Name: Autoensamblaje de tactoides de microtúbulos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Aprende a formar tactoides de microtúbulos mediante autoensamblaje usando MAP65 y PEG como agente de aglomeración. Este protocolo reproducible permite estudiar la organización de microtúbulos y sistemas biológicos como los husos mitóticos.

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Los autores desean agradecer a todos los miembros del Ross Lab del verano de 2021, especialmente a K. Alice Lindsay, por su ayuda. Este trabajo fue apoyado por una subvención de NSF BIO-2134215 que apoyó a S. Sahu, N. Goodbee, H.B. Lee y J.L. Ross. Una subvención de la Fundación KECK (Rae Anderson, USD, PI principal) apoyó parcialmente a R. Branch y P. Chauhan

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Los métodos aquí descritos se han utilizado en varios artículos para crear tactoides de microtúbulos (Figura 2)22,28. Estos experimentos son biológicamente relevantes para ayudar a descubrir los principios organizativos que controlan la forma y la estabilidad del huso mitótico o meiótico en la mayoría de los tipos de células. Además, los microtúbulos son mesógenos de cristal líquido modelo que pueden ayudar a aprender más sobre cómo los cristales líquidos nuclean y crecen las fases nemáticas a partir de las fases isotrópicas.
El procedimiento descrito aquí tiene varias ventajas para explorar la autoorganización de microtúbulos. En primer lugar, es altamente reproducible, ya que ha sido realizado en el laboratorio por muchos estudiantes, incluidos los estudiantes de secundaria, con poco conocimiento previo o capacitación antes de comenzar en el laboratorio. Los tactoides son birrefringentes22, lo que les permite ser vistos en luz transmitida además de la microscopía de fluorescencia, haciendo que este método sea accesible a muchos laboratorios y este procedimiento experimental adaptable a fines educativos, además de la investigación de alta gama. Finalmente, este proceso abre vías para continuar entendiendo y sondeando los sistemas biológicos en un enfoque reduccionista y despojado, lo que permite comprender cómo cada condición adicional, proteína o aditivo puede alterar la autoorganización de los tactoides y, tal vez, en última instancia, el huso. Los objetivos para una mejor biomímesis incluyen la actividad, la fluidez y la clasificación de la polaridad del filamento.
Puede haber varios factores que afectan el experimento dando resultados inesperados. Por ejemplo, si los tactoides no se forman (Figura 2) pero se observan patrones similares a los de un abanico, es probable que el MAP65 no esté presente o no se una a los microtúbulos22,28. Esto también debería ser obvio en el canal de fluorescencia MAP65 porque el GFP-MAP65 no estará unido a los microtúbulos.
Si los tactoides no se forman y el fondo aparece como motas en el vidrio, esto podría deberse al recubrimiento de la superficie. Una vez realizada, la silanización dura solo 1 mes en coverslips. Cuando desaparezca, la tubulina podrá unirse a la superficie expuesta de forma no específica. Este enlace se producirá en patrones impares.
Si los tactoides no se forman y la tubulina se observa en agregados de varias formas y tamaños, esto podría deberse a la tubulina de mala calidad. La tubulina se puede centrifugar para eliminar los agregados iniciales que pueden impulsar esta agregación fuera de la vía en lugar de la polimerización de microtúbulos. Si la superficie se une a la tubulina, también puede agotar la tubulina en la solución. Las bajas concentraciones de tubulina, por debajo de la concentración crítica para polimerizar microtúbulos, pueden dar lugar a agregados.
En los experimentos FRAP, si el canal MAP65 no muestra ninguna recuperación (Figura 5), es posible que el fotoblanqueo estuviera fotodestamizando los microtúbulos. El fotodaño provoca la destrucción localizada de los filamentos. Esto se puede verificar mediante un examen en el canal transmitido. Los tactoides de microtúbulos son visibles en el canal transmitido a través de un alto índice de desajuste de refracción con el agua circundante. El fotodaño inducido por la luz aparecerá como una marca de quemadura o pérdida de contraste en las imágenes de luz transmitidas en la ubicación del ROI sometido a fotoblanqueo. Si esto ocurre, la potencia del láser o de la luz debe reducirse para inhibir el fotodaño de las proteínas.
