Name: Modelo experimental para evaluar la resolución de la neumonía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprende a establecer un modelo reproducible de neumonía en ratones mediante instilación intratraqueal bacteriana. Este método permite evaluar lesión pulmonar aguda y probar nuevas estrategias terapéuticas en enfermedades infecciosas.

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Este estudio fue financiado por la subvención R01 de los NIH HL131812 y R01HL163881.

Todos los protocolos animales descritos en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (ACUC) de la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins para el MO21M160 de protocolo animal. Además, los experimentos se realizaron siguiendo las regulaciones institucionales, estatales y federales para la investigación con animales.
PRECAUCIÓN: La replicación de todos los protocolos descritos a continuación requiere que se realice en un gabinete de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2), siguiendo todas las pautas institucionales de BSL-2 bajo el gabinete de bioseguridad.
1. Recubrimiento de existencias bacterianas de bucles comerciales
NOTA: Este protocolo se puede utilizar para aumentar las reservas bacterianas para Spn (ATCC 49619) y Kpn (ATCC 43816), comenzando con los culti-loops obtenidos del proveedor (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).
<ol><li>Calentar una placa de agar sangre de oveja al 5% durante 15 min a 37 °C en una incubadora. Para ello se puede utilizar una incubadora de células.</li>
	<li>Debajo del capó, retire la funda del circuito de inoculación bacteriana y extiéndala con cuidado, rayando en la placa de agar, siguiendo un patrón en zig-zag. Repita este paso usando un plato separado como duplicado. Se pueden rayar hasta cinco placas con el mismo bucle.</li>
	<li>Incubar las placas durante la noche a 37 °C para un crecimiento óptimo de las bacterias. Deje pasar las bacterias diariamente durante 3 días. Calentar las placas de agar sangre durante 15 min a 37 °C, tomar entre 15 y 20 colonias de la primera placa de agar utilizando un asa de inoculación desechable y extenderlas en una nueva placa de agar precalentada. Etiquete el plato de manera adecuada.</li>
</ol>2. Crecimiento y almacenamiento de bacterias para uso futuro
<ol><li>Después de 3 días, recoja hasta 30 colonias de la placa de agar sangre con un bucle de rayas y colóquelas directamente en un matraz de 250 ml que contenga caldo Todd Hewitt (caldo TH). Incubar a 37 °C, agitando a 250 rpm, con 5% de CO2 durante aproximadamente 4 h.</li>
	<li>Tome alícuotas cada 15 minutos para medir el diámetro exterior de620 nm hasta que alcance 0,3, lo que equivale a aproximadamente 3 x 108 unidades formadoras de colonias (UFC) por ml.</li>
	<li>Retire 1 mL del nuevo stock de bacterias inmediatamente en viales criogénicos de 2 mL. Congele rápidamente los viales recién alículos en nitrógeno líquido durante 5 min. Almacene las alícuotas de bacterias en un congelador a -80 °C (los viales se pueden utilizar hasta 6-8 meses antes de que pierdan potencia).</li>
	<li>Después de 7 días de congelación, las alícuotas se pueden utilizar para estudios en animales. Por lo tanto, determine la nueva concentración de las bacterias.</li>
</ol>3. Descongelación de bacterias para la instilación intratraqueal
<ol><li>Calentar una placa de agar sangre durante 10 minutos a 37 °C en una coctelera. Tome uno de los nuevos viales de reserva del congelador y descongélelo agitándolo suavemente en un baño de agua a 37 °C durante aproximadamente 2 minutos. Evite tocar la junta tórica o la tapa con agua tibia.</li>
	<li>Placa en una placa de agar sangre para contar manualmente las colonias bacterianas. Realice una dilución de 1 x 10-6 y coloque 200 μL de la última dilución en una placa de agar sangre precalentada. Hazlo por duplicado.</li>
	<li>Incubar las placas durante la noche a 37 °C para un crecimiento óptimo de las bacterias. Al día siguiente, aplicar la siguiente fórmula para determinar la nueva concentración bacteriana: UFC/mL = (número de colonias x factor de dilución) / volumen de caldo sembrado</li>
</ol>4. Instilación intratraqueal de bacterias vivas
NOTA: Este protocolo ha sido optimizado para instilar un volumen de 50 μL por vía intratraqueal. Las existencias bacterianas se pueden almacenar hasta 6-9 meses. Para asegurar la presencia de UFC bacterianas en cada vial, asegúrese de colocarlo en una placa antes de cada experimento, calcule la UFC de reserva bacteriana como se describió anteriormente y use caldo TH para diluciones posteriores.
PRECAUCIÓN: Debajo del gabinete de bioseguridad, realice un procedimiento de supervivencia de roedores utilizando instrumentos quirúrgicos estériles.
<ol><li>Anestesiar al ratón inyectando por vía intraperitoneal 100 mg/kg de ketamina y 2,5 mg/kg de acetilpromazina. Repita el procedimiento para el número de ratones que se inyectan a la vez. NOTA: Los ratones pueden estar expuestos al isoflurano para facilitar el manejo de los animales. Sin embargo, un manipulador experimentado que sea capaz de inyectar anestésicos intraperitoneales sin causar un sufrimiento significativo en los animales puede evitar la exposición al isoflurano. El número de ratones a inyectar depende de la experiencia del cirujano.</li>
	<li>Después de que todos los ratones estén bajo la anestesia adecuada, confirme la anestesia con un pellizco de cola. Coloque el ratón anestesiado sobre una superficie limpia y esterilizada, cuelgue al animal por los incisivos y pegue suavemente las extremidades anteriores con cinta adhesiva (Figura 1A). NOTA: Para garantizar el bienestar animal, proporcionar lubricación corneal en todos los animales anestesiados. Se pueden utilizar colirios de carboximetilcelulosa, aplicando una gota por ojo.</li>
	<li>Afeitar la región del cuello y desinfectar la zona con clorhexidina y alcohol al 70%. Con unas tijeras quirúrgicas, realice una incisión superficial de 1 cm en la línea media del cuello para visualizar la tráquea (Figura 1B). Una pequeña incisión debería ser suficiente, pero si se observa una abundancia de tejido graso, diseccione cuidadosamente el tejido adiposo verticalmente para visualizar la tráquea. NOTA: Utilice guantes estériles e instrumentos estériles mediante la técnica de solo puntas. El riesgo de infección es mínimo si el procedimiento se realiza en condiciones estériles.</li>
	<li>Con fórceps, intuble cada ratón. Tire suavemente de la lengua hacia afuera e introduzca un angiocatéter de 20 G a través de la boca, avanzando el catéter hacia la tráquea. Aplique una presión suave sobre la tráquea para facilitar la intubación. NOTA: Debido a que la tráquea es anterior al cuerpo del ratón, doble ligeramente la punta del catéter, ya que esto ayudará a obtener el ángulo para intubar con éxito al ratón. La incisión en el cuello se realiza principalmente con fines de visualización; Alternativamente, el operador puede intubar la tráquea a ciegas.</li>
