Preparación de muestras para el análisis rápido de lípidos en el cerebro de Drosophila utilizando imágenes de espectrometría de masas de desorción / ionización láser asistidas por matriz

Las imágenes de espectrometría Maldi MS son una herramienta establecida y útil para identificar y visualizar la abundancia y distribución de lípidos, sin una modificación excesiva de la muestra. La principal ventaja de las imágenes Maldi es su capacidad para detectar los lípidos in situ sin etiquetar, y analizar una gran población de muestras simultáneamente. La práctica hace al maestro.

Asegúrese de practicar bien antes de procesar las muestras experimentales reales. Minimice el tiempo de preparación de la muestra y evite la contaminación durante todo el procedimiento. Para comenzar, agregue la temperatura de corte óptima, u OCT en un criomold de plástico a la mitad de la profundidad del molde criogénico mientras evita la formación de burbujas.

Deje el molde sobre una superficie plana durante varios minutos y luego transfiéralo a hielo seco. Mantenga el criomold plano sobre el hielo seco y permita que la OCT forme una superficie plana y uniforme. Espere hasta que la OCT esté completamente solidificada en el molde.

Use las etapas OCT congeladas inmediatamente o guárdelas a menos 80 grados centígrados. Después de anestesiar a las moscas adultas Usando dióxido de carbono, prepare una placa de Petri que contenga un trozo de toallita de laboratorio. Use agua para humedecer parte de la toallita para reducir la electricidad estática.

Mantenga la toallita medio húmeda y la mitad seca. Después de cortar la cabeza de la mosca bajo un endoscopio de disección uno, recoja de cuatro a cinco cabezas y colóquelas en el área seca de la toallita de laboratorio. Tome la etapa OCT de hielo seco al microscopio dos.

Transfiera inmediatamente los cabezales a la etapa OCT y colóquelos rápidamente, lo que tarda entre 30 y 60 segundos en evitar que OCT se derrita. Deje alrededor de un milímetro de espacio en blanco alrededor de cada cerebro de mosca para garantizar un soporte adecuado de la OCT y de cuatro a cinco milímetros de espacio en blanco desde el borde del bloque para proporcionar un espacio adecuado para manejar la sección. Vuelva a colocar la etapa OCT en hielo seco y déjela actuar durante unos tres minutos para asegurarse de que la etapa OCT permanezca congelada y sólida.

Después de que todas las cabezas de mosca estén alineadas, deje que la etapa OCT se asiente sobre hielo seco durante otros cinco a 10 minutos. Transfiera la etapa OCT del hielo seco a una superficie plana y luego agregue rápidamente una gran cantidad de compuesto OCT para cubrir todas las muestras y llenar todo el criomolde, lo que lleva alrededor de tres segundos. Transfiera inmediatamente el criomold de nuevo al hielo seco y congele todo el bloque OCT que contiene los tejidos incrustados.

Deje que la etapa OCT repose en el hielo seco durante otros cinco a 10 minutos. Etiquete las muestras en el margen del criomold y guarde las muestras congeladas a menos 80 grados centígrados hasta que estén listas para la seccionación. Confirme el lado codificado ITO probando la conductividad de las guías ITO usando un voltímetro ajustado a resistencia.

Marque el lado con una medida de resistencia como el lado al que adherir el tejido. Etiquételo y siempre coloque una toallita de laboratorio en la parte inferior del portaobjetos para evitar la contaminación del portaobjetos. Luego, permita que los tejidos se equilibren en la cámara de criostato durante 30 a 45 minutos.

Limpie el criostato, preferiblemente con etanol al 70%. Limpie la placa antivuelco en el escenario y retire las cuchillas usadas. Use toallitas limpias adicionales para asegurarse de que el etanol se haya evaporado y que todas las superficies estén secas antes de comenzar la sección.

A continuación, ajuste la temperatura de la cabeza de la muestra de arena de la cámara de criostato de acuerdo con el tipo de tejido. Monte el tejido en el portamuestras usando OCT. Tenga cuidado de usar suficiente OCT para cubrir la base del bloque OCT y monte el bloque lo más plano posible.

Coloque una cuchilla limpia en el escenario y bloquéela. Coloque la cabeza de la muestra hacia la etapa según sea necesario para lograr el ángulo de corte deseado. Luego comience el corte en secciones gruesas hasta encontrar la región de interés.