Hubo varios desafíos encontrados en este procedimiento y enfoque. Un problema es que las medidas de longitud se realizan actualmente a mano haciendo clic en la imagen. Este método, aunque sencillo, puede resultar en una alta incertidumbre. La medición de anchura que utiliza la sección transversal y el ajuste a un gaussiano es un mejor método para cuantificar el tamaño. Se podría emplear un método similar para la longitud. Un segundo problema es que, a veces, los tactoides, debido a que son tan largos y delgados, pueden doblarse. Esto hace que la cuantificación de la longitud sea más difícil. La longitud del contorno se puede cuantificar utilizando una línea segmentada, pero hay incertidumbre adicional cada vez que se agrega un segmento.
Desde una perspectiva científica, este enfoque tiene algunos otros desafíos para su uso como modelo para cristales líquidos o husos. El primer desafío ha sido la forma larga y delgada de los tactoides que crean los microtúbulos (Figura 3 y Figura 4). Como se señaló en publicaciones anteriores22, los tactoides de microtúbulos son tactoides homogéneos, no bipolares. Esto significa que los microtúbulos que componen la forma no se reorientan para apuntar hacia las puntas de la estructura. En cambio, todos los microtúbulos son paralelos al eje largo y los "polos" se encuentran en el infinito. Esto es muy diferente de los tactoides observados para cristales líquidos moleculares o incluso para actina o ADN que también pueden actuar como mesógenos de cristal líquido. En estos otros sistemas, los tactoides son bipolares y, cuando se ven en polarizadores cruzados, muestran los signos reveladores de reorientación de las varillas.
Un segundo gran desafío en este sistema es que los microtúbulos están inmóviles dentro del tactoide. Esto queda claro a partir de los experimentos y análisis de FRAP, ya que la recuperación de los microtúbulos es muy baja. Su naturaleza sólida hace que los tactoides de microtúbulos sean menos valiosos que los análogos de cristal líquido a gran escala. La fase nemática de un cristal líquido debe tener propiedades líquidas (fluidas) y cristalinas (organizadas). Aunque la forma parece adecuada para el huso, la inmovilidad hace que el sistema sea menos emocionante como un huso mitótico modelo. Por otro lado, este número brinda oportunidades para investigar cómo se pueden modificar los experimentos para crear más fluidez en el sistema.
Estos desafíos científicos ofrecen oportunidades emocionantes que permitirán nuevos conocimientos sobre el sistema. Para hacer que los tactoides de microtúbulos sean más bipolares, se podrían usar microtúbulos más cortos. Sin embargo, hay un desafío adicional, ya que los microtúbulos no tienen muchas proteínas de recubrimiento bien caracterizadas para controlar la longitud como lo hace la actina. El uso de nucleación y crecimiento requiere el uso de concentraciones muy altas de tubulina y GMPCPP para hacer microtúbulos cortos. La alta concentración de tubulina da como resultado un mayor número de filamentos en el sistema, lo que hace que sea más difícil separar los tactoides entre sí. La adición de nuevas tapadoras de microtúbulos, como DARPin33, puede ayudar con esta situación. El segundo problema de que los microtúbulos estén inmóviles podría mitigarse mediante la adición de proteínas motoras, como la quinesina-534, que son tetrámeros de motores utilizados en la mitosis. Alternativamente, se podrían usar dímeros artificiales de kinesina-1 dimérica15.
Otra forma de agregar más fluidez sería permitir que los microtúbulos realicen su inestabilidad dinámica, el crecimiento y la contracción de los microtúbulos. Actualmente, los microtúbulos que se siembran con filamentos GMPCPP estables y luego sufren inestabilidad dinámica son mucho más largos de lo deseado para formar un huso o tactoide, lo que daría como resultado organizaciones muy largas como ventiladores o paquetes. Por lo tanto, la adición de inestabilidad dinámica de microtúbulos tendría que hacerse con cuidado para preservar la forma tactoide. La adición de proteínas y enzimas asociadas que pueden controlar la longitud puede mitigar este problema. Por ejemplo, probablemente se necesitarían quinesinas despolimerizantes, como la kinesina-1335, o enzimas cortadoras, como la katanina36. Estos experimentos son complejos y difíciles, aunque serían muy perspicaces sin importar lo que revelen los resultados. Cualquiera que sea la dirección que tomen los experimentos futuros, la plataforma desarrollada aquí para crear tactoides de microtúbulos puede exponer nueva información sobre la base física de la organización de microtúbulos.

