongos puede ser confinado y dirigido dentro del canal microfluídico. Permite obtener imágenes de lapso de tiempo de alta calidad.Por lo tanto, se pueden explorar las complejidades de las interacciones fúngico-fúngico y fúngico-bacteriano. Comprender las interacciones microbianas fúngicas es un paso esencial para definir y preservar el microbioma del suelo. Este conocimiento puede ser explotado para el desarrollo de nuevos agentes de biocontrol con agricultura sostenible.Para comenzar, prepare aproximadamente 40 gramos de poli(dimetilsiloxano) o PDM, mezclando bien la base y el agente de curado en una proporción de 10 a 1 usando una espátula en un vaso de plástico limpio. Para eliminar todas las burbujas de aire, coloque la taza en una cámara de vacío durante una hora. A continuación, con cinta transparente, asegure el molde maestro en un soporte de plástico y use aire filtrado comprimido para eliminar cualquier partícula de polvo, luego vierta los PDM en el centro del molde maestro y permita que se asiente.Para evitar la sedimentación de partículas de polvo en la superficie de los PDM, cubra holgadamente el molde maestro con una tapa de plástico, luego transfiera el molde maestro a un horno y cure durante la noche a 70 grados centígrados. Después de quitar el molde maestro del horno y dejar que se enfríe, pele los PDM curados del molde maestro y el marco de plástico sin dañar el molde maestro en los PDM. Luego, para mantener una superficie libre de polvo, coloque cinta transparente sobre los microcanales en relieve en los PDM.A continuación, use una guillotina montada o una cuchilla de afeitar para cortar los PDF en losas según lo designado por el diseño. Al cortar la abertura lateral de la losa de PDM utilizada para el dispositivo de interacción bacteriano-fúngica, o dispositivo BFI, asegúrese de que los microcanales estén completamente abiertos. Sin embargo, para las losas de PDM utilizadas en el ensamblaje del dispositivo de interacción fúngico-fúngico, o FFI, cada esquina debe recortarse para que quepa en una placa de Petri con fondo de vidrio.A continuación, use un cortador de precisión para perforar los orificios de entrada o salida de acuerdo con el diseño del dispositivo. A continuación, sumerja las losas de PDM en una solución de hidróxido de sodio molar de 0,5. Enjuague las losas en agua destilada doble estéril antes de transferirlas a una solución de etanol al 70%.Después de retirar el etanol y enjuagar las losas con agua estéril doble destilada nuevamente, sumerja las losas en agua destilada doble estéril y sonicato durante cinco minutos, luego retire la losa de PDM del agua, séquelas con aire filtrado comprimido y colóquelas en una placa de Petri cuadrada estéril. A continuación, incube la placa de Petri con la losa de PDM en un horno a 70 grados centígrados durante una hora. Una vez que las losas se hayan enfriado en un ambiente libre de polvo, limpie cualquier polvo de su superficie con cinta adhesiva y aire filtrado comprimido.Para activar las superficies de las losas de PDM y las placas de Petri con fondo de vidrio, que posteriormente se unirán entre sí, colóquelas en un limpiador de plasma con las superficies a activar hacia arriba. Después de retirar la losa de PDM en las placas de Petri del limpiador de plasma, únalas suavemente colocando las superficies activadas en contacto conforme entre sí. Losa de PDM Bond BFI y FFI con placas de Petri de 35 milímetros y 55 milímetros de diámetros, respectivamente para comprobar la unión exitosa, intente sacar el laboratorio de PDM de su placa de Petri con pinzas.Visualice el dispositivo cuidadosamente con el ojo o mediante