	<li>Después de la intubación, conecte el ratón a un respirador para confirmar la intubación. Los parámetros regulares del ventilador utilizados en este procedimiento son 200 μL de volumen sistólico y 200 brazadas por minuto. Suba y/o baje brevemente la tasa del ventilador para una confirmación rápida y sencilla.</li>
	<li>Después de confirmar la intubación, desconecte el ratón del respirador y instile cuidadosamente 50 μL del agente bacteriano a través del angiocatéter con una punta de carga de gel de pipeta de 200 μL. Para ratones control, inyectar 50 μL de caldo TH estéril.</li>
	<li>Después de instilar el agente bacteriano, vuelva a conectar el ratón al respirador para ayudar a reiniciar la respiración. Deje el ratón en el respirador durante 30-60 s. Después de inyectar a todos los ratones, controle su respiración. Si hay un patrón de respiración lento, vuelva a conectar los ratones al respirador.</li>
	<li>Cierre la incisión agregando una pequeña gota de pegamento sobre la piel. Junta los pliegues de la piel y aplica una presión suave hasta que el pegamento se seque.</li>
	<li>Coloque a los ratones en una almohadilla térmica para su recuperación y vigílelos de cerca hasta que recuperen la conciencia suficiente. Transfiera a los ratones de regreso a la jaula una vez que estén completamente recuperados. Para el tratamiento del dolor/sufrimiento postoperatorio, los ratones pueden ser tratados con buprenorfina, con una dosis de 0,05-0,1 mg/kg por vía subcutánea (SC). NOTA: Los animales con una pérdida de peso superior al 20% o que experimentan una angustia significativa después del procedimiento, como letargo, incapacidad para alcanzar agua o comida, dificultad para respirar, deterioro de la respuesta a estímulos externos o disminución del estado de alerta mental, deben ser sacrificados.</li>
</ol>5. Lavado broncoalveolar y extracción pulmonar
<ol><li>Aplicar la eutanasia al ratón colocándolo en un recipiente cerrado que contenga un 5% de isoflurano. Continúe la exposición al isoflurano durante 1 minuto después de que el ratón deje de respirar. Realizar una toracotomía para confirmar la eutanasia. NOTA: Confirmar la eutanasia mediante un examen visual y físico. El corazón debe haber dejado de latir y los ratones no respirar. Las membranas mucosas deben ser blancas o pálidas.</li>
	<li>Coloque el ratón en posición supina sobre una tabla quirúrgica limpia y cuélguelo por los incisivos. Rocíe la piel del ratón con etanol al 70%. Con unas tijeras quirúrgicas, haga una pequeña incisión superficial en la línea media del cuello para visualizar la tráquea del ratón.</li>
	<li>Cánula de la tráquea con un catéter de 20 G. Con cuidado, agregue 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) libre de calcio por vía intratraqueal, usando una jeringa de 1 mL. Permita la expansión completa del pulmón y luego aspire el líquido con la misma jeringa. Repita este paso hasta un total de 2 ml.</li>
	<li>Transfiera el BAL a una alícuota de 2 mL. Realice este paso dos veces para obtener un volumen final de 2 ml. No lave los pulmones con más de 1 ml a la vez, debido al alto riesgo de alteración del espacio alveolar.</li>
	<li>Abra la cavidad torácica y exponga el pulmón, el corazón y la tráquea con tijeras y fórceps. Diseccione cuidadosamente el diafragma y retire la caja torácica. Asegúrese de no pellizcar el tejido pulmonar.</li>
	<li>Transectar la aorta abdominal para permitir la exanguinación. Perfundir el tejido pulmonar haciendo una pequeña incisión de aproximadamente 2 mm en el ventrículo derecho con unas tijeras e inyectar 5 mL de PBS frío con un catéter de 20 G. El PBS debe perfundir el pulmón. Si se realiza una perfusión adecuada, el tejido pulmonar se volverá blanco pálido y el PBS saldrá del compartimento intravascular a través de la aorta abdominal.</li>
	<li>Con cuidado, extraiga los pulmones y diseccionelos de la tráquea para realizar la histología o el procesamiento posterior a una suspensión unicelular.</li>
	<li>Si se procesa para histología, inserte cuidadosamente un catéter de 20 G para inflar los pulmones hasta 25 cm H2O con solución de formol (10% tamponado neutro). Una vez que los pulmones estén insuflados, pase una cuerda de sutura 3.0 de unos 5 cm de largo por debajo de la tráquea y átela firmemente dos veces para asegurarse de que la formalina permanezca en el tejido pulmonar. Diseccione suavemente el pulmón del resto de los tejidos y colóquelo en un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de solución de formalina.</li>
</ol>6. Procesamiento de lavado broncoalveolar
<ol><li>Centrifugar el BAL a 500 x g a 4 °C durante 5 min. Retire el sobrenadante libre de células en un tubo separado y guárdelo a -80 °C. NOTA: Se pueden realizar análisis adicionales en el sobrenadante BAL, incluida la cuantificación de proteínas (por ejemplo, ensayo BCA13) o la medición de biomarcadores específicos o citocinas (ensayos ELISA y ensayos múltiples con plataformas como MSD y Luminex).</li>
	<li>Lisar los glóbulos rojos añadiendo 100 μL de tampón lisante durante 1 min. Neutralizar la reacción de lisis añadiendo 1 mL de PBS. Centrifugar el BAL a 500 x g a 4 °C durante 5 min y retirar el sobrenadante.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células en PBS (100-300 μL; según el tamaño de los gránulos de las células). Realice un recuento de células con tinción de azul de tripano al 0,4% mediante recuento de células manual o automatizado. Utilice el gránulo restante para la tinción por citometría de flujo y/o la criopreservación (mediante la resuspensión en una solución criopreservante) en nitrógeno líquido para realizar más pruebas.</li>
</ol>7. Procesamiento pulmonar para suspensión unicelular
<ol><li>Diseccione suavemente el pulmón del resto de los tejidos y colóquelo en un tubo cónico de 15 mL que contenga 5 mL de PBS frío. Retire el pulmón del PBS y séquelo con una toalla de papel.</li>
	<li>Prepare un cóctel de digestión añadiendo 1 mg de DNasa y 5 mg de colagenasa en 1 mL de medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) bajo en glucosa. Transfiera el pulmón a un tubo C que contiene 1 mL de cóctel de digestión.</li>
	<li>Transfiera la sonda C al disociador tisular y siga el protocolo estandarizado para el procesamiento del tejido pulmonar14.</li>
	<li>Agregue 10 ml de PBS frío en el tubo C y mezcle correctamente. Filtre la suspensión de una sola célula utilizando un filtro de células de 70 μm sobre un tubo cónico de 50 mL. Realice la filtración dos veces.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión a 500 x g a 4 °C durante 5 min. Decantar cuidadosamente el sobrenadante y añadir 1 mL de tampón lisante durante 1 min a temperatura ambiente. Agregue 10 mL de PBS frío para detener la reacción de lisis y eliminar el sobrenadante.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión a 500 x g a 4 °C durante 5 min. Decantar cuidadosamente el sobrenadante y añadir 10 mL de PBS frío.</li>
	<li>Realice un recuento de células con tinción de azul de tripán mediante recuento de células manual o automatizado. Utilice un pellet de célula para la tinción por citometría de flujo y/o criopreservación en nitrógeno líquido para realizar pruebas adicionales.</li>
</ol>

