Name: Reconstitución de corticidades mínimas de actina atadas a la membrana en bicapas lipídicas soportadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Aprende a ensamblar redes de actomiosina unidas a membrana en bicapas lipídicas soportadas para estudiar dinámicas citoesqueléticas mediante microscopía avanzada. Este protocolo permite la adición secuencial de proteínas sin perturbar la integridad de la red.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por el fondo de investigación AXA y el Programa de Biomedicina Cuantitativa Warwick-Wellcome (Wellcome ISSF, RMRCB0058) para DVK, NCBS-TIFR para AB y ST, y la beca Wellcome-DBT Margdarshi (IA / M / 15/1 / 502018) para SM. DVK también desea agradecer a la Sociedad Biofísica por permitir el evento de redes virtuales "Desafíos en la comprensión de redes citoesqueléticas de componentes múltiples desde la molecular hasta la mesoescala", que contribuyó a la creación de esta colección de protocolos.

<ol><li>Köster, D. V., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+and+the+plasma+membrane%3A+Inextricably+intertwined%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortical actin and the plasma membrane: Inextricably intertwined.</a> Current Opinion in Cell Biology. 38, 81-89 (2016).</li>
<li>Rao, M., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+organization+of+membrane+constituents+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Active organization of membrane constituents in living cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 29, 126-132 (2014).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipid+bound+actin+meshwork+organizes+liquid+phase+separation+in+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A lipid bound actin meshwork organizes liquid phase separation in model membranes.</a> eLife. 3, 01671(2014).</li>
<li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratification+relieves+constraints+from+steric+hindrance+in+the+generation+of+compact+actomyosin+asters+at+the+membrane+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Stratification relieves constraints from steric hindrance in the generation of compact actomyosin asters at the membrane cortex.</a> Science Advances. 6 (11), (2020).</li>
<li>Köster, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+dynamics+drive+local+membrane+component+organization+in+an+in+vitro+active+composite+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Actomyosin dynamics drive local membrane component organization in an in vitro active composite layer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (12), 1645-1654 (2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Heinemann, F., Chwastek, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+MACs+%28minimal+actin+cortices%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The design of MACs (minimal actin cortices).</a> Cytoskeleton. 70 (11), 706-717 (2013).</li>
<li>Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+contractile+actomyosin+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of contractile actomyosin arrays.</a> Methods in Enzymology. 540, 265-282 (2014).</li>
<li>Mosby, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+filament+dynamics+in+actin+networks+revealed+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Myosin II filament dynamics in actin networks revealed with interferometric scattering microscopy.</a> Biophysical Journal. 118 (8), 1946-1957 (2020).</li>
<li>Seara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropy+production+rate+is+maximized+in+non-contractile+actomyosin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin.</a> Nature Communications. 9 (1), 4948(2018).</li>
<li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7, 12615(2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> eLife. 2, 00116(2013).</li>
<li>Ditlev, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+composition-dependent+molecular+clutch+between+T+cell+signaling+condensates+and+actin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A composition-dependent molecular clutch between T cell signaling condensates and actin.</a> eLife. 8, 42695(2019).</li>
<li>Banjade, S., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transitions+of+multivalent+proteins+can+promote+clustering+of+membrane+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Phase transitions of multivalent proteins can promote clustering of membrane receptors.</a> eLife. 3, 04123(2014).</li>
<li>Heinemann, F., Vogel, S. K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+membrane+diffusion+modulated+by+a+minimal+actin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Lateral membrane diffusion modulated by a minimal actin cortex.</a> Biophysical Journal. 104 (7), 1465-1475 (2013).</li>
<li>Vogel, S. K., Greiss, F., Khmelinskaia, A., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lipid+domain+organization+by+a+biomimetic+contractile+actomyosin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Control of lipid domain organization by a biomimetic contractile actomyosin cortex.</a> eLife. 6, 24350(2017).</li>
<li>Block, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brownian+motion+at+lipid+membranes%3A+A+comparison+of+hydrodynamic+models+describing+and+experiments+quantifying+diffusion+within+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Brownian motion at lipid membranes: A comparison of hydrodynamic models describing and experiments quantifying diffusion within lipid bilayers.</a> Biomolecules. 8 (2), 30(2018).</li>
<li>JoVE, JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Methods+Collection.+In+vitro+reconstitution+of+cytoskeleton+networks+for+biomaterials%2C+biophysics+and+active+matter+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Methods Collection. In vitro reconstitution of cytoskeleton networks for biomaterials, biophysics and active matter research.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+muscle+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of muscle actin.</a> Methods in Enzymology. 85, 164-181 (1982).</li>
<li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+purification+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Myosin purification and characterization.</a> Methods in Cell Biology. 24, 331-371 (1982).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Separating protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WH2+and+proline-rich+domains+of+WASP-family+proteins+collaborate+to+accelerate+actin+filament+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 102-121 (2018).</li>