Cepilla constantemente las piezas adicionales con un pincel de artista preenfriado para mantener el escenario limpio. Ajuste ligeramente la temperatura de la cámara según sea necesario y cambie el grosor de las secciones a 10 a 12 micrómetros una vez que se alcance la región deseada. Recoja cuidadosamente la sección deseada.

Tome un portaobjetos ITO a temperatura ambiente y colóquelo sobre la sección. Acérquese suavemente a la sección y adhiérala al portaobjetos sin dejar rastros en la etapa de criostato. Coloque el portaobjetos a un lado en una rejilla o limpie el laboratorio fuera del criostato entre las colecciones de varias secciones.

Si se desea comparar entre diferentes muestras de la misma cohorte, coloque las secciones de varias muestras en una sola diapositiva para que puedan analizarse simultáneamente para minimizar la variación. Si es necesario, sepáralos en dos diapositivas, ya que el portaobjetos Maldi puede acomodar dos diapositivas en una sola ejecución. Transporta las diapositivas en una caja de vacío a un desecado con desecado como capa inferior.

Conduzca las diapositivas bajo vacío durante 30 a 60 minutos, luego proceda a la deposición de la matriz. Use dos cinco dihidroxi ácido benzoico, o DHB, en agua de metanol como matriz. Coloque los portaobjetos en un transportador de diapositivas y selle firmemente la abertura con la película de cera.

Selle con la bolsa con cremallera. Colóquelo en otra bolsa con cremallera que contenga desecante. Etiquete el exterior y envíe la muestra a las instalaciones centrales de Maldi con los ojos secos adecuados.

Para la deposición de la matriz, use 40 miligramos por mililitro de DHB y agua de metanol como matriz y rocíela con un pulverizador automático de matriz HTX M5. Utilice una presión de gas nitrógeno de 10 PSI. Utilice un tiempo de vuelo Maldi, un instrumento MS y un modo de iones positivos para adquirir un espectro de masas.

Calibre el instrumento detectando 0,5 microlitros de emulsión de fósforo rojo en aceto Nitro en los portaobjetos ITO. Utilícelo espectros para calibrar el instrumento en el rango de masa de 100 a 1000 MZ aplicando una curva de calibración cuadrática. Establezca los diámetros de punto láser en medio, ya que es el perfil de haz modulado para un ancho ráster de 40 micrómetros, y recopile datos de imágenes sumando 500 disparos a una tasa de repetición láser de 1000 hercios por posición de matriz.

Luego registre los datos espectrales. Realice el análisis de datos de imágenes utilizando la normalización cuadrática media de raíz para generar imágenes de iones a un ancho de banda de más menos 0,10 Dalton. Alinear los espectros de la OCT y el tejido cerebral del mismo experimento utilizando el software para evaluar los picos superpuestos en la interferencia de supresión de iones de la OCT.

Finalmente, procese los portaobjetos MALDI que contienen las muestras de tejido mediante hematoxilina y eosina, o tinción H y E. Las imágenes del análisis de Maldi MS revelaron una disminución general en el contenido de lípidos en el cerebro mutante knockout LPR1. Las secciones representativas del cerebro de mosca adulta teñidas de H y E se muestran aquí.

Las especies lipídicas, sus respectivos valores MZ y las escalas del mapa de calor también se indican en esta imagen. El pliegue promedio de reducción en el mutante knockout LPR1 en comparación con los controles de al menos cuatro réplicas biológicas, se muestran como números junto a las flechas. El espectro de masas de la región OCT en blanco seleccionada en la región del tejido cerebral tanto de las moscas de control como de las moscas mutantes se muestra en el rango de MZ1 a 1000 y MZ520 a 900.

La interferencia de OCT está asociada tanto con fenómenos de supresión de iones como con problemas de señal superpuestos. Para mantener la fidelidad de los datos lipidómicos, la preparación adecuada de la muestra, la disección y la criosección son cruciales. Después de realizar el experimento Maldi, las identidades de los lípidos se pueden verificar a través de LCMS, también conocido como cromatografía líquida, espectrometría de masas basada en lipodómica.

Esta técnica obtiene información molecular sobre la homeostasis de los lípidos cerebrales mediante el uso del poderoso sistema de modelo suave que allana el camino para comprender los cambios metabólicos relacionados con las enfermedades humanas en el cerebro.