Name: Medición de la vasorelajación dependiente del endotelio en la aorta torácica del ratón mediante miografía tensométrica de cámara de pequeño volumen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprende a medir la vasorelajación dependiente del endotelio en aorta de ratón mediante miografía tensométrica. Este protocolo permite evaluar la función vascular con alta reproducibilidad en condiciones fisiológicas controladas.

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Este trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Nacionales de Salud (R15HL145646) y Midwestern University College of Graduate Studies.

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El campo de la biología vascular depende en gran medida de herramientas que ayudan a los investigadores a evaluar la integridad funcional y estructural de la pared del vaso sanguíneo. También exige una atención especial a las interacciones directas e indirectas entre las tres capas de los vasos sanguíneos: la íntima, la media y la adventicia. Entre esas tres capas, la íntima está formada por una monocapa de células endoteliales y tiene una función muy importante en la regulación de la salud vascular y la hemostasia.
...

Durante las últimas décadas, el sistema de miografía de cámara pequeña se ha utilizado para medir la reactividad de diferentes capas de paredes de vasos sanguíneos en respuesta a diversos agentes farmacológicos y neurotransmisores en un entorno ex vivo y en tiempo real. La reactividad vascular es un componente importante de un vaso sanguíneo funcional sano y es crítica para la regulación del flujo sanguíneo y la perfusión en la vasculatura periférica y cerebral1. Dentro de la pared del vaso sanguíneo, la interacción entre las capas endotelial y del músculo liso es un determinante importante del tono vascular, que también se ve constantemente afectado por los cambios estructurales en la capa de tejido conectivo que rodea la pared del vaso sanguíneo (adventicia).
La capa endotelial controla la vasomoción liberando algunos factores vasodilatadores, incluyendo óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGI2) y factor hiperpolarizante derivado del endotelio (EDHF), o produciendo agentes vasoconstrictores como endotelina-1 (ET-1) y tromboxano (TXA2)2,3,4. Entre estos factores, el NO ha sido ampliamente estudiado, y sus importantes funciones reguladoras en otras funciones celulares críticas como la inflamación, la migración, la supervivencia y la proliferación han sido altamente citadas en la literatura científica 2,5.
En el campo de la biología vascular, la miografía de cámara ha proporcionado a los fisiólogos vasculares y farmacólogos una herramienta valiosa y confiable para medir la función endotelial en un sistema semifisiológico estrechamente controlado1. Actualmente, hay dos sistemas miográficos diferentes disponibles para los científicos: la miografía tensométrica (isométrica) de alambre (o pin) y la miografía de presión. En un sistema de miografía de alambre, el vaso sanguíneo se estira entre dos cables o clavos, lo que permite la medición isométrica del desarrollo de fuerza o tensión en la pared del vaso sanguíneo, mientras que la miografía de presión es una plataforma preferible para mediciones de reactividad vascular en arterias de resistencia pequeñas, donde los cambios en la presión arterial se consideran el principal estímulo para los cambios en el tono vascular y la vasomoción. Existe un acuerdo general de que, para las arterias de resistencia pequeñas, como las arterias mesentéricas y cerebrales, la miografía de presión crea una condición que está más cerca de las condiciones fisiológicas en el cuerpo humano. El miógrafo de cámara pequeña se puede utilizar para vasos con diámetros muy pequeños (200-500 μm) a vasos mucho más grandes como la aorta.
Mientras que el miógrafo de alambre es un sistema potente para registrar la tensión de los vasos sanguíneos en condiciones isométricas, el miógrafo de presión es un sistema más apropiado para medir los cambios en el diámetro del vaso en respuesta a los cambios en las condiciones isobáricas. Los cambios de diámetro en el vaso en respuesta a los cambios en la presión o el flujo son mucho mayores en una arteria muscular pequeña (arteriola) en comparación con las arterias elásticas grandes como la aorta. Por estas razones, el miógrafo de presión es considerado una mejor herramienta para los vasos sanguíneos pequeños con vasoreactividad sustancial1. Una de las otras fortalezas prácticas de la miografía tensométrica de cámara multicámara de pequeño volumen es que se puede discernir la contribución de diferentes mecanismos a la reactividad vascular mediante el estudio de múltiples (hasta cuatro) segmentos de la misma arteria y del mismo animal para reducir la variabilidad y producir datos robustos y concluyentes. También es relativamente fácil de configurar y mantener técnicamente. Los vasos de casi cualquier tamaño se pueden estudiar con un miógrafo de alambre. Es una solución más rentable para evaluar la función vascular y es una buena alternativa a la miografía de presión en experimentos donde la longitud del vaso disecado es demasiado corta para el protocolo del miógrafo de presión.
Este informe proporciona un protocolo detallado para la evaluación de la función endotelial en el anillo aórtico torácico aislado de ratón utilizando pines de montaje en la técnica de miografía tensométrica de cámara de pequeño volumen utilizando el sistema de miógrafo multicámara DMT-620 (DMT-USA). Este protocolo utiliza un ratón macho C57BL6 de 6 meses de edad con un peso promedio entre 25-35 g. Afortunadamente, este protocolo se puede aplicar a varios tipos de animales y pesos, teniendo en cuenta la amplia gama de tipos de vasos y diámetros para los que se puede utilizar este protocolo.