<li>Shrivastava, R., Köster, D., Kalme, S., Mayor, S., Neerathilingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailor-made+ezrin+actin+binding+domain+to+probe+its+interaction+with+actin+in-vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tailor-made ezrin actin binding domain to probe its interaction with actin in-vitro.</a> PLoS One. 10 (4), 0123428(2015).</li>
<li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+STED-FCS+reveals+spatiotemporal+heterogeneity+of+lipid+interaction+in+the+plasma+membrane+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells.</a> Nature Communications. 5, 5412(2014).</li>
<li>Selden, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+programmed+cell+adhesion+with+membrane-anchored+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemically programmed cell adhesion with membrane-anchored oligonucleotides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (2), 765-768 (2012).</li>
<li>Seu, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surface+treatment+on+diffusion+and+domain+formation+in+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K., DiBenedetto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+equation+to+extract+diffusion+coefficients+from+confocal+FRAP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Simplified equation to extract diffusion coefficients from confocal FRAP data.</a> Traffic. 13 (12), 1589-1600 (2012).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+computational+framework+for+D%28t%29+from+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching+data+reveals+various+anomalous+diffusion+types+in+live+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A novel computational framework for D(t) from Fluorescence Recovery after Photobleaching data reveals various anomalous diffusion types in live cell membranes.</a> Traffic. 20 (11), 867-880 (2019).</li>
<li>Lorén, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+recovery+after+photobleaching+in+material+and+life+sciences%3A+Putting+theory+into+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Fluorescence recovery after photobleaching in material and life sciences: Putting theory into practice.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (3), 323-387 (2015).</li>
<li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (7), 1-7 (2013).</li>
<li>Andrecka, J., Spillane, K. M., Ortega-Arroyo, J., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+and+control+of+Supported+lipid+bilayer+formation+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Direct observation and control of Supported lipid bilayer formation with interferometric scattering microscopy.</a> ACS Nano. 7 (12), 10662-10670 (2013).</li>
<li>Lin, W. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membrane+formation%2C+characterization%2C+functionalization%2C+and+patterning+for+application+in+biological+science+and+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Supported membrane formation, characterization, functionalization, and patterning for application in biological science and technology.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 2 (4), 235-269 (2010).</li>
<li>Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+solid-supported+lipid+bilayers%3A+An+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view.</a> Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).</li>
<li>Sapuri-Butti, A. R., Butti, R. C., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+supported+membranes+on+topographically+patterned+polymeric+elastomers+and+their+applications+to+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Characterization of supported membranes on topographically patterned polymeric elastomers and their applications to microcontact printing.</a> Langmuir. 23 (25), 12645-12654 (2007).</li>
<li>Leptihn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+droplet+interface+bilayers+from+the+contact+of+aqueous+droplets+in+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+actomyosin+patterns+drive+cell-like+membrane+shape+changes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes.</a> iScience. 25 (5), 104236(2022).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), e63332(2021).</li>
<li>Murrell, M., Chen, S., Sun, Z. G. In vitro reconstitution of actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurrell%2C+M+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2022).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Este protocolo presenta una plataforma versátil y un punto de partida para diseñar experimentos para estudiar la interfaz membrana-corteza de las células. Los pasos críticos son la preparación de portaobjetos de vidrio limpios, el uso de lípidos frescos para la formación eficiente de SUV (ambos afectan la calidad de los SLB) y el uso de proteínas de miosina II recién recicladas para la reorganización dinámica del filamento de actina. Cuando la dinámica de imágenes durante mucho tiempo, es muy importante incorporar un sistema eliminador de oxígeno (por ejemplo, ácido protocatecúico y protocatecuato 3 4-dioxigenasa 5,31).
El diseño de cámara abierta permite la adición secuencial de componentes a un sistema existente sin inducir flujos de lípidos. Esto puede ser una ventaja importante sobre los enfoques de cámara cerrada comúnmente utilizados o el trabajo con proteínas encapsuladas dentro de los liposomas36. Los efectos contrarios, como la deformación de la membrana inducida por proteínas, no se pueden estudiar con bicapas lipídicas adsorbidas en vidrio.
Las bicapas lipídicas se pueden formar con una amplia gama de composiciones lipídicas. Comienza con la adsorción de las vesículas lipídicas a la superficie vítrea hidrófila, seguida de la ruptura espontánea de la vesícula debido a las interacciones superficie-vesícula y vesícula-vesícula directa o las vesículas adsorbidas que alcanzan una cobertura crítica después de la cual una pequeña fracción de vesículas se rompen, formando bordes activos, lo que finalmente conduce a la formación de bicapa32 . Además del vidrio, se pueden usar varios sustratos para formar bicapas lipídicas soportadas, como Mica (por ejemplo, para microscopía de fuerza atómica), sustratos blandos (por ejemplo, poli-di-metil-siloxano), cojines de polímero33,34,35, que se extienden entre agujeros de rejillas de microscopía electrónica 14. Las bicapas de interfaz de gotas son otro método interesante para crear bicapas lipídicas estables e independientes36. La inclusión de redes de actomiosina en vesículas o emulsiones es un método muy poderoso para estudiar este sistema mínimo en una geometría similar a una célula37,38, y que se describe en detalle en otra parte 39.