<ol><li>Bellani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology%2C+patterns+of+care%2C+and+mortality+for+patients+with+acute+respiratory+distress+syndrome+in+intensive+care+units+in+50+countries%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Epidemiology, patterns of care, and mortality for patients with acute respiratory distress syndrome in intensive care units in 50 countries.</a> JAMA. 315 (8), 788-800 (2016).</li>
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<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1266(2009).</li>
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<li>D'Alessio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resolution+of+experimental+ARDS+through+IL-4-mediated+lung+macrophage+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Enhanced resolution of experimental ARDS through IL-4-mediated lung macrophage reprogramming.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (8), L733-L746 (2016).</li>
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<li>Gotts, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+relevant+model+of+pneumococcal+pneumonia%2C+ARDS%2C+and+nonpulmonary+organ+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Clinically relevant model of pneumococcal pneumonia, ARDS, and nonpulmonary organ dysfunction in mice.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (5), L717-L736 (2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los modelos murinos experimentales de PNA ofrecen una plataforma para evaluar los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a las lesiones y la resolución del SDRA. Los componentes fisiopatológicos que pueden ser evaluados incluyen las vías inflamatorias tempranas, el aclaramiento bacteriano, los cambios dinámicos en el paisaje inmunológico, la resolución de la inflamación, la fibroproliferación y la reparación epitelial y vascular16. Sin embargo, se deben tener en cuenta varios aspectos a la hora de planificar la replicación de este modelo de lesión pulmonar inducida por neumonía, como la edad, el sexo, la cepa del ratón, los factores intrínsecos del huésped (p. ej., estado inmunocomprometido), el patógeno específico y la carga bacteriana utilizada, y la experiencia del personal que realiza el procedimiento.
La PNA es una de las principales causas de SDRA. Se optó por el uso de Spn y Kpn vivos, que son causas prevalentes de PNA adquirida en la comunidad y en el hospital en humanos, respectivamente17. Sugerimos optimizar los modelos bacterianos de PNA mediante el ajuste de dosis de bacterias vivas para lograr el perfil deseado de mortalidad y resolución de lesiones que mejor se ajuste a la hipótesis del investigador. Hemos optimizado una inoculación intratraqueal de bacterias de 3 x 106 UFC para Spn y 200 UFC para Kpn en ratones, lo que causó inflamación alveolar, ruptura de la barrera alveolocapilar y disfunción orgánica (Figura 2). Sin embargo, los lotes bacterianos de diferentes fuentes o incluso dentro de bucles duplicados pueden mostrar diferentes grados de inflamación y lesiones, incluso cuando se usa la misma cepa y UFC.
Por lo tanto, para replicar los resultados presentados en este manuscrito, los investigadores deben comenzar con la concentración de bacterias descrita aquí; sin embargo, es posible que deban aumentar o disminuir la dosis para obtener un perfil de modelo similar. Por lo tanto, cada nuevo lote de bacterias utilizado debe optimizarse para su posible efecto de resolución de lesiones. Presentamos un modelo robusto de PNA con dos resultados de resolución diferentes, uno de resolución automática (Spn) y otro de resolución lenta/no resolutiva (Kpn) que pueden servir como plataformas para que los investigadores evalúen los mecanismos inmunológicos y prueben intervenciones terapéuticas, particularmente en o después del pico de infección (por ejemplo, 2 días después de la infección).
La edad, el sexo, la tensión y los factores genéticos influyen en la cinética de los patrones de resolución de las lesiones16. Por ejemplo, el sexo hace que la resolución sea acelerada en las mujeres en comparación con los hombres18; Por lo tanto, un aumento de la carga bacteriana conduce a un aumento de la mortalidad y a un retraso en la resolución en los machos en comparación con las hembras. El envejecimiento es otro factor a tener en cuenta a la hora de valorar la UFC de las bacterias utilizadas. Los ratones envejecidos mostraron una mortalidad del 100% cuando usamos la dosis especificada de Spn (no se muestra aquí). Los ratones jóvenes se utilizan con mayor frecuencia en los modelos de PNA neumocócica (que van de 6 a 14 semanas), mientras que los ratones envejecidos (19-26 meses de edad) muestran una respuesta inmune alterada y se utilizan para investigar el papel del envejecimiento en la PNA11 . Tuvimos que disminuir la UFC hasta un 300% para lograr la supervivencia en animales envejecidos (no se muestra aquí). En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6 (8-12 semanas de edad) y se les hizo un seguimiento durante 6 a 10 días después de la infección. También se pueden encontrar diferencias significativas en la susceptibilidad entre cepas; Las cepas endogámicas como BALB/C y C57BL6/J tienen diferentes respuestas a la infección11,19.
La inoculación directa de bacterias por vía intratraqueal permite una entrega más precisa del inóculo (hasta un 99%) en los pulmones12, representando una alternativa para serotipos menos virulentos y disminuyendo la aerosolización de bacterias11. Sin embargo, se puede argumentar que se trata de un procedimiento invasivo. La intubación puede ser un desafío, requiere anestesia sistémica y puede provocar un traumatismo traqueal con edema y estridor posteriores en las vías respiratorias. Los ratones pueden desarrollar un reflejo vasovagal que conduce a la apnea, para lo cual se requiere tener un pequeño ventilador de ratón para proporcionar soporte adicional al ventilador cuando sea necesario. La experiencia del cirujano que realiza el procedimiento es un componente crítico para garantizar el éxito de la intubación11. En nuestro estudio, ningún ratón necesitó ser sacrificado debido al manejo adecuado del dolor y no más del 20% de pérdida de peso corporal. No se observaron signos de dolor y angustia, como letargo, incapacidad para alcanzar agua o alimentos, dificultad para respirar o disminución del estado de alerta mental. Un método alternativo de administración directa de bacterias a los pulmones es la aspiración orofaríngea, aunque la resolución de la lesión pulmonar parece ocurrir más rápido, y algunas bacterias pueden terminar en el estómago y el tracto gastrointestinal20.
Los modelos preclínicos de PNA permiten a los investigadores evaluar el panorama inmunitario. Los compartimentos broncoalveolares e intersticiales pueden ser evaluados para detectar cambios dinámicos en las células inmunitarias16. Además, las células pueden cultivarse y estimularse ex vivo para determinar su producción específica de citocinas y quimiocinas. Aquí, nos centramos en explorar el panorama de las células inmunitarias en el pulmón y el BAL mediante el uso de citometría de flujo multicolor. La secuenciación de ARN de una sola célula también se puede realizar para comprender las firmas transcriptómicas específicas de la célula en diferentes etapas de la resolución de lesiones.
Los modelos de PNA-SDRA generan efectos sistémicos que pueden ser detectados precozmente midiendo el peso corporal durante el curso de la enfermedad10. Aunque no medimos directamente los efectos sistémicos del SDRA, la disfunción orgánica también se puede evaluar mediante la medición de la sangre de los perfiles químicos y mediante la recolección de diferentes tejidos como el bazo, el riñón y el hígado para la histología. Los efectos sistémicos del PNA-SDRA neumocócica han sido descritos previamente por otros grupos que utilizan la misma cepa de bacterias21.
Aquí, se describe un modelo de PNA experimental que se asemeja a algunos de los hallazgos fisiopatológicos clave que subyacen al SDRA humano. Aunque no existen modelos ideales que recapitulen completamente la complejidad y heterogeneidad del SDRA humano9, estos modelos son relevantes y reproducibles para estudiar los mecanismos de lesión y reparación pulmonar, sirviendo también como plataforma para la identificación de nuevas dianas farmacológicas potenciales que se centran en acelerar la resolución de la inflamación pulmonar y promover la reparación pulmonar.