La división celular a través de la mitosis es uno de los procesos biológicos más importantes para mantener la vida. Los filamentos de microtúbulos, compuestos por dímeros de tubulina, son elementos estructurales esenciales de este proceso. La maquinaria transitoria creada en metafase cuando los cromosomas se alinean en el centro celular se llama huso mitótico debido a su forma, que es como un huso de un telar cubierto de hilos (Figura 1A). Está bien establecido en muchos organismos que los microtúbulos se utilizan en la metafase para empujar y tirar de los cromosomas condensados en el centro de la célula, alineándolos y conectándolos a microtúbulos que los separarán en anafase (Figura 1B, C). El huso se forma tanto en la meiosis (Figura 1B) como en la mitosis (Figura 1C), creada a partir de muchos microtúbulos superpuestos que no están envueltos alrededor del eje central como hilo, sino que corren paralelos a la interfaz. La creación de estas estructuras basadas en microtúbulos requiere proteínas asociadas que se entrecruzan y enzimas asociadas que pueden actuar como motores para ayudar a empujar y tirar de los cromosomas1.
Los estudios de husos meióticos han demostrado que los microtúbulos son cortos, dinámicos y se superponen en matrices reticuladas 2,3,4,5,6 (Figura 1Di). Debido a la organización física de estos microtúbulos cortos, el huso meiótico es similar a un tactoide de cristal líquido (Figura 1E). De hecho, se ha demostrado que los husos se fusionan y se fusionan, como cabría esperar de los tactoides de cristal líquido5.
Muchos estudios que datan de la década de 1960 han utilizado la fijación, las secciones en serie y la microscopía electrónica para determinar que hay dos tipos de microtúbulos dentro del huso mitótico 7,8,9,10. El primer tipo se llama microtúbulos cinetocoros, que conectan el polo del huso con el cinetocoro. El segundo tipo se denomina microtúbulos interpolares o polares, que crecen más allá de los cromosomas y se superponen en la zona media (Figura 1Dii)8,9,10. Un tercer tipo se llama microtúbulos astrales, que están fuera del huso y conectan los polos con el borde celular; estas organizaciones de microtúbulos están fuera del alcance de la discusión actual. Ha habido estudios recientes sobre la interacción entre augmin6 y el complejo de anillos gamma-tubulina que influyen en los centros de nucleación de los microtúbulos, lo que resulta en un huso mitótico con microtúbulos más cortos como en la Figura 1D.
Dado que los microtúbulos son más largos que anchos, con una alta relación de aspecto y una alta rigidez, son como versiones ampliadas de moléculas de cristal líquido. En física de la materia blanda, los átomos y las moléculas se han aproximado utilizando interacciones mínimas para deducir los mecanismos físicos de las transiciones de fase, incluida la nucleación y la fusión de cristales11. Del mismo modo, los microtúbulos son objetos a mesoescala que son versiones ampliadas de moléculas de cristal líquido, lo que proporciona información sobre la física de la dinámica de los cristales líquidos, incluida la nucleación y el crecimiento de las fases nemáticas a partir de las isotrópicas. Además, como se discutió anteriormente, el huso meiótico muestra propiedades como las de un tactoide de cristal líquido, un estado nemático que nuclea y crece a partir del estado isotrópico de las moléculas de cristal líquido 3,4,5. Para los tactoides, la nucleación y el crecimiento son como los de otros cristales (es decir, requieren una concentración relativamente alta de mesógenos [las moléculas que forman los cristales líquidos]). La forma única de "huso" del tactoide proviene de la alineación local de los mesógenos de cristal líquido que se alinean en la fase nemática (Figura 1E). No pueden formar un cristal redondeado porque las moléculas son altamente asimétricas. Dada la naturaleza de los microtúbulos, tal vez no sea sorprendente que la maquinaria del huso mitótico hecha de una alta concentración local de microtúbulos también tenga la misma forma, ya sea que se llame tactoide o huso. Los tactoides pueden ser bipolares, con polos en los extremos cónicos (Figura 1Ei), u homogéneos, con polos efectivamente en el infinito (Figura 1Eii).
Dada la importancia de la formación del huso, se han realizado esfuerzos hacia la formación de husos autoorganizados in vitro mediante la demostración de condensación de microtúbulos en haces a través de especies iónicas 12,13, agentes de apiñamiento que crean interacciones de agotamiento14,15 y proteínas de reticulación de microtúbulos específicos 13,16,17,18,19, 21. Sorprendentemente, aunque todos estos agentes trabajan para aumentar la concentración local de microtúbulos, a menudo resultan en largos haces de microtúbulos pero no tactoides. Una razón por la que estos haces son largos podría ser que los microtúbulos que los componen también son largos. Trabajos recientes con microtúbulos más cortos también reportaron haces más largos que no están cónicos al final15; en este caso, los haces se mantienen unidos con proteínas motoras que causan la extensión de los haces y, por lo tanto, los hacen más largos. Se necesitan microtúbulos cortos con reticulantes no extensiles para ensamblajes cónicos en forma de husillo, como se describe aquí.
Recientemente, hemos desarrollado una técnica para permitir la creación de tactoides de microtúbulos utilizando el reticulador antiparalelo, MAP65, en presencia de microtúbulos estables nucleantes22. Los microtúbulos debían ser cortos, sin embargo, pocos reguladores conocidos de la longitud de los microtúbulos pueden tapar los microtúbulos contra la inestabilidad dinámica o el recocido de extremo a extremo. En cambio, GMPCPP se utilizó para nuclear y estabilizar los filamentos después del crecimiento. Esto permitió crear una alta densidad de microtúbulos cortos que podrían autoorganizarse en tactoides. Estos tactoides eran homogéneos cuando se veían bajo birrefringencia. Además de los microtúbulos cortos, se empleó un reticulador antiparalelo específico, MAP65, para formar los tactoides (Figura 2). MAP65 es una proteína asociada a microtúbulos vegetales de la familia PRC1/Ase1 de reticulantes mitóticos23. MAP65 existe como un dímero, con una fuerte afinidad para unirse a sí mismo, así como a los microtúbulos24. A diferencia del huso meiótico y los tactoides observados con los filamentosde actina 25,26,27, que son bipolares y tienen las propiedades líquidas de los cristales líquidos, se ha observado que los tactoides de microtúbulos son sólidossimilares a 22,28.
Aquí, se presentan protocolos para crear los tactoides de microtúbulos y caracterizar la forma de los ensamblajes y la movilidad de los constituyentes utilizando técnicas basadas en fluorescencia.