<table><tbody><tr><td>Acetilcolina</td><td>SigmaAldrich</td><td>A6625-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>C4901-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Gas cárbogo</td><td>Matheson</td><td>H103847</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>DMT 620 Sistema de miógrafo multicámara</td><td>DMT DMT</td><td>620</td><td>Sistema</td></tr> <tr>de miógrafo multicámara<td>Pinza Dumont</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SigmaAldrich</td><td>E5134-10G</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>SigmaAldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SigmaAldrich</td><td>H7006-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>P9541-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5655-1KG</td><td></td></tr><tr><td>LabChart</td><td>ADI instruments</td><td></td><td>Software de adquisición de datos</td></tr><tr><td>Fuente de luz</td><td>Volpi</td><td>14363</td><td></td></tr><tr><td>L-Name</td><td>Fischer Scientific</td><td>50-200-7725</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>SigmaAldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica</td><td>S6D</td><td>microscopio estereoscópico con zoom</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>S5886-5KG</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>SigmaAldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de baño de órganos</td><td>DMT</td><td>720MO</td><td></td></tr><tr><td>Fenilefrina</td><td>SigmaAldrich</td><td>P6126-10G</td><td></td></tr><tr><td>Bomba</td><td>Welch</td><td>2546B-01</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>ADI instruments</td><td>LabChart 8.1.20</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de muelle</td><td>FST</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Kit Sylgard 184 Servicios</td><td>de Microscopía Electrónica</td><td>24236-10</td><td>Kit de elastómero de silicona</td></tr><tr><td>Regulador de tanque</td><td>Fischer Scientific</td><td></td> 10575147 <td></td></tr><tr><td>sistema de baño de agua</td><td>Fischer Scientific</td><td>15-462-10</td><td></td></tr></tbody></table>

medición de la vasorelajación dependiente del endotelio en la aorta torácica del ratón mediante miografía tensométrica de cámara de pequeño volumen

Measurement of Endothelium-Dependent Vasorelaxation in the Mouse Thoracic Aorta Using Tensometric Small Volume Chamber Myography

La miografía tensométrica de cámara de pequeño volumen es una técnica comúnmente utilizada para evaluar la contractilidad vascular de vasos sanguíneos pequeños y grandes en animales de laboratorio y arterias pequeñas aisladas de tejido humano. La técnica permite a los investigadores mantener vasos sanguíneos aislados en un entorno estrictamente controlado y estandarizado (casi fisiológico), con la opción de ajustarse a diversos factores ambientales, mientras desafía los vasos aislados con diferentes agentes farmacológicos que pueden inducir vasoconstricción o vasodilatación. La cámara miográfica también proporciona una plataforma para medir la reactividad vascular en respuesta a varias hormonas, inhibidores y agonistas que pueden afectar la función del músculo liso y las capas endoteliales por separado o simultáneamente. La pared del vaso sanguíneo es una estructura compleja que consta de tres capas diferentes: la íntima (capa endotelial), los medios (músculo liso y fibras de elastina) y la adventicia (colágeno y otro tejido conectivo). Para obtener una comprensión clara de las propiedades funcionales de cada capa, es fundamental tener acceso a una plataforma y sistema experimental que permita un enfoque combinacional para estudiar las tres capas simultáneamente. Tal enfoque exige el acceso a una condición semifisiológica que imitaría el entorno in vivo en un entorno ex vivo . La miografía tensométrica de cámara de pequeño volumen ha proporcionado un entorno ideal para evaluar el impacto de las señales ambientales, las variables experimentales o los agonistas y antagonistas farmacológicos en las propiedades vasculares. Durante muchos años, los científicos han utilizado la técnica del miógrafo tensométrico para medir la función endotelial y la contractilidad del músculo liso en respuesta a diferentes agentes. En este informe, se utiliza un sistema miométrico tensométrico de cámara de pequeño volumen para medir la función endotelial en la aorta aislada del ratón. Este informe se centra en cómo se puede utilizar la miografía tensométrica de cámara de pequeño volumen para evaluar la integridad funcional del endotelio en pequeños segmentos de una arteria grande como la aorta torácica.