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<img alt="Body weight and immune cell count graphs; infection time course; statistical analysis; infection study." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig02v3.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2">

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Erratum: Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia

El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) sigue siendo un síndrome letal e incapacitante común que afecta aproximadamente al 10% de los pacientes de la unidad de cuidados intensivos (UCI) y hasta al 23% de las personas bajo ventilación mecánica, lo que lleva a una tasa de mortalidad hospitalaria del 35%-46%1. Además, la reciente pandemia de COVID-19 ha vuelto a enfatizar la importancia de estudiar el SDRA. Los casos positivos de COVID-19 han sido responsables de un aumento de la mortalidad por SDRA, lo que pone de manifiesto la limitación de las terapias farmacológicas2.
En humanos, el SDRA se caracteriza por la rápida aparición de hipoxemia (PaO2/FiO2 < 300) y evidencia de edema pulmonar bilateral no hidrostático debido a una permeabilidad alveolar-capilar excesiva y alveolitis3. Aunque el SDRA se ha descrito tradicionalmente como un patrón de lesión pulmonar aguda (LPA) secundaria a una variedad de agresiones, la neumonía bacteriana y viral (PNA) sigue siendo una de las causas más comunes. Se han descrito tres etapas fisiopatológicas principales, a saber, las etapas exudativa, proliferativa y fibrótica, mientras que las dos principales características cardinales del SDRA son la inflamación desregulada y la disrupción alveolocapilar4. Durante estos procesos, la lesión alveolar se produce por la liberación de citocinas inflamatorias (p. ej., factor de necrosis tumoral [TNF-α], interleucina [IL-1β, IL-6, IL-8, etcetera.]), una afluencia de neutrófilos y macrófagos inflamatorios, y la inundación de líquido rico en proteínas. En última instancia, estos eventos conducen a daño alveolar irregular y bilateral 5,6,7,8.
Aunque se han logrado avances significativos en la comprensión de la lesión pulmonar temprana y la inflamación, los mecanismos subyacentes a la resolución de la PNA son menos conocidos y deberían ser el foco de futuras investigaciones mecanicistas. El objetivo principal de este trabajo metodológico es proporcionar a los investigadores un modelo de resolución de lesiones de neumonía infecciosa que pueda replicar las principales características fisiopatológicas del SDRA. Proponemos que este modelo ayudará a comprender mejor los mecanismos biológicos que subyacen a la resolución de la inflamación y reparación pulmonar, sirviendo así como una plataforma para las terapias de rescate.
Los principales estadios fisiopatológicos que ocurren durante el SDRA pueden replicarse en modelos animales preclínicos de ALI, que deben incluir una evidencia histológica de respuesta inflamatoria, lesión tisular, disfunción fisiológica, alveolitis y alteración de la barrera alveolar-capilar9. Un modelo de ratón que induce PNA y ALI es ventajoso debido a su alta reproducibilidad, rápida reproducción y la disponibilidad de múltiples herramientas para realizar estudios mecanicistas y moleculares. No existe un modelo único que recapitule completamente todas las características del SDRAhumano 9.
Los modelos de PNA en ratones permiten replicar los mecanismos fisiopatológicos clave producidos por el SDRA infeccioso en humanos, como el inicio rápido, la evidencia de lesión tisular en histología, el deterioro de la barrera alveolo-capilar, la evidencia de respuesta inflamatoria y la disfunción fisiológica, al tiempo que producen una mortalidad modesta10 . Los modelos infecciosos pueden ser inducidos por la administración local o sistémica del patógeno, siendo la administración intranasal, intratraqueal e intravenosa las vías de administración más frecuentes. La vía intratraqueal permite la inoculación directa del agente infeccioso en los pulmones, disminuyendo la aerosolización y optimizando la entrega11,12.
Se describe aquí la metodología para un modelo murino preclínico de PNA por instilación intratraqueal de Streptococcus pneumoniae (Spn) vivo o Klebsiella pneumoniae (Kp ). Estos modelos representan un buen sustituto del SDRA producido por el ARP bacteriano, ya que poseen varias ventajas, entre ellas: causas prevalentes del SDRA-PNA humano (adquiridas en la comunidad y en el hospital); alta reproducibilidad; La mortalidad y las lesiones se pueden ajustar fácilmente (modelando diferentes grados de inflamación pulmonar) para exhibir una respuesta inflamatoria robusta, lo que conduce a alveolitis y disfunción alveolocapilar; la evaluación de las fases tempranas y tardías de la lesión pulmonar y su resolución; y la evaluación de estrategias terapéuticas en diferentes estadios del PNA-SDRA.