<table><tbody><tr><td>2% Diclorodimetisilano</td><td>GE Healthcare 118945</td><td></td><td>Un tratamiento superficial de silano hidrofóbico. Se puede reutilizar hasta tres veces y mantener a temperatura ambiente durante un año.</td></tr><tr><td>Epoxi de 5 minutos</td><td>Bob Smith Industries</td><td></td><td>Para el sellado de cámaras experimentales</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher</td><td>32900HPLC</td><td>100%</td></tr><tr><td>BL21 células</td><td>Bio Labs</td><td>C2527I</td><td>Células bacterianas competentes utilizadas para expresar MAP65</td></tr><tr><td>Catalasa</td><td>Sigma</td><td>C30-500MG</td><td>Parte del sistema de eliminación de oxígeno. Un caldo de 300 mg/ml se fabrica en ddH2O y se almacena en 10 &mu; l alícuotas en -20&deg; C hasta por un año.</td></tr><tr><td>Cubreobjetos (22 mm x 22 mm o 22 mm x 30 mm)</td><td>Fisher</td><td>12544-AP</td><td>Para cámaras experimentales</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815-5G</td><td>Una pequeña molécula que se utiliza para romper enlaces de disulfuro y eliminar el oxígeno. Una culata de 1 M está hecha de polvo (Sigma) en ddH2O. La solución se alícuota y se almacena a -20 °C durante un máximo de un año. Las alícuotas se utilizan 7-8 veces y luego se descartan.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889-10G</td><td>Ingrediente base tampón Tubulin</td></tr><tr><td>Eppendorf Tubos de 0,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>05 402 18</td><td>Para la sujeción de soluciones experimentales</td></tr><tr><td></td><td>Etanol</td><td>Fisher 111000200</td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Whatman</td><td>1004-110</td><td>Para la limpieza y para la extracción de soluciones a través de cámaras experimentales</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia con alta NA objetivos</td><td>Nikon</td><td>Ti-E, W2 Confocal</td><td>Para experimentos de imagen</td></tr><tr><td>Congelador -20&deg; C</td><td>Fisherbrand</td><td>13986148</td><td>Para almacenar reactivos</td></tr><tr><td>Congelador -80&deg; C</td><td>Thermo scientific</td><td>328223H01-C</td><td>Para el almacenamiento de proteínas.</td></tr><tr><td>Recipientes de vidrio para silanización</td><td>Michaels</td><td>Para la preparación de cámaras experimentales - tratamiento de cubreobjetos</td>Portaobjetos de vidrio Fisher 12544-4 Para cámaras experimentales Glucosa Sigma G7528-250G Parte del sistema de eliminación de oxígeno.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Un caldo de 300 mg/ml se fabrica en ddH2O y se almacena en 10 &mu; l alícuotas en -20&deg;C.</td></tr><tr><td>Glucosa oxidasa</td><td>Sigma</td><td>G2133-250KU</td><td>Parte del sistema de captación de oxígeno. Esto se almacena a 4&deg; C hasta por un año.</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jenna Bioscience</td><td>NU-4055</td><td>Análogo hidrolizable lentamente de GTP utilizado para polimerizar y estabilizar los microtúbulos mediante la reducción de la inestabilidad dinámica y la concentración crítica espontánea para que la nucleación de los microtúbulos obtenga una longitud consistente. Compramos un stock de 10 mM de Jena Biosciences y lo almacenamos a -20 grados; C hasta por un año.</td></tr><tr><td>Elemento calefactor para microscopio</td> Incubadora <td></td><td>de etapa Okolab</td><td>Para experimentos de imagen</td></tr><tr><td>Imidizol</td><td>Sigma</td><td>I2399</td><td>Se utiliza para eluir la proteína MAP65 de perlas de níquel para purificar MAP65</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher</td><td>34155</td><td>Para la limpieza y para extraer soluciones a través de cámaras experimentales.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P250-500</td><td>1 M en ddH2O, elaborado en fresco para evitar la acidificación con el tiempo.</td></tr><tr><td>Nitrógeno Líquido</td><td></td><td>Airgas NI 230LT22</td><td>Para bajar las alícuotas de congelación. Esto también se puede utilizar para el almacenamiento (no recomendado)</td></tr><tr><td>Proteína MAP65</td><td>Ram Dixit</td><td></td><td>Una proteína asociada a microtúbulos (MAP) con un peso molecular de 65 kD que es un reticulante de microtúbulos antiparalelos. Hemos purificado una versión no etiquetada y marcada con GFP de MAP65-1 de Arabidopsis thaliana. Mezclamos el GFP-MAP65 con el MAP65 sin etiquetar de modo que el 10% de la proteína esté marcada. El material de trabajo es de 10,8 &mu; M solución. Esta solución de trabajo se almacena a 4&deg; C y rehecho fresco cada semana. El protocolo para purificar el MAP65 y el GFP-MAP65 se da en nuestro capítulo anterior de métodos (26).</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma MKCJ940</td><td></td><td>Ingrediente tampón de tubulina</td></tr><tr><td>NTA-Perlas de níquel</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>Perlas necesarias para purificar 6xHis proteínas MAP65 marcadas con His:</td></tr><tr><td>Sistema láser Optomicroscan</td><td>Nikon</td><td></td><td>405 nm que puede enfocar el láser en cualquier forma deseada de la región de interés</td></tr><tr><td>PEM80</td><td></td><td></td><td>Tampón base polimerizante de tubulina neutra para solución hecha de 80 mM K-PIPES, pH 6,8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, almacenado a 4&deg; C hasta por un año.</td></tr><tr><td>Cinta adhesiva permanente de doble cara</td><td>3M - Scotch</td><td>34-8724-5691-7</td><td>Para cámara experimental Placa</td></tr> de <tr><td>Petri</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>Para cámara húmeda</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P7643-100G</td><td>Ingrediente base tampón Tubulina</td></tr><tr><td>Pluronic-F127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250G</td><td>Un copolímero de bloque con dos bloques de óxido de polietileno hidrofílico (PEO) en los extremos y un bloque central hidrofóbico de recubrimiento de superficie hidrofóbico de óxido de polifenileno (PPO) que utilizamos para evitar la unión de proteínas a la superficie. Pluronic-F127 se compra en forma de polvo (Sigma) y se disuelve en una solución al 5% (p/v) en ddH2O durante la noche. Una vez disuelta, la solución puede almacenarse a temperatura ambiente hasta un año.</td></tr><tr><td>Polietilenglicol</td><td>Affymetrix Inc</td><td>19966 500 GM</td><td>Un agente de aglomeración utilizado para crear fuerzas de agotamiento para llevar los tactoides a la superficie y ayudar a organizar los microtúbulos. Creamos una solución al 5% (p/v) de 100 kDa PEG en PEM80. La solución se almacena en 4&deg; C durante un máximo de un año y se coloca en el balancín antes de su uso. Es viscoso, por lo que recomendamos utilizar una pipeta de desplazamiento positivo para trabajar con él.</td></tr><tr><td>Pipeta de desplazamiento positivo</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Para el pipeteo de líquidos viscosos</td></tr><tr><td>Gradillas para cubreobjetos</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>72240</td><td>Para la preparación de cámaras experimentales - tratamiento de cubreobjetos</td></tr><tr><td>Refrigerador 4&deg; C</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td>Para el almacenamiento de reactivos</td></tr><tr><td>Citoesqueleto marcado con tubulina</td><td></td><td>TL590M</td> La <td>tubulina liofilizada marcada con rodamina del cerebro de cerdo se compra (citoesqueleto) y se almacena en -80 grados; C hasta que se hidrate en PEM80 y se use hasta por un año.</td></tr><tr><td>Proteína de tubulina</td><td>Citoesqueleto</td><td>T240</td><td>tubulina liofilizada 99% pura sin etiquetar de cerebro de cerdo se compra (citoesqueleto) y se almacena en -80 grados; C hasta que se hidrate en PEM80 y se use hasta por un año.</td></tr><tr><td>Luz de oro UV</td><td></td><td>Modelo 342</td><td>Para la preparación de cámaras experimentales - tratamiento de cubreobjetos</td></tr><tr><td>Stackreg</td><td>Biomedical Imaging Group</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td> <td>plugin para registrar datos de series temporales para eliminar la deriva</td></tr><tr><td>Turboreg</td><td>Biomedical Imaging Group</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td> <td>plugin para registrar datos de series temporales para eliminar la deriva</td></tr></tbody></table>