microscopía genérica para garantizar que no se colapsen las entradas de inoculación o los microcanales. Para condiciones saturadas de agua o ricas en nutrientes, pipetee 100 microlitros de la solución deseada para llenar los dispositivos BFI inmediatamente después de la unión. Para dispositivos FFI, agregue 30 microlitros de los medios en cada entrada.Finalmente, agregue de 100 a 200 microlitros de agua destilada doble estéril a la placa de Petri para mantener la humedad. Sin embargo, para condiciones de agua insaturada, simplemente agregue de 100 a 200 microlitros de agua destilada doble estéril a la placa de Petri para mantener la humedad. Para la inoculación de hongos, dentro de una campana de flujo laminar, utilizando un barrenador de corcho esterilizado, retire un tapón de agar de una colonia en la periferia de un cultivo de tres días de antigüedad, asegurándose de mantener intacto el frente hifal en crecimiento.Luego introduzca el enchufe de agar en la entrada de hongos del dispositivo BFI y / o FFI con el lado del micelio hacia abajo en el frente hifal orientado hacia las aberturas del microcanal para fomentar la infiltración hifal de los canales. Para el dispositivo FFI, introduzca otro tapón de agar con una segunda especie de hongos en la entrada opuesta. A continuación, selle la placa de Petri con una película transparente e incube a 25 a 28 grados centígrados en la oscuridad hasta obtener la imagen.Para la inoculación bacteriana, después de retirar el dispositivo BFI de la incubadora, pipetee 10 microlitros de una suspensión bacteriana en la entrada bacteriana en un ambiente estéril. Una vez que la placa de Petri está sellada con una película transparente, almacene el dispositivo en posición vertical a 25 grados Celsius en la oscuridad hasta que comiencen las imágenes. Utilizando este protocolo, se pudo visualizar con éxito la interacción entre el hongo Coprinopsis cinerea y la bacteria Bacillus subtilis.Se observó que en presencia de la bacteria, la tasa de crecimiento del hongo comenzó a disminuir drásticamente después de aproximadamente cinco horas de coinoculación. Además, las hifas fúngicas asociadas con las bacterias tenían una apariencia delgada y transparente. La microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo también reveló el colapso de las hifas fúngicas después de cinco horas de coinoculación con Bacillus subtilis.Sin embargo, a partir de las seis horas, la población bacteriana también comenzó a disminuir. La visualización de las interacciones fúngico-fúngico mostró que Fusarium graminearum inhibió fuertemente el crecimiento de Trichoderma rossicum, lo que fue evidente mediante microscopía de fluorescencia. Este protocolo reveló además cambios morfológicos significativos en el hongo Verticillium longisporum en presencia de las bacterias Pseudomonas synxantha y Pseudomonas fluorescens.La técnica de imagen dinámica de alta resolución utilizada en el estudio también reveló la formación de septos en Fusarium graminearum en presencia del hongo Clonostachys rosea. El etiquetado de fluorescencia permitió la cuantificación dinámica de la proliferación hifal de Clonostachys rosea en el dispositivo FFI. Estos dispositivos pueden ser adaptados y modificados por el usuario para incorporar diferentes especies de interés y abordar sus preguntas experimentales específicas sobre las interacciones microbianas fúngicas.Tanto los dispositivos BFI como FFI han empujado las fronteras científicas, revelando cómo los hongos propagan señales de defensa y nutrientes al ataque de hongos, virus, nematodos y permitiendo investigaciones sobre la dispersión bacteriana.