<table><tbody><tr><td>1-200 y micro; L Puntas de pipeta redondas con carga de gel de 0,5 mm de espesor</td><td>Corning</td><td>4853</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Viales criogénicos</td><td>Corning Incorporated</td><td>431420</td><td>2 mL autoportantes, fondo redondo, tapa roja, polipropileno</td></tr><tr><td>2 mL Eppendorf&nbsp; Microcentrífuga con tapa a presión Biopur Tubos de bloqueo</td><td>seguro Fisherscientific</td><td>05-402-24C</td><td>Forma:&nbsp; Redondo, longitud (métrico):&nbsp; 38 mm, diámetro (métrico) exterior:&nbsp; 10 mm, capacidad (métrica):&nbsp; 2mL</td></tr><tr><td>70 y micro; m Colador de celdas</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>Blanco, Estéril, Empaquetado Individualmente</td></tr><tr><td>96 pocillos Clear Round Bottom</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td>&nbsp; Microplaca de cultivo celular tratada con TC, con tapa, envuelta individualmente, inyección estéril</td></tr> de <tr><td>maleato de acepromizina, USP 500 mg/50 mL (10 mg/mL)</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-604-04</td><td>CADA mL CONTIENE: maleato de acepromazina 10 mg, citrato de sodio 0,36%, ácido cítrico 0,075%, alcohol bencílico 1% y agua para inyección.</td></tr><tr><td>Tampón de lisado de cloruro de amonio-potasio (ACK)</td><td>Calidad biológica</td><td>118-156-721</td><td>4 x 100mL</td></tr><tr><td>Anti-ratón I-A/I-E</td><td>Biolegend</td><td>107628</td><td>APC/Cyanine7 anti-ratón I-A/I-E [M5/114.15.2]; Isotipo: Rata IgG2b</td></tr><tr><td>BCA Kit de ensayo de proteínas</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>BD Tripticasa Agar de soja&nbsp;</td><td>BD-Biosciences</td><td>90001-276</td><td>5% Placas apiladoras de medios preparados con sangre de oveja, BD Diagnostics</td></tr><tr><td>Biotix Depósitos de reactivos desechables Biotix</td><td>Biotix</td><td>89511-194</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrih</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>CD103</td><td>Invitrogen</td><td>509723</td><td>Integrina alfa E) Hámster armenio anti-ratón, FITC, Clon: 2E7</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Invitrogen</td><td>RM2817</td><td>PE-Texas Red, Clon: M1/70.15, Invitrogen</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BD Biosciences</td><td>565872</td><td>Hamster anti-Mouse, APC-R700, Clon: N418, BD Horizon</td></tr><tr><td>CD19</td><td>Biolegend</td><td>152410</td><td>APC anti-ratón CD19 [1D3/CD19]; Isotipo: Rata IgG2a, &kappa;</td></tr><tr><td>CD24</td><td>BD Biosciences</td><td>563450</td><td>Rata anti-Ratón, Violeta Brillante 711, Clon: M1/69</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>563790</td><td>BUV395; Clon: GK1.5</td></tr><tr><td>CD45 Biolegend</td><td></td><td>103157</td><td>Brilliant Violet 750 anti-ratón CD45 [30-F11]; Isotipo: Rata IgG2b, &kappa;;</td></tr><tr><td>CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>612759</td><td>Rata antimurina, Ultravioleta brillante 737, Clon: 53-6.7</td></tr><tr><td>Portaobjetos de recuento de células&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>1450017</td><td>para TC20 Cell Counter</td></tr><tr><td>Cell Strainer 70 &micro; L Nylon</td><td>Falcon</td><td>198718</td><td>REF 352350</td></tr><tr><td>Colágenosa Tipo1&nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>Culti-Loop Streptococcus pneumoniae &nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>R4609015</td><td>ATCC 4961</td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I de páncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrih</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Asas/agujas de inoculación desechables</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-603</td><td>Color azul; Volumen 1 y micro; L</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s Águila Modificada' s Medium)</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fc Block</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>CD16/CD32 Rat anti-Mouse, sin etiquetar, Clon: 2.4G2</td></tr><tr><td>Solución de formalina</td><td>Sigma-Aldrih</td><td>HT501640</td><td>Solución de formalina, tamponada neutra, 10%</td></tr><tr><td>Esponjas de gasa, Covidien</td><td>Curity</td><td>2146-gentleMACS</td><td></td></tr> <tr><td>C Tubos</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Disociator</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>SN: 4715</td></tr><tr><td>Hema 3 Sistema de tinción manual y paquete estadístico</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>23123869</tr><tr><td>Inhalación de líquido de isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>1182097</td><td></td></tr><tr><td>catéter intravenoso JELCO 20GX1.25 "</td><td>Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc</td><td>405611</td><td></td></tr><tr><td>Inyección de Ketamina HCl</td><td>Henry Schein</td><td>1049007</td><td>Inyección de Ketamina HCl MDV 100 mg / mL 10 mL 10 / Caja</td></tr><tr><td>Klebsiella pneumoniae &nbsp;</td><td>ATCC</td><td>43816</td><td>subsp. pneumoniae (Schroeter) Trevisan</td></tr><tr><td>Loctite 409</td><td>Microscopía Electrónica Ciencias 7257009</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ly-6C</td><td>Biolegend</td><td>128036</td><td>Brilliant Violet 605 anti-ratón Ly-6C [HK1.4]; Isotipo: Rata IgG2c</td></tr><tr><td>Ly-6G</td><td>BD Biosciences</td><td>740157</td><td>Rata anti-Ratón, Violeta Brillante 510, Clon: 1A8, BD Optibuild</td></tr><tr><td>MiniVent Tipo 845</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>4694</td><td>D-79232 March (Alemania)</td></tr><tr><td>NK-1.1</td><td>BD Biosciences</td><td>553165</td><td>Ratón anti-Ratón, PE, Clon: PK136,</td></tr><tr><td>BD Hemacitómetro de Fase</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>1X sin calcio y magnesio,Tubo</td></tr> de ensayo de poliestireno <tr>de <td>fondo redondo</td><td>Sarstedt</td><td>55.476.305</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>con filtro de células Snap Cap, 5 ml</td></tr><tr><td>SealRite 1,5 ml Tubo de microcentrífuga natural</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>Libre de ARNasa, DNasa, ADN y pirógenos detectables.</td></tr><tr><td>Shandon EZ Single Cytofunnel</td><td>Epredia</td><td>A78710003</td><td></td></tr><tr><td>Siglec-F</td><td>BD Biosciences</td><td>562681</td><td>Anti-Ratón, Violeta Brillante 421, Clon: E50-2440</td></tr><tr><td>Seda Negra Trenzada 30" (75 cm) Sutura quirúrgica estéril, no absorbible U.S.P.</td><td>Ethicon</td><td>K-834</td><td>0 (3.5 metric)</td></tr><tr><td>Clip deslizante de acero inoxidable</td><td>Epredia</td><td>59910052</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtro de vacío estériles de un solo uso</td><td>Thermo Scientific</td><td>1660045</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa estéril, de un solo uso, 1 mL</td><td>BD-Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Contador de células automático</td><td>Bio-Rad</td><td>508BR05740</td><td></td></tr><tr><td>TipOne 200 ul pipeta amarilla recambio de punta</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0706</td><td></td></tr><tr><td>TODD HEWITT CALDO</td><td>RPI</td><td>T47500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de muestras TPX</td><td>Epredia</td><td>A78710018</td><td></td></tr><tr><td>TPX Cámara de muestra única, tapas y tarjetas de filtro</td><td>Epredia</td><td>5991022</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Bio-rad</td><td>1450022</td><td></td></tr><tr><td>U-100 Jeringas de insulina</td><td>BD-Biosciences 329461</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica eléctrica multicalentamiento a prueba de humedad</td><td>Cullus</td><td>modelo PR7791AB</td><td>120 volst AC; 45 Vatios; Listado 562B/E26869</td></tr></tbody></table>