El protocolo de miografía tensométrica de cámara pequeña explicado aquí es el método estándar para medir la reactividad vascular en arterias pequeñas y grandes y permite mediciones simultáneas de la reactividad vascular en hasta cuatro segmentos de vasos sanguíneos del mismo pequeño animal experimental de laboratorio. En este informe, utilizamos específicamente el sistema para medir la función endotelial en la aorta aislada del ratón (Figura 1). En este protocolo, los segmentos aórticos aisl...

El presente protocolo describe los conceptos y la aplicación técnica de la técnica del miógrafo tensométrico utilizando un sistema de miógrafo multicámara en la evaluación experimental ex vivo de la función endotelial aórtica del ratón.

Medición de la vasorelajación dependiente del endotelio en la aorta torácica del ratón mediante miografía tensométrica de cámara de pequeño volumen

Small volume chamber tensometric myography is a commonly used technique to evaluate the vascular contractility of small and large blood vessels in ...

Demostramos la miografía isométrica o tensométrica como el protocolo estándar de oro para medir la reactividad de pequeños vasos sanguíneos de resistencia o grandes conductos en una condición fisiológica bien controlada. Las mediciones son altamente reproducibles y fiables. La técnica es muy valiosa para permitir a los investigadores estudiar diferentes capas de vasos sanguíneos por separado o investigar la interacción entre diferentes capas de la pared del vaso sanguíneo simultáneamente.Demostrando el procedimiento estará Robert Folk, el especialista del laboratorio de investigación de mi laboratorio. Comience por encender el baño de agua y ajustarlo a 37 grados centígrados. Coloque dos vasos de precipitados etiquetados apropiadamente en el baño de agua, uno con 600 mililitros de solución HEPES-PSS y otro con 150 mililitros de solución con alto contenido de potasio.Airear un vaso de precipitados que contenga 300 mililitros de solución HEPES-PSS con gas carbógeno durante al menos 10 minutos. Agregue 30 mililitros de la solución aireada HEPES-PSS a un tubo de centrífuga de 50 mililitros, etiquételo adecuadamente y colóquelo en hielo. Mantenga la solución HEPES-PSS aireada restante en hielo para usarla durante el proceso de disección aórtica.Encienda la unidad de miógrafo de cuatro cámaras a 5 mililitros de solución HEPES-PSS en cada cámara miográfica y ajuste el calor a 37 grados centígrados. Deje que la solución en cada cámara se airee durante 30 minutos y verifique que las cámaras hayan alcanzado los 37 grados centígrados deseados. Encienda el hardware y el ordenador de adquisición de datos del miógrafo.Transfiera la caja torácica extirpada de los ratones sacrificados a una placa de Petri recubierta de elastómero de silicona transparente llena de tampón HEPES-PSS aireado helado y colóquela en ambos lados. Bajo el microscopio, corte y retire suavemente el corazón y la aorta adjunta de la caja torácica y transfiérala a un plato limpio recubierto de elastómero de silicona, luego retire suavemente el tejido conectivo graso y la sangre coagulada de la aorta. Usando tijeras pequeñas y afiladas, disecciona y aísla toda la aorta comenzando desde el área del arco hasta la parte inferior de la aorta descendente.Corte la aorta disecada en cuatro segmentos de 2 milímetros cada uno. Use la mini-regla dentro del plato como referencia. En cámaras que ya contienen 5 mililitros de tampón HEPES-PSS calentado y aireado, deslice cuidadosamente cada uno de los segmentos aórticos de 2 milímetros sobre los dos pasadores de montaje con pinzas.Al volver a colocar la cámara en la unidad de miógrafo, separe lentamente los pines girando el micrómetro en sentido contrario a las agujas del reloj para que el segmento aórtico no se deslice de los pines. Devuelva cada cámara miográfica a la unidad y comience a airear las cámaras a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Drene las cámaras y agregue 5 mililitros de solución HEPES-PSS fresca, tibia y aireada a cada cámara.Si es necesario, reajuste las mediciones de fuerza para leer la tensión óptima de 6 milinewtons. Descanse el tejido durante otros 15 a 20 minutos. Abra el software de adquisición de datos.Cambie los números de seguimiento de 50 a 1 a 500 a 1 y presione Inicio. Antes de comenzar un nuevo experimento, asegúrese de agregar la etiqueta adecuada en el software de adquisición de datos. Drene las cámaras una vez más antes de agregar 5 mililitros de solución con alto contenido de potasio a cada cámara.Drene las cámaras nuevamente tan pronto como la respuesta contráctil a la solución con alto contenido de potasio alcance una meseta para la generación de fuerza. Lave el pañuelo con la solución HEPES-PSS tres veces. Agregue 5 mililitros de solución con alto contenido de potasio a cada cámara.Drene las cámaras tan pronto como la respuesta contráctil a la solución con alto contenido de potasio alcance una meseta para la generación de fuerza y lave el tejido tres veces