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Research

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Bioengineering

Bioingeniería

Dispositivos de microfluídica se puede utilizar para visualizar procesos naturales complejos en tiempo real y en las escalas físicas adecuadas. Hemos desarrollado un sencillo dispositivo de microfluidos que imita las características clave de los medios porosos naturales para el estudio del crecimiento y el transporte de bacterias en el subsuelo.

Ventana en un micromundo: Sistemas sencillos de microfluidos para el estudio de transporte de microbios en medios porosos

Se presenta un método simple para producir los dispositivos de microfluidos capaces de aplicar similares condiciones dinámicas a múltiples cepas distintas, sin la necesidad de una sala limpia o litografía blanda.

Un dispositivo de microfluidos para el estudio de varias cepas distintas

Fuente: Miquel Guennoc, C., et al. Nuevo método para el análisis cualitativo multiescala de biopelículas bacterianas en colonias fúngicas filamentosas utilizando microscopía confocal y electrónica. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demuestra la preparación de un cultivo fúngico en membranas de celofán tratadas para apoyar la formación de colonias y el crecimiento radial. Luego muestra el cultivo y la preparación de células bacterianas del suelo para ensayos de interacción. Finalmente, ilustra cómo...

Establecimiento de una cocultura fúngico-bacteriana para la formación de biopelículas

En este protocolo se introduce la fabricación, configuración y operación básica de un biorreactor de picolitros microfluídico (PLBR) para el análisis de microorganismos procariotas de una sola célula. Se analizaron microorganismos de relevancia industrial como prueba de principio, lo que permitió conocer la tasa de crecimiento, la morfología y la heterogeneidad fenotípica durante ciertos períodos de tiempo, lo que difícilmente es posible con los métodos convencionales.

Biorreactor de picolitro microfluídico para análisis microbiano de una sola célula: fabricación, configuración del sistema y operación

En este artículo se presenta un chip de microfluidos para el análisis de células individuales. Permite la cuantificación de las proteínas intracelulares, enzimas, cofactores, y segundos mensajeros por medio de ensayos fluorescentes o inmunoensayos.

Un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales

Este protocolo describe un nuevo método para hacer crecer y cualitativamente analizar biopelículas bacterianas en hifas de los hongos por microscopía confocal y electrónica.

Un nuevo método para el análisis cualitativo multi-escala de biopelículas bacterianas en filamentosa fúngica Colonias Utilizando microscopía confocal y electrónica

Planta defensinas juegan un papel importante en defensa de la planta contra patógenos. Para el uso efectivo de estos péptidos antifúngicos como antifúngicos, comprender sus modos de acción (MOA) es crítico. Aquí, se describe un método de proyección de imagen de células vivas para estudiar los aspectos críticos de MOA de estos péptidos.

Imágenes de células vivas de células fúngicas a investigar los modos de entrada y localización subcelular de defensinas de plantas antifúngicas

Se presenta un método para el análisis de microfluídica de linajes de células bacterianas individuales utilizando Bacillus subtilis como ejemplo. El método supera las deficiencias de los tradicionales métodos analíticos en Microbiología por lo que permite la observación de cientos de generaciones de celular bajo condiciones de crecimiento muy uniforme y controlable.

Sola célula microfluídicos análisis de Bacillus subtilis

Los colorantes fluorescentes vitales son herramientas esenciales para el análisis de imágenes de células vivas en la biología moderna de células fúngicas. Este artículo detalla la aplicación de colorantes fluorescentes establecidos y menos conocidos para el seguimiento de la dinámica de la membrana plasmática, la endo-/exócicosis y la morfogénesis de la pared celular en hongos filamentosos.

Aplicación de colorantes fluorescentes selectivos de membrana y pared celular para imágenes de células vivas de hongos filamentosos

Aquí, presentamos un protocolo para perfilar la interacción entre el huésped y el patógeno durante la infección por proteómica basada en espectrometría de masas. Este protocolo utiliza la cuantificación libre de etiquetas para medir los cambios en la abundancia de proteínas tanto del huésped (por ejemplo, macrófagos) como del patógeno (por ejemplo, Cryptococcus neoformans)en un solo experimento.

Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa sin etiquetas para interacciones host-patógenos impulsadas por el descubrimiento

Presentamos un protocolo de imágenes en vivo sin etiquetas que utiliza técnicas de microscopía de luz transmitida para capturar imágenes, analizar y cuantificar la cinética de crecimiento del hongo filamentoso A. nidulans tanto en cultivos sumergidos como en medios sólidos. Este protocolo se puede utilizar junto con la microscopía de fluorescencia.

Análisis cuantitativo de la tasa de crecimiento de Aspergillus nidulans utilizando microscopía en vivo y software de código abierto

Aprende a utilizar dispositivos microfluídicos para estudiar interacciones fúngico-microbianas con control espaciotemporal preciso. Esta técnica permite imagen de alta resolución a nivel celular para comprender la microbioma del suelo.

Herramientas microfluídicas para sondear las interacciones fúngico-microbianas a nivel celular

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