modelo experimental para evaluar la resolución de la neumonía

Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia

El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) causa lesión pulmonar aguda, caracterizada por daño alveolar rápido e hipoxemia grave. Esto, a su vez, conduce a una alta morbilidad y mortalidad. En la actualidad, no existen modelos preclínicos que recapitulen la complejidad del SDRA humano. Sin embargo, los modelos infecciosos de neumonía (PNA) pueden replicar las principales características fisiopatológicas del SDRA. En este trabajo describimos un modelo de ANP inducida por la instilación intratraqueal de Streptococcus pneumoniae y Klebsiella pneumoniae vivos en ratones C57BL6. Con el fin de evaluar y caracterizar el modelo, después de inducir la lesión, se realizaron mediciones seriadas de peso corporal y lavado broncoalveolar (LBA) para medir los marcadores de lesión pulmonar. Además, recolectamos pulmones para el recuento de células y diferenciales, la cuantificación de proteínas BAL, el citospin, el recuento de unidades formadoras de colonias bacterianas y la histología. Por último, se realizó citometría de flujo de alta dimensión. Proponemos este modelo como una herramienta para comprender el panorama inmunológico durante las fases de resolución temprana y tardía de la lesión pulmonar.

Los procedimientos descritos anteriormente permitieron modelar los mecanismos fisiopatológicos subyacentes a la lesión pulmonar inducida por neumonía bacteriana en ratones. Para comenzar a modelar, se obtuvieron ratones de tipo salvaje (WT) C57BL/6 del Laboratorio Jackson y se criaron en las instalaciones de animales del instituto. Los ratones machos WT C57BL/6, de 8 semanas de edad, se sometieron a inoculación intratraqueal de caldo TH (control), 3 x 106 UFC de Spn vivo o 200 UFC de Kpn vivo. Después de la infección, los ratones fueron monitoreados durante 6 y 10 días para Spn y Kpn, respectivamente. Aunque los grupos infectados mostraron un peso corporal más bajo en comparación con el control no infectado, el grupo Spn recuperó su peso corporal hacia el valor basal, mientras que los ratones infectados con Kpn mostraron una recuperación lenta después de 6 días de infección (Figura 2A). Durante la duración del estudio, ningún ratón requirió someterse a la eutanasia debido a que su peso corporal superaba el 20%, y no hubo evidencia de dolor y angustia.
Medimos la lesión pulmonar en diferentes intervalos. La concentración de la proteína BAL y el recuento total de células tanto para el BAL como para los pulmones fueron notablemente más altos en los grupos infectados (Figura 2). Se obtuvieron cortes histológicos representativos que muestran el proceso inflamatorio en ambos modelos en los días 2, 4 y 6 después de la inoculación (Figura 3), mostrando evidencia de inflamación alveolar persistente en los ratones infectados con Kpn (Figura 4), incluso en el día 10. Los ratones infectados con Kpn continuaron la lesión el día 10 (Figura 2 y Figura 4), mientras que los ratones infectados con Spn resolvieron la inflamación pulmonar el día 6 (Figura 2 y Figura 3).
Se utilizaron suspensiones pulmonares de células individuales para discriminar el paisaje inmunológico mediante citometría de flujo de alta dimensión en el día 6 después de la infección en el modelo Spn , utilizando un panel de 18 colores en clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Utilizando la inclusión de vecinos estocásticos distribuidos en t (t-SNE), se pueden visualizar las diferencias generales en la composición de las células inmunitarias, siendo notables para un mayor número de granulocitos (CD45+, CD11b+, CD24+, MHC-II-), macrófagos intersticiales (CD45+, CD11b+, MHC-II-, CD24-), monocitos (CD45+, CD11b+, MHC-II-, CD24-, CD64-), células B (CD45+, CD19+) y células T (CD45+, CD3+), incluidas las células asesinas naturales (CD45+, CD3+, NK1.1+), como se muestra en la Figura 5. Las estrategias de compuerta se muestran en la Figura 6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig01.jpg"> Figura 1: Procedimiento quirúrgico para la instilación intratraqueal de bacterias vivas. (A) Posición del ratón en el área quirúrgica estéril, colgando de los incisivos. (B) Área de incisión y exposición de la tráquea. (C) Proceso de intubación insertando el catéter de 20 G. Figura creada con Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig02v3.jpg"> Figura 2: Perfiles de lesión pulmonar aguda (ALI) después de modelos de neumonía. (A) Peso corporal a lo largo del tiempo en relación con el valor basal, control frente a Kpn y Spn (n = 4, por grupo).(B) Cuantificación de la proteína total BAL mediante ensayo BCA (n = 4, por grupo). (C) Recuentos totales de células BAL en control (n = 3), Kpn (n = 4) y Spn (n = 3). (D) Recuentos pulmonares totales de células en control (n = 3), Kpn (n = 4) y Spn (n = 3). (E-G) Diferencial de células BAL por recuento histológico manual del citospín BAL en control (n = 3), Kpn (n = 4) y Spn (n = 3). Las pruebas estadísticas se realizaron mediante t-test individual, comparando el control no infectado con los grupos infectados. *p &lt; 0,05. Los datos se muestran utilizando el error estándar (SE) para cada gráfico. El eje y es días después de la infección para todos los paneles. Abreviaturas: BAL = lavado broncoalveolar; Spn = Streptococcus pneumoniae; Kpn = Klebsiella pneumoniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig02v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig03.jpg"> Figura 3: Hallazgos histopatológicos pulmonares durante la infección por Spn . Tinción con hematoxilina y eosina (H&amp;E) de secciones histológicas de un LBA representativo y una sección pulmonar después de la infección intratraqueal de Spn y en los días 2, 4 y 6. Aumento de BAL = 100x; Aumento pulmonar = 10x. Abreviaturas: BAL = lavado broncoalveolar; Spn = Streptococcus pneumoniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig04.jpg"> Figura 4: Hallazgos histopatológicos pulmonares durante la infección por Kpn . Tinción con hematoxilina y eosina (H&amp;E) de secciones histológicas de un LBA representativo y una sección pulmonar después de la infección intratraqueal de Kpn en los días 2, 4, 6 y 10. Las imágenes muestran un aumento de alta potencia (barra de escala = 50 μm). Abreviaturas: BAL = lavado broncoalveolar; Kpn = Klebsiella pneumoniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig05.jpg"> Figura 5: Panorama de las células inmunitarias mediante citometría de flujo multicolor después de 6 días de infección por Spl . (A) Se utilizó la incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en T (T-SNE) para visualizar las poblaciones de células inmunitarias (CD45+) del pulmón comparando el grupo de control no infectado con el grupo infectado. (B) Resumen de las frecuencias de células inmunitarias del total de células CD45+ en el pulmón. (C) Recuento total de células de cada población individual. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante pruebas t entre el control y los infectados. *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001. Los datos se muestran utilizando el error estándar (SE) para cada gráfico. Abreviaturas: BAL = lavado broncoalveolar; Spn = Streptococcus pneumoniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63925/63925fig06.jpg"> Figura 6: Estrategias de activación para identificar la subpoblación de células inmunitarias en los pulmones al inicio y después de la neumonía. El LBA y la suspensión de células pulmonares se sometieron a tinción para citometría de flujo multicolor. Los escombros se cerraron primero usando SSC-A y FSC-A, y las celdas individuales se cerraron mediante dos estrategias (SSC-W vs. SSC-H y FSC-W vs. FSC-H). Las células vivas se identificaron mediante el uso de un discriminador vivo/muerto frente a SSC-A. Las poblaciones celulares posteriores fueron identificadas por marcadores previamente identificados 15. Abreviatura: BAL = lavado broncoalveolar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63925/63925fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este manuscrito describe el establecimiento de un modelo infeccioso de neumonía en ratones y la respectiva caracterización de la resolución de lesiones junto con métodos para el crecimiento de bacterias y la instilación intratraqueal. También se describe un enfoque novedoso que utiliza citometría de flujo de alta dimensión para evaluar el panorama inmunitario.

Modelo experimental para evaluar la resolución de la neumonía

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) causes acute lung injury, characterized by rapid alveolar damage and severe hypoxemia. This, in turn, leads to ...