con HEPES-PSS, luego descanse el tejido durante 15 a 20 minutos. Precontraer los segmentos aórticos con el agente vasoconstrictor PE a una dosis submáxima. Permitir que la curva de contracción inducida por PE alcance una meseta para el desarrollo de la tensión.Agregue una meseta de desarrollo de tensión a PE a 5 microlitros de dosis crecientes de soluciones de material de trabajo de acetilcolina en intervalos de 3 minutos para establecer concentraciones finales de acetilcolina de 50 picomolares a 10 micromolares en la cámara del miógrafo como se describe en el texto manuscrito. Después de completar el experimento de dosis-respuesta, drene las cámaras, lave los segmentos aórticos con solución HEPES-PSS tibia y aireada tres veces y descanse los tejidos durante 30 minutos. Después de descansar los segmentos aórticos durante 30 minutos, drene las cámaras y agregue una solución fresca y tibia con alto contenido de potasio a cada cámara, luego drene las cámaras y lave el tejido con la solución HEPES-PSS cuando la respuesta de contracción a la solución con alto contenido de potasio alcance una meseta F como se demostró anteriormente.Pre-incubar los segmentos aórticos con L-NAME agregando 10 microlitros de la solución de material de trabajo preparada de 100 milimolares para evaluar la contribución de la producción de óxido nítrico a la vasorelajación inducida por acetilcolina observada. Sin quitar el nombre L, agregue la dosis submáxima de EP a la cámara para inducir la contracción aórtica. Espere hasta que la curva de contracción inducida por PE alcance una meseta para el desarrollo de la tensión, luego agregue acetilcolina a la cámara del miógrafo para lograr una concentración final de 500 nanomolares.Espere unos minutos para registrar cualquier posible cambio en el desarrollo de la fuerza hasta que la meseta formada sea estable. Drene las cámaras y lave el pañuelo con una solución aireada tibia de HEPES-PSS tres veces. Coloque la cámara del miógrafo bajo el microscopio y pase suavemente un pequeño cable a través de la luz de la aorta.Mueva suavemente el cable a través del lumen durante un período corto. Corte la aorta en anillos aórticos de 2 milímetros y monte esos anillos en la cámara miográfica. Ajuste la tensión óptima a 6 milinewtons y deje que el tejido descanse durante 30 minutos en tampón HEPES-PSS caliente aireado, luego drene las cámaras y agregue 5 mililitros de solución HEPES-PSS aireada caliente fresca a cada cámara.Ponga a cero la fuerza para todas las cámaras del miógrafo y gire lentamente el micrómetro en sentido contrario a las agujas del reloj para aumentar la distancia entre los pines hasta que la fuerza registrada alcance la tensión óptima deseada para la aorta del ratón. Presione el tejido durante otros 15 a 20 minutos a la tensión óptima, luego drene las cámaras una vez más antes de agregar 5 mililitros de solución con alto contenido de potasio a cada cámara. Drene las cámaras nuevamente y lave el tejido con la solución HEPES-PSS tres veces una vez que la respuesta de contracción a la solución de iones con alto contenido de potasio alcance una meseta.Descanse el tejido durante 15 a 20 minutos, luego precontraiga los segmentos aórticos con EP, el agente vasoconstrictor. Cuando la fuerza inducida por PE alcanza una meseta, agregue la concentración submáxima de acetilcolina a la cámara del miógrafo para lograr una concentración final de 500 nanomolares. Espere 3 minutos para asegurarse de que la meseta registrada para el desarrollo de la fuerza inducida por PE no cambie antes de finalizar el experimento.La integridad y viabilidad de cada vaso aislado se evaluaron mediante el registro de la generación de fuerza contráctil. El pico de la fuerza registrada se utilizó más tarde para normalizar la generación de fuerza para el mismo segmento en respuesta a los agonistas. Las mediciones de vasorelajación mediadas por endotelio representaron la contracción mediada por el músculo liso y la generación de fuerza.Cuando la contracción inducida por EP alcanzó una meseta, el aumento de las dosis de acetilcolina logró la máxima vasorelajación en el segmento aislado. El inhibidor del óxido nítrico L-NAME bloqueó completamente la vasorelajación inducida por la acetilcolina en la aorta precontraída, lo que indica que la acetilcolina induce la vasorelajación aórtica al aumentar la producción de óxido nítrico. Además, la eliminación de la capa endotelial de los segmentos aórticos también bloqueó la vasorelajación inducida por la acetilcolina, lo que subraya el papel del endotelio en la relajación de los vasos sanguíneos.Asegúrese de ser suave al manipular, limpiar y diseccionar el vaso sanguíneo. Es fundamental agregar los agonistas e inhibidores farmacológicos con cuidado para no alterar los anillos de los vasos sanguíneos montados en las cámaras del miógrafo. La información puede ayudar a diseñar experimentos para explorar posibles enfoques terapéuticos para abordar la disfunción de las capas específicas de un vaso sanguíneo.

