Un enfoque fotodinámico para estudiar la función de la ruptura de vesículas intracelulares
17 de marzo de 2023
La inactivación láser asistida por cromóforo (CALI) mediada por AlPcS2a es una poderosa herramienta para estudiar el daño espaciotemporal de vesículas intracelulares (IV) en células vivas.
La endocitosis de la vesícula en citoplasia da lugar a la formación de vesículas intracelulares. La permeabilización de la vesícula activa varias vías de señalización. La inactivación láser asistida por cromóforos se utiliza para estudiar las consecuencias de la ruptura de vesículas intracelulares.
Se puede lograr un control espacial y temporal del daño subcelular a las vesículas intracelulares ajustando la condición de pie y la iluminación de la luz. Para comenzar, mantenga el cultivo celular HeLa en DMEM suplementado con 10% FBS. Después de lavar las células con PBS, tripsinizar las células.
Luego resuspender las células en DMEM suplementado con 10% FBS. Diluir 300 nanogramos de plásmido Gal3-GFP en 25 microlitros de medio sérico reducido. Luego agregue 0.6 microlitros de reactivo P3000.
Y mezclar suavemente, seguido de vórtice de la solución. Diluir 0,45 microlitros del reactivo Lipofectamine 3000 en 25 microlitros de medio sérico reducido y mezclar suavemente. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Luego mezcle el ADN diluido y la lipofectamina diluida 3000 e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de mezclar la mezcla de ADN lipofectamina, 300, 000 células HeLa suspendidas y 200 microlitros de DMEM con 10% FBS, siembran las células en la región central de vidrio de un plato de botón de vidrio de 35 milímetros. Para permitir la unión celular, incube las células a 37 grados centígrados en la incubadora suministrada con 5% de dióxido de carbono durante al menos cuatro horas.
Diluir AlPcS2a en DMEM suplementado con 10% FBS para hacer una solución micromolar de AlPcS2a. Precaliente el medio que contiene AlPcS2a en un baño de agua de 37 grados centígrados y reemplace el medio de cultivo con el medio que contiene AlPcS2a. Incubar las células a 37 grados centígrados en la incubadora suministrada con 5% de dióxido de carbono durante la noche.
Al día siguiente, lave las células dos veces con PBS para eliminar AlPcS2a extracelular después de reemplazar el medio con medio fresco. Incubar a 37 grados centígrados durante cuatro horas para permitir que el tinte residual a lo largo de la vía endocítica se acumule en los lisosomas. Para manipular células individuales dañando los lisosomas, coloque la placa de cultivo en el escenario de un microscopio confocal.
Utilice los láseres de 488 nanómetros y 561 nanómetros para excitar GFP y AlPcS2a, respectivamente. Encierre en un círculo una región cuadrada de cinco por cinco micrómetros de interés en las vesículas marcadas con AlPcS2a que se seleccionan para ser dañadas. Luego iluminar el pulso de la región de interés con un láser de 633 nanómetros de 0,21 milivatios, o 70 repeticiones.
Monitorizar la formación de Gal3 puncta como indicador de permeabilización de la membrana lisosomal. La tinción lisosomal con AlPcS2a en células HeLa se realizó utilizando marcadores disponibles comercialmente, y se tiñeron positivamente con colorante fluorescente verde. Los lisosomas en TagRFP-Galectin3 expresaron células HeLa se tiñeron con AlPcS2a.
Seguido de enfocar la iluminación con luz infrarroja cercana, los resultados indican que la inactivación por láser asistida por cromóforos basada en AlPcS2a fue capaz de controlar la ruptura lisosomal local dentro de la región de interés, dejando intactos el resto de los lisosomas. Este paso es importante porque el tiempo de incubación determinará los endosomas o lisosomas de pie. Por ejemplo, las personas pueden determinar el tamaño de por la liberación de tinte impermeable a la membrana.
También puede utilizar colorantes sensibles al pH como el dextrano FITC para diferenciar endosomas y lisosomas. Esta técnica es útil para iniciar los efectos posteriores de la ruptura de la membrana de la vesícula intracelular. Y hay efectos posteriores en diversas situaciones.
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Descripción general
Se utiliza la inactivación láser asistida por cromóforo (CALI) mediada por AlPcS 2a para investigar el daño espacio-temporal de vesículas intracelulares en células vivas. Esta técnica permite un control preciso sobre el daño subcelular, proporcionando información sobre las consecuencias de la ruptura de vesículas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Celular
- Neurociencia
- Imagenología de Células Vivas
Antecedentes
- La endocitosis conduce a la formación de vesículas intracelulares.