Este protocolo proporciona un modelo reproducible de la neumonía que genera una lesión pulmonar aguda robusta. Otras ventajas de este modelo es que se puede utilizar para reproducir el SDRA infeccioso o el síndrome de dificultad respiratoria aguda en ratones. Como mencioné, este modelo es altamente reproducible donde el nivel de mortalidad y lesión se puede ajustar fácilmente para evaluar las fases tempranas y tardías de la lesión pulmonar aguda y su resolución, lo que sirve como plataforma para evaluar estrategias terapéuticas.Aunque este protocolo no proporciona un enfoque novedoso para el diagnóstico o tratamiento de la lesión pulmonar, es un modelo fiable donde se pueden probar nuevas terapias, lo que resulta especialmente útil para áreas relacionadas con la inmunología, las enfermedades pulmonares y las enfermedades infecciosas. Una de las ventajas de esta técnica es su reproducibilidad. Sin embargo, las personas que realizan esta técnica por primera vez pueden experimentar dificultades para insertar el catéter por vía intratraqueal.Es por eso que idealmente, las personas que aprenden esta técnica deberían comenzar a practicar en animales eutanasiados. Para comenzar, caliente una placa de agar sangre durante 10 minutos a 37 grados centígrados en una coctelera o incubadora caliente. Tome un nuevo vial de reserva bacteriana del congelador y descongélelo agitándolo suavemente en un baño de agua a 37 grados centígrados hasta que el vial esté completamente descongelado.Evite tocar la junta tórica o la tapa con agua tibia. Para contar manualmente las colonias bacterianas en una placa, realice una dilución de 1 vez 10 a la sexta y coloque 200 microlitros de la última dilución en una placa de agar sangre precalentada. Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados.Al día siguiente, determine la nueva concentración bacteriana aplicando la fórmula dada. Coloque el ratón anestesiado sobre una superficie limpia y esterilizada. Cuelgue el ratón por los incisivos y pegue suavemente las extremidades delanteras.Afeitar la región del cuello y desinfectar la zona con clorhexidina y alcohol al 70%. Luego, con unas tijeras quirúrgicas, haga una incisión de un centímetro en la línea media superficial del cuello para visualizar la tráquea. Si se observa una abundancia de tejido graso, diseccione cuidadosamente el tejido adiposo verticalmente para visualizar la tráquea.Tire suavemente de la lengua hacia afuera e introduzca un angiocatéter de calibre 20 a través de la boca, avanzando el catéter hacia la tráquea. Aplique una presión suave sobre la tráquea para facilitar la intubación. Después de la intubación, conecte el ratón a un respirador para confirmar la intubación.Ajuste los parámetros del ventilador a 200 microlitros de volumen corriente y 200 golpes por minuto. Después de confirmar la intubación, desconecte el ratón del respirador y instile cuidadosamente 50 microlitros del agente bacteriano a través del catéter angioico con una pipeta de 200 microlitros, punta de carga de gel. Después de la instalación, vuelva a conectar el mouse al respirador para ayudar a reiniciar la respiración.Deje el ratón en el respirador durante 30 a 60 segundos para controlar la respiración. Si se observa un patrón de respiración lenta, vuelva a conectar el ratón al respirador. Cierre la incisión agregando una gota de pegamento a la piel.Junta los pliegues de la piel y aplica una presión suave hasta que el pegamento se seque. Coloque el ratón eutanasiado en decúbito supino sobre una tabla quirúrgica limpia y cuélguelo por los incisivos. Después de rociar la piel del ratón con etanol al 70%, con unas tijeras, haga una pequeña escisión superficial de la línea media del cuello para visualizar la tráquea.Cánula de la tráquea con un catéter de calibre 20 y agregue cuidadosamente un mililitro de PBS libre de calcio por vía intratraqueal con una jeringa de un mililitro. Permita la expansión completa del pulmón, luego aspire el líquido con la misma jeringa. Repita el procedimiento dos veces para un total de dos mililitros.Transfiera el lavado broncoalveolar, o BAL, a una alícuota de dos mililitros. Con unas tijeras, abra la cavidad torácica para exponer el pulmón, el corazón y la tráquea. Diseccione cuidadosamente el diafragma y retire la caja torácica, asegurándose de no pellizcar el tejido pulmonar.Transectar la aorta abdominal para permitir la exanguinación. Perfundir el tejido pulmonar haciendo una pequeña incisión de aproximadamente uno a dos milímetros en el ventrículo derecho con unas tijeras e inyectando cinco mililitros de PBS frío, utilizando un catéter de calibre 20. Tras una perfusión exitosa, el tejido pulmonar se vuelve blanco y pálido, y el PBS abandona el compartimento intravascular a través de la aorta