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Investigación

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Biología

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La disfunción endotelial se asocia con numerosos estados de enfermedad y es predictivo de eventos cardiovasculares adversos en los seres humanos. Vasodilatación mediada por flujo (DMF) es un método de ultrasonido no invasivo de evaluación de la función endotelial. Opciones metodológicas y la experiencia del operador pueden afectar los resultados. Un enfoque sistemático para la fiebre aftosa en los estudios en humanos se discute aquí.

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Sistemas de videomicroscopía se utilizan para examinar propiedades funcionales de las arteriolas aisladas de tejido adiposo en respuesta a estímulos fisiológicos y farmacológicos. Esta técnica se puede utilizar para examinar fenotipos microvasculares en dominios diferentes de tejido adiposo en humanos obesos.

Evaluación de la función Microvascular del tejido adiposo humano mediante videomicroscopía

Este manuscrito describe en vitro protocolos video microscopia para evaluar la función vascular en las arterias de resistencia cerebral de rata. El manuscrito también describe técnicas para evaluar la densidad de microvessel con fluorescencia marcada perfusión lectinas y tejido mediante flujometría Doppler láser.

Evaluación de mecanismos de Control Vascular utilizando microscopia Video de arterias de resistencia aislada de ratas

La técnica del miógrafo de alambre se utiliza para investigar las funciones del músculo liso vascular y nuevos fármacos de la pantalla. Se presenta un protocolo detallado para medir la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón y para la detección de nuevos relajantes del músculo liso vascular.

Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

Entrenamiento de alta intensidad de la hipoxia es un protocolo que se ha demostrado para inducir adaptaciones vasculares potencialmente beneficiosas en algunos pacientes y mejorar a los atletas repiten capacidad de sprint. Aquí, nosotros probar la viabilidad de ratones de formación con que protocolo e identificar las adaptaciones vasculares con ex vivo evaluación de la función vascular.

Supramaximal intensidad ejercicio hipóxico y evaluación de la función Vascular en ratones

El protocolo describe el uso de la miografía por cable para evaluar la tensión isométrica transmural de las arterias mesentérica aisladas de los ratones, con especial consideración de la modulación por factores liberados de las células endoteliales y los tejidos adiposo perivasculares.

Evaluación de la capacidad de respuesta del tono vascular utilizando arterias mesentérica aisladas con un enfoque en la modulación por tejidos adiposo perivasculares

Aprende a medir la vasorelajación dependiente del endotelio en aorta de ratón mediante miografía tensométrica. Este protocolo permite evaluar la función vascular con alta reproducibilidad en condiciones fisiológicas controladas.

Medición de la vasorelajación dependiente del endotelio en la aorta torácica del ratón mediante miografía tensométrica de cámara de pequeño volumen (Video) | JoVE Journal

Medición de la vasorelajación dependiente del endotelio en la aorta torácica del ratón mediante miografía tensométrica de cámara de pequeño volumen

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