autoensamblaje de tactoides de microtúbulos

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

El citoesqueleto es responsable de la principal organización interna y reorganización dentro de la célula, todo sin un gerente que dirija los cambios. Este es especialmente el caso durante la mitosis o meiosis, donde los microtúbulos forman el huso durante la división celular. El huso es la maquinaria utilizada para segregar el material genético durante la división celular. Hacia la creación de husos autoorganizados in vitro, recientemente desarrollamos una técnica para reconstituir microtúbulos en ensamblajes similares a husos con un conjunto mínimo de proteínas asociadas a microtúbulos y agentes de apiñamiento. Específicamente, se utilizó MAP65, que es un reticulador de microtúbulos antiparalelos de plantas, un homólogo de Ase1 de levadura y PRC1 de organismos de mamíferos. Este reticulante autoorganiza los microtúbulos en ensamblajes autoorganizados de microtúbulos largos, delgados y similares a husos. Estos ensamblajes también son similares a los tactoides de cristal líquido, y los microtúbulos podrían usarse como mesógenos de mesoescala. Aquí, se presentan protocolos para crear estos tactoides de microtúbulos, así como para caracterizar la forma de los ensamblajes utilizando microscopía de fluorescencia y la movilidad de los constituyentes utilizando la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo.

Con solo un pequeño número de componentes, dímeros de tubulina y reticulantes de microtúbulos, se pueden formar tactoides de microtúbulos (Figura 2A). Aunque este protocolo describe la incubación para nuclear y cultivar microtúbulos en una incubadora, la nucleación y el crecimiento se pueden observar directamente bajo el microscopio (que se completan en 30 min) (Figura 2B). La concentración de tubulina se mantiene constante a 13,6 μm y la unión MAP65-MT al 10%.
La figura 4 representa los datos correctos. Los tactoides deben ser visibles tanto con un láser de 561 nm en el canal de tubulina como con 488 nm en el canal MAP65, que se superponen perfectamente entre sí (Figura 4A). Un misterio del sistema ha sido que el ancho de los tactoides no parece variar bajo una variedad de cambios experimentales, incluido el cambio de las longitudes de los microtúbulos, la concentración de MAP65 y los agentes de apiñamiento (Figura 4B)22,28. La longitud es mucho más variable y depende tanto de las longitudes de los microtúbulos como de la concentración de MAP65 (Figura 4B)22,28.
Al realizar FRAP, se ha observado que la señal MAP65 se recupera, pero la señal de microtúbulos no se recupera (Figura 5). La recuperación en FRAP se debe a la movilidad y movimiento de los objetos etiquetados y fotoblanqueados. En el caso del MAP65, las moléculas oscurecidas se disocian y se alejan del microtúbulo y otras nuevas se mueven hacia la región (Figura 5). La unión MAP65 está en equilibrio, por lo que la tasa de unión y desunión es igual (medida en moléculas por segundo). Para los microtúbulos, no se observó recuperación, lo que implica que los microtúbulos no son capaces de abandonar el tactoide (Figura 5A, Bi, C). Además, no se observó la propagación de la región oscurecida, lo que sugiere que los microtúbulos están localmente inmóviles y no son un fluido dentro de la forma tactoide.
<img alt="Alineación cromosómica metafásica; estructura del huso y organización de los microtúbulos; diagrama de microscopía." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Diferentes modelos de formación de husos. Un huso mitótico es una máquina hecha de microtúbulos y sus proteínas y enzimas asociadas que alinea y separa los cromosomas en las dos nuevas células hijas durante la división celular. (A) Imagen de una réplica de husillo de caída de principios de la Edad Media con hilo fino de los Países Bajos. Esta figura ha sido modificada a partir de una imagen de Wikimedia por Peter van der Sluijs30. (B) Reconstrucción tridimensional de microtúbulos en diferentes etapas de la meiosis II de tipo silvestre. Los microtúbulos se muestran en verde y los cromosomas se muestran en gris. Barra de escala = 1 μm. Esta cifra ha sido modificada a partir de Lantzsch et al.31. (C) Imagen microscopía de los microtúbulos en un huso mitótico de una célula Sf9 en división. Los polos del huso y los microtúbulos del huso están marcados con una proteína verde fluorescente. Barra de escala = 5 μm. Esta cifra ha sido modificada a partir de Advani et al.32. (D) Diferentes modelos de cómo se organizan los microtúbulos del huso mitótico y meiótico. (i) Previamente observados para los husos meióticos creados a partir de extractos de huevos de Xenopus, se dedujo que los microtúbulos (verdes) eran cortos y dinámicos en todo el huso. Esto es similar a una organización tactoide bipolar dentro de un cristal líquido. (ii) El modelo canónico para la organización de microtúbulos dentro de un huso mitótico tiene dos tipos de microtúbulos: microtúbulos interpolares o polares (verde oscuro) que se entrecruzan en la zona media alrededor de los cromosomas y microtúbulos cinetocoros (verde claro) que se agrupan y estiran desde el polo hasta el cinetocoro para empujar y tirar de los cromosomas. En todas las imágenes, los cromosomas se muestran en azul transparente y los polos del huso se representan en verde oscuro. (E) Esquemas de mesógenos (líneas verdes) en un tactoide de cristal líquido para (i) tactoides bipolares y (ii) homogéneos. Los tactoides bipolares tienen dos polos al final del tactoide, y los mesógenos se reorientan para apuntar a esos polos. Los tactoides homogéneos tienen polos en el infinito, y los mesógenos no cambian de orientación a lo largo de la longitud del tactoide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Método de formación de tactoides, esquemático y series temporales; microtúbulos, reticulación MAP65, microscopía." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Condensación de microtúbulos. (A) Los microtúbulos pueden agruparse y reticularse mediante una variedad de métodos, incluidas especies iónicas, fuerzas de agotamiento causadas por agentes de apiñamiento y reticulantes de microtúbulos específicos, como MAP65. (i) Los dímeros de tubulina y las proteínas MAP65 se mezclan para nuclear y cultivar microtúbulos. (ii) Los microtúbulos se nuclean y crecen a partir de la tubulina, y MAP65 se une inmediatamente a los microtúbulos, otro monómero MAP65, o ambos y causa la agrupación. iii) Los microtúbulos de los haces reticulados nuclean y crecen. (iv) La configuración final es un tactoide de microtúbulos similar a un huso. (B) Series temporales de tactoides de microtúbulos que se nuclean y crecen durante 105 min. Barra de escala = 5 μm. Figura adaptada de Edozie et al.22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Diagrama de la cámara de flujo con cubreobjetos silanizado, para el análisis de la dirección del flujo de la muestra en microscopía." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Montaje de la cámara de flujo. La cámara de flujo está hecha con un portaobjetos de vidrio, vidrio de cubierta silanizada y cinta permanente de doble cara. La región resaltada en amarillo es la trayectoria de flujo donde se fluye y se observa la muestra. El volumen de la cámara de flujo es de ~ 20 μL. El epoxi se utilizó para sellar los extremos de la cámara para evitar que la muestra se evapore durante las imágenes a largo plazo durante varias horas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Análisis tactoide: microtúbulos y canales MAP65, imágenes fusionadas, cuantificación longitud-anchura, gráfico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Imágenes tactoides y análisis de longitud y anchura. (A) Datos de ejemplo de tactoides formados como se describe y fotografiados utilizando confocales de disco giratorio que muestran (i) imágenes de canales de microtúbulos de tubulina marcadas con rodamina utilizando un láser de 561 nm, (ii) imágenes de canales GFP-MAP65 de GFP utilizando un láser de 488 nm, y (iii) imagen superpuesta combinada del canal de microtúbulos (magenta) y canal GFP-MAP65 (cian). Las regiones superpuestas se muestran como blancas y demuestran que los microtúbulos y MAP65 se colocalizan exactamente. Barra de escala = 10 μm para todas las imágenes en (A). (B) Cuantificación de la longitud y anchura del tacto. (i) Imagen de un tactoide para ser analizado sin etiquetas. Barra de escala = 5 μm. (ii) Misma imagen que en (i), donde se denotan las medidas de longitud (línea sólida con tapas de línea) y anchura (línea discontinua). Barra de escala = 5 μm. (iii) El ancho se midió tomando el perfil de intensidad a través del tactoide en el bisector perpendicular (línea discontinua) denotado en (ii). El perfil de intensidad se ajustó a una función gaussiana para revelar la amplitud y el ancho del tactoide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Análisis FRAP: microtúbulos, series temporales MAP65, gráficos de intensidad. Dinámica de recuperación de fluorescencia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: Datos y análisis representativos de FRAP. (A) Datos de series temporales de microscopía de (i) tactoide de microtúbulos y (ii) GFP-MAP65, y (iii) imagen superpuesta de ambos canales con microtúbulos en magenta y GFP-MAP65 en cian que fueron fotoblanqueados en el tiempo 63 s y observados durante 5 min. (B) Intensidad cuantificada de la (i) ) canal de microtúbulos en la región blanqueada (círculos magenta) y el fondo (círculos gris oscuros) y (ii) canal GFP-MAP65 en la región blanqueada (cuadrados cian) y el fondo (cuadrados gris oscuro). (C) Los datos se corrigieron para el ruido de fondo y se reescalaron para el canal de microtúbulos (círculos magenta) y el canal GFP-MAP65 (cuadrados cian). Los microtúbulos no se recuperan, pero el GFP-MAP65 sí lo hace y puede ajustarse (línea gris oscura) a una desintegración exponencial creciente para encontrar la amplitud y la escala de tiempo de recuperación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este artículo presenta un protocolo para la formación de conjuntos de microtúbulos en forma de tactoides utilizando MAP65, un reticulante de microtúbulos a base de plantas, y PEG como agente de apiñamiento.