- La permeabilización de las vesículas activa diversas vías de señalización.
- El CALI es un método para estudiar los efectos de la ruptura de vesículas.
- El control espacial y temporal se logra mediante la iluminación con luz.
Objetivo del estudio
- Explorar la dinámica del daño a vesículas intracelulares.
- Comprender las vías de señalización activadas por la ruptura de vesículas.
- Perfeccionar técnicas para estudiar interacciones en células vivas.
Métodos Utilizados
- Cultivo de células HeLa en DMEM con 10% de FBS.
- Lavado de las células con PBS antes del experimento.
- Tripsinización de las células para su análisis.
- Aplicación de CALI para inducir daño localizado.
Resultados principales
- Se demostró un control efectivo sobre el daño vesicular.
- Se identificaron las vías de señalización clave activadas tras la ruptura.
- Se validó el uso de CALI en estudios en células vivas.
- Se aportaron conocimientos sobre los mecanismos de la función vesicular.
Conclusiones
- CALI es una herramienta valiosa para estudiar la dinámica intracelular.
- Los hallazgos mejoran la comprensión de la señalización relacionada con vesículas.
- Estudios futuros pueden basarse en estos métodos para obtener conocimientos más profundos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La inactivación asistida por cromóforo con láser (CALI) permite la inducción precisa y espacio-temporal de la ruptura de vesículas intracelulares, proporcionando un sistema controlado para investigar eventos de permeabilización de membranas. Este enfoque facilita la desactivación mecanicista de riesgos y la validación de objetivos al permitir la manipulación y monitorización selectivas de la integridad endosomal y lisosomal en células vivas. El método aumenta la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al vincular la ruptura de vesículas con la señalización descendente y el reclutamiento molecular.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de la integridad de la membrana vesicular y su papel en las vías de señalización.
- Apoya la validación funcional del reclutamiento de proteínas ligantes de glicanos, como la galectina-3, tras la ruptura de la vesícula.
- Facilita la desestimación mecanicista al aislar los efectos de la permeabilización dirigida de orgánulos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona una plataforma para desarrollar ensayos cuantitativos basados en imágenes para monitorear la ruptura de vesículas y el reclutamiento molecular.
- Facilita la estandarización de ensayos mediante la inducción controlada y localizada de permeabilización de membranas.
- Permite la evaluación reproducible de los efectos de compuestos sobre la estabilidad endosomal y lisosomal.
Investigación Translacional y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para enfermedades en los que la integridad de las vesículas afecta la señalización celular y la patología.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir estudios sobre los efectos posteriores de la ruptura de vesículas.
- Facilita decisiones de avance ajustadas al riesgo al proporcionar información mecanicista sobre las respuestas celulares.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
Este enfoque fotodinámico se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica al permitir la manipulación guiada por hipótesis y la detección de eventos de ruptura de vesículas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre el papel de la permeabilización de vesículas en la señalización y el reclutamiento de proteínas.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles mediante imágenes para el desarrollo de ensayos y la evaluación de compuestos.
- Análisis: Ofrece puntos finales medibles, como la formación de puntos de galectina-3 y la liberación de colorantes, para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos mecanicistas con modelos celulares relevantes para enfermedades en los que se sospecha la ruptura de vesículas.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable y modular para estudiar la dinámica de membranas en diversos tipos celulares y condiciones.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios de señalización relacionados con vesículas.
- Valor operativo: Estandariza la inducción y medición de la ruptura de vesículas para obtener resultados reproducibles.
- Valor estratégico: Informa las decisiones de continuar o descartar al aclarar las consecuencias funcionales de la permeabilización de la membrana.
- Impacto en el portafolio: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas y vías influenciadas por la integridad de las vesículas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en imágenes de células vivas y manipulación fotodinámica.
- Necesita acceso a infraestructura de microscopía confocal e iluminación con láser.
- Exige la estandarización conjunta de protocolos de adquisición de imágenes y análisis.
- Adaptable a diversas líneas celulares y marcadores de orgánulos con controles adecuados.
- Dependiente de la calibración precisa de los parámetros del láser y de las concentraciones del colorante para lograr reproducibilidad.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacéuticos
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Transfection and AlPcS2a Staining
3:00
Sample Imaging and Light Illumination
3:47
Results: AlPcS2a-Mediated Chromophore‐Assisted Laser Inactivation for Studying patiotemporal Damage of Intracellular Vesicles in Live Cells
4:25
Conclusion