abdominal.A continuación, extraiga cuidadosamente el pulmón y diseccionelo de la tráquea. Alternativamente, si el pulmón se está utilizando para la histología, inserte cuidadosamente un catéter de calibre 20 para inflar los pulmones hasta 25 centímetros con una solución de formalina. Una vez que los pulmones estén insuflados, pase una cuerda de sutura 3/O de unos cinco centímetros de largo por debajo de la tráquea y átela firmemente dos veces para asegurarse de que la formalina permanezca en el tejido pulmonar.Diseccione suavemente el pulmón del resto de los tejidos y colóquelo en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de solución de formalina. Centrifugar el BAL a 500 g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos y retirar el sobrenadante libre de células en un tubo separado. Lisar los glóbulos rojos añadiendo 100 microlitros de tampón lisante durante un minuto.Neutralizar la reacción de lisis añadiendo un mililitro de PBS. Centrifugar el BAL y eliminar el sobrenadante antes de volver a suspender el pellet en 100 a 300 microlitros de PBS. A continuación, realice un recuento de células con tinción de azul de tripano al 0,4% mediante recuento de células automatizado.Diseccione suavemente el pulmón de los tejidos en un tubo cónico de 15 mililitros que contiene cinco mililitros de PBS frío. Después de la disección, retire el pulmón del PBS y séquelo con una toalla de papel. Diseccionar el pulmón derecho e izquierdo de otros tejidos que también se extrajeron como la tráquea.Prepare un cóctel de digestión como se describe en el manuscrito del texto y transfiera el pulmón a un tubo C que contenga un mililitro de cóctel de digestión. Transfiera el tubo al disociador de tejidos y siga el protocolo estandarizado para el procesamiento de tejido pulmonar. Después de la disociación, agregue 10 mililitros de PBS frío en el tubo y mezcle correctamente.Filtre la suspensión unicelular con un colador de celdas de 70 micras sobre un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. Centrifugar la suspensión y retirar el sobrenadante. Añadir un milímetro de tampón lisante durante un minuto a temperatura ambiente.A continuación, añada 10 mililitros de PBS frío para detener la reacción de lisis y eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en PBS y realice un recuento de células con tinción de azul de tripán mediante recuento de células automatizado. Después de la lesión pulmonar inducida por neumonía bacteriana en ratones, los grupos infectados mostraron un peso corporal más bajo en comparación con el control no infectado.El grupo de Streptococcus pneumoniae o Spn recuperó su peso corporal hacia el valor basal, mientras que los ratones infectados con Klebsiella pneumoniae o Kpn mostraron una recuperación lenta después de seis días de infección. La concentración de la proteína BAL y el recuento total de células tanto para el BAL como para los pulmones fueron marcadamente más altos en los grupos infectados. Se obtuvieron secciones histológicas representativas que muestran el proceso inflamatorio en ambos modelos en los días dos, cuatro y seis después de las inoculaciones, mostrando evidencia de inflamación alveolar persistente en los ratones infectados con Kpn, incluso en el día 10.Los ratones infectados con Kpn continuaron la lesión al día 10, mientras que los ratones infectados con Spn resolvieron la inflamación pulmonar al sexto día. El paisaje de las células inmunitarias mediante citometría de flujo multicolor después de seis días de infección por Spn mostró un mayor número de granulocitos, macrófagos intersticiales, monocitos, células B y células T, incluidas las células asesinas naturales. Al intentar este método, la inserción del catéter es la clave para tener infecciones replicables.Se trata de un método fiable que sirve de plataforma para la identificación de dianas para el estudio y la resolución de la lesión pulmonar aguda.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video demuestra el establecimiento de una infección pulmonar en un modelo de roedor inmunocompetente a través de la intubación y la instalación de suspensiones bacterianas en los lóbulos pulmonares. Este modelo permite realizar estudios de eficacia antibacteriana en animales inmunocompetentes.

Instilación intrabronquial de Streptococcus pneumoniae en modelos de roedores inmunocompetentes

Streptococcus pneumoniae es el patógeno que lleva causando neumonía adquirida en la comunidad grave y responsable de más de 2 millones de muertes en todo el mundo. El impacto de los factores bacterianos implicados en la aptitud o la virulencia se puede controlar en tiempo real en una neumonía o bacteriemia modelo agudo ratón utilizando bacterias bioluminiscentes.

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