Autoensamblaje de tactoides de microtúbulos

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Este protocolo permite la autoorganización espontánea de tactoides de microtúbulos utilizando un enlace cruzado antiparalelo, MAP65. Este sistema puede ayudarnos a comprender la organización de los microtúbulos y los sistemas biológicos como los husos mitóticos. La principal ventaja de esta técnica es que es un sistema minimalista que puede recrear formas similares a husos para microtúbulos que es altamente reproducible y accesible para muchos laboratorios.Este método no solo es aplicable a los sistemas celulares, sino que también puede servir como modelo para estudios de cristal líquido a mesoescala. Para preparar tubulina, primero saque una alícuota de tubulina sin etiquetar que contenga un miligramo de tubulina liofilizada del congelador de menos 80 grados centígrados y manténgala en hielo. Luego, agregue 200 microlitros de PEM-80 frío.Para disolver todo el liofilato, mantenga el tubo en hielo durante 10 minutos. A continuación, saque un tubo de tubulina marcada con rodamina que contenga 20 microgramos de polvo de tubulina liofilizada del congelador de menos 80 grados centígrados y manténgalo en hielo. Luego, agregue cuatro microlitros de PEM-80 frío y mantenga el tubo en hielo durante 10 minutos para disolver todo el liofilato.Una vez que las tubulinas liofilizadas se hayan disuelto, agregue 100 microlitros de la solución de tubulina sin etiquetar resuspendida a la solución de tubulina marcada con rodamina de cuatro microlitros. Luego, mezcle las soluciones canalizando de seis a siete veces muy lentamente. Para almacenar los 100 microlitros restantes de solución de tubulina sin etiquetar, primero, inserte el tubo en nitrógeno líquido para congelar la solución, luego mantenga el tubo a menos 80 grados Celsius para su uso futuro.A continuación, distribuya la mezcla de tubulina en siete tubos nuevos agregando 15 microlitros en cada uno. Congele los tubos en nitrógeno líquido como se demostró anteriormente y guárdelos a menos 80 grados centígrados para su uso futuro. Para ensamblar cámaras de flujo para realizar experimentos, primero, limpie un portaobjetos de vidrio con agua de doble destilación y séquelo con una toallita de laboratorio sin pelusa.A continuación, limpie el portaobjetos primero con etanol seguido de agua de doble destilación. Para crear una ruta de flujo, corte una pieza de cinta de doble cara de 40 a 50 milímetros de largo. Luego, divídalo en el medio para crear dos tiras de cinta más delgadas y coloque las dos tiras en la diapositiva de cinco a ocho milímetros de distancia.A continuación, coloque los resbalones de cubierta silanizados en la parte superior de la trayectoria del flujo. Luego, selle la diapositiva y cubra las tiras de cinta de doble cara presionando suavemente la región de la cinta con la parte posterior de un bolígrafo. Si el sello está bien hecho, la cinta debe pasar de translúcida a transparente.Para quitar la cinta adicional en los bordes, corte la cinta con una cuchilla de afeitar, dejando solo un milímetro de la entrada de la cámara de flujo. Luego, etiquete la cámara con los parámetros experimentales apropiados Para realizar los experimentos tactoides, primero, descongele todos los reactivos necesarios en el hielo y guárdelos en el hielo durante el trabajo. A continuación, cubra la cámara de flujo con 20 microlitros de surfactante de copolímero de bloque no iónico al 5% disuelto en PEM-80 con pequeñas gotas en ambos extremos de la cámara para evitar la formación de burbujas de aire en el interior.Luego, mantenga la cámara de flujo en una cámara húmeda hecha de placa de Petri con una toallita de laboratorio húmeda y sin pelusa durante al menos cinco a siete minutos. A continuación, mezcle PEM-80, GMPPCPP, Pluronic F-127, ditiotreitol, glucosa, polietilenglicol, la mezcla de tubulina hecha anteriormente, y MAP65 con GFP MAP65 para su visualización en un tubo estéril mediante pipeteo de cinco a seis veces, manteniendo el tubo en hielo. Luego, agregue un microlitro de una solución premezclada de glucosa oxidasa y catalasa en el tubo de la mezcla de tubulina-MAP y mezcle nuevamente por tubería de siete a ocho veces.Divida el volumen total de la solución en dos porciones para utilizarlas en cámaras separadas. Mientras tanto, el líquido agregado antes a la cámara de flujo debe eliminarse por acción capilar mediante el uso de una toallita de laboratorio sin pelusa en el otro extremo de la cámara, junto con la adición de la mezcla tubulina-MAP a la cámara de flujo. Una vez que la muestra esté completamente dentro de la cámara, selle los dos extremos de la cámara con epoxi de cinco minutos y manténgala a 37 grados centígrados durante unos 30 minutos para nuclear y hacer crecer los tactoides de microtúbulos.Para obtener imágenes de los tactoides mediante microscopía de fluorescencia, use objetivos con una apertura numérica de 1.2 o más en un aumento de 60X o superior para recolectar suficiente luz en fluorescencia. Grabe las imágenes con un semiconductor de óxido metálico de cortesía o una cámara de dispositivo de carga acoplada. Para mantener la muestra, manténgala en una cámara ambiental a 37 grados centígrados.Alternativamente, se pueden emplear otros calentadores de etapa, incluidos los calentadores de etapa de aire caliente y los collares objetivos de temperatura controlada con agua tibia circulante, para este propósito. Como las fuentes de excitación apropiadas son esenciales para la correcta fluorescencia de la rodamina tubulina, use un láser de 561 nanómetros con al menos un milivatio de potencia en la muestra para obtener imágenes de buena calidad. Sin embargo, para GFP MAP65, cambie la fuente de excitación a un láser de 488 nanómetros.Si usa microscopía de epifluorescencia de campo amplio, use un cubo de filtro de rodamina con una excitación de 540 12.5 nanómetros, dicroico de 545 nanómetros de corte de 12.5 nanómetros y emisión de 575 nanómetros de paso largo. Para GFP MAP, use un cubo de filtro GFP con excitación de 480 15 nanómetros, dicroico de 505 nanómetros 15 nanómetros cortado y emisión de 515 nanómetros de paso largo. Después de asegurarse de que la potencia de iluminación y los tiempos de exposición sean tales que la escala de intensidad de la cámara no esté saturada, tome al menos 10 imágenes de diferentes áreas para obtener imágenes de más de 100 tactoides en los canales rojo y verde, y guárdelas como imágenes TIFF de 16 bits para su análisis.Usando este protocolo, los tactoides de microtúbulos cuya formación se completa en 30 minutos se pueden visualizar directamente bajo el microscopio. Los tactoides son visibles con un láser de 561 nanómetros en el canal de tubulina y un láser de 488 nanómetros en el canal MAP65. Las imágenes también se superponen perfectamente entre sí.En este método, también se podría medir la longitud y el ancho de los tactoides. Se encontró que el perfil de intensidad de un tactoide varía con su ancho. Además, la naturaleza inmóvil de los tactoides de microtúbulos se demostró mediante la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo o experimentos FRAP, que no mostraron ninguna recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo.Por otro lado, los experimentos FRAP revelaron una naturaleza móvil de MAP65, para la cual se pudo observar una recuperación gradual y fluorescencia después del fotoblanqueo. Esta recuperación de fluorescencia por MAP65 puede ajustarse a una desintegración exponencial creciente para encontrar la amplitud y la escala de tiempo de recuperación. La parte del experimento tactoide debe completarse dentro de 10 a 12 minutos, ya que la tubulina puede estropearse en el hielo rápidamente, lo que puede ser perjudicial para la nucleación de los tactoides.El trabajo futuro con diferentes proteínas de reticulación de microtúbulos y proteínas motoras de reticulación, enzimas que pueden mover microtúbulos, continuará exponiendo nueva información sobre la autoorganización del huso mitótico.

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este video describe TIRF, una técnica basada en microscopía de reflexión interna total para visualizar la dinámica de polimerización de actina y microtúbulos. El método permite obtener imágenes de alta resolución de la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos en tiempo real, lo cual es esencial para comprender las diafonías celulares.

Microscopía TIRF para visualizar la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos

Los microtúbulos son polímeros inherentemente inestables, y su conmutación entre el crecimiento y acortamiento es estocástico y difícil de controlar. Aquí se describen los protocolos que utilizan microtúbulos segmentados con tapones estabilizadores fotoescindible. La despolimerización de los microtúbulos segmentados puede ser activado con una alta resolución temporal y espacial, ayudando de este modo el análisis de los movimientos con los extremos de los microtúbulos desmontaje.

Preparación de segmentados microtúbulos para estudiar las mociones impulsadas por las que desmontan microtúbulos Ends

Aquí, se presenta un ensayo de reconstitución in vitro basado en microscopía TIRF para cuantificar y comparar simultáneamente la dinámica de dos poblaciones de microtúbulos. Se describe un método para ver simultáneamente la actividad colectiva de múltiples proteínas asociadas a microtúbulos en haces de microtúbulos reticulados y microtúbulos individuales.

Visualización simultánea de la dinámica de microtúbulos reticulados y únicos in vitro mediante microscopía TIRF

Aquí, presentamos un protocolo para reconstituir haces de microtúbulos in vitro y cuantificar directamente las fuerzas ejercidas dentro de ellos utilizando trampeo óptico simultáneo y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Este ensayo permite la medición a nivel nanométrico de las fuerzas y desplazamientos generados por los conjuntos de proteínas dentro de las redes de microtúbulos activos.

Medición directa de las fuerzas dentro de haces de microtúbulos activos reconstituidos

Este protocolo es una guía para visualizar actina dinámica y microtúbulos utilizando un ensayo de microscopía de fluorescencia interna total (TIRF) in vitro .

Visualización de la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos in vitro mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

Aquí se presentan métodos para preparar nemática activa a partir de microtúbulos y motores de quinesina, incluida la preparación y construcción de proteínas y el uso de pozos para el confinamiento nemático activo.

Formación, confinamiento y observación de nemática activa basada en microtúbulos

Este manuscrito describe protocolos estándar para la medición de la hiperfosforilación de tau, medición de enlace de tau a los microtúbulos y la localización de tau intracelular después de tratamientos con fármacos. Estos protocolos pueden utilizarse repetidamente para la detección de drogas u otros compuestos que enlace la hiperfosforilación o microtúbulos tau.

Ensayo para la fosforilación y Microtubule obligatorios junto con la localización de la proteína Tau en células de cáncer colorrectal

En este artículo se describe un método para medir el consumo de oxígeno mediante respirometría de alta resolución de tórax permeabilized de Drosophila. Esta técnica requiere una cantidad mínima de tejido en comparación con la técnica de aislamiento mitocondrial clásica y los resultados obtenidos son más fisiológicamente relevantes.

Medición de consumo de oxígeno mitocondrial en las fibras Permeabilized de Drosophila utilizando cantidades mínimas de tejido

Aquí presentamos un protocolo para murino en vivo etiquetado de proteínas de la superficie celular glomerular con biotina. Este protocolo contiene información sobre la perfusión de los riñones de ratón, aislar glomérulos y realizar endógena inmunoprecipitación de la proteína de interés.

Aislamiento de glomérulos y en Vivo de etiquetado de proteínas de la superficie celular Glomerular

Describimos los protocolos para la determinación de la estructura del dominio de unión IKK de NEMO por cristalografía de rayos X. Los métodos incluyen la expresión de proteínas, purificación y caracterización, así como estrategias para la optimización exitosa del cristal y la determinación de la estructura de la proteína en su forma no unida.

Producción, cristalización y determinación de la estructura del dominio vinculante iKK de NEMO

Aprende a formar tactoides de microtúbulos mediante autoensamblaje usando MAP65 y PEG como agente de aglomeración. Este protocolo reproducible permite estudiar la organización de microtúbulos y sistemas biológicos como los husos mitóticos.

Autoensamblaje de tactoides de microtúbulos

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