La membrana plasmática de una célula animal viva interactúa constantemente con el citoesqueleto de actina adyacente, y juntos forman un material compuesto activo que cumple una multitud de funciones celulares 1,2. Para estudiar los procesos en esta interfaz membrana lipídica-actina, la reconstitución de las redes citoesqueléticas sobre las bicapas lipídicas soportadas (SLB) ha demostrado ser muy útil. Este enfoque de sistema mínimo permite el control preciso de los componentes de la red del citoesqueleto y la composición lipídica. En comparación con las membranas lipídicas independientes de las vesículas unilamelares gigantes, la geometría plana de las SLB permite el uso eficiente de técnicas de microscopía de última generación, como la superresolución3,4, la fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)5,6,7 o la dispersión interferométrica 8 Estudiar la organización espacial y la dinámica de las redes citoesqueléticas. TIRF proporciona el mayor contraste para los componentes marcados con fluorescencia, ya que la señal de las moléculas marcadas no unidas en la solución que contribuyen a la señal de fondo es mínima.
Aquí, describimos un protocolo básico para la formación de redes de actomiosina atadas a bicapas lipídicas soportadas, que son ampliamente utilizadas en el campo para estudiar la física de redes activas cuasi-2D 9,10,11 y su efecto sobre la organización de la membrana3,5,12,13,14,15,16 (Figura 1 ). Este enfoque no se limita a las redes basadas en actina, sino que también se puede adaptar fácilmente para explorar microtúbulos, filamentos intermedios o redes compuestas de naturaleza mixta y para estudiar una variedad de interacciones entre las proteínas de la membrana lipídica y los componentes citoesqueléticos utilizando métodos de microscopía sensibles a la superficie.
Para mantener este protocolo enfocado, hemos excluido una descripción detallada de la purificación y etiquetado de proteínas de actina y miosina o detalles sobre cómo ajustar y controlar la contractilidad y organización de las redes de actomiosina. Se debe hacer referencia a otros protocolos que se publican junto con éste en la Colección de Métodos JoVE, Reconstitución in Vitro de Redes de Citoesqueleto para Biomateriales, Biofísica e Investigación de Materia Activa17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig01.jpg"> Figura 1: Esquema del sistema compuesto activo actina-membrana in vitro . Creado con Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>1,2 dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- (lisisamina rodamina B sulfonilo)</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>810158</td><td>16:0 RhoPE</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3- [(N-(5-amino-1 carboxipentilo) ácido iminodiacético) succinil] (sal de níquel)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404</td><td>DGS-NTA-Ni2+</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Lípidos polares</td><td>850375</td><td>DOPC</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td></td><td>Ávidos Ámbar</td> 850355 <td>DPPC</td></tr><tr><td>Viales de vidrio ámbar</td><td>ThermoFisher</td><td>B7990-2A</td><td></td></tr><tr><td>Sal disódica ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de celda Attofluor</td><td>ThermoFisher</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador de baño</td><td>GT Sonic</td><td>1860QTS</td><td></td></tr><tr><td>beta-caseína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>12135</td><td></td></tr><tr><td>cloroformo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650471</td><td>alternativamente de Electron Microscopy Sciences, 50980296</td></tr><tr><td>Cubreobjetos, #1, 25 mm de diámetro, Sello de Oro</td><td>Harvard Apparatus</td><td>64-0705B</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos, #1, 40x22 mm, Sello de Oro</td><td>ThermoFisher</td><td>48404-031</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>G12635</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Himedia</td><td>MB130</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de vidrio herméticas al gas, con aguja extraíble, roma, volúmenes 10 y micro; L, 100 y micro; L, 500 y micro; L</td><td>Hammilton</td> serie <td></td><td>1700</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma Analytics</td><td>Z805939</td><td>solución de limpieza</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Himedia</td><td>RM380</td><td></td></tr><tr><td>KaH2PO4</td><td>ThermoFisher</td><td>G13405</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>ThermoFisher</td><td>G13305</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>ThermoFisher</td><td>G26708</td><td></td></tr><tr><td>Extrusora de lípidos</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>61000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>G15535</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador Microtip</td><td>Sonics</td><td>VC750</td><td>3 mm Diámetro</td></tr><tr><td>de la punta Na2CO3</td><td>ThermoFisher</td><td>G15955</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Himedia</td><td>GRM853</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>ThermoFisher</td><td>G15825</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>ThermoFisher</td><td>G27815</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Nikon Ti Eclipse TIRF</td><td>Nikon</td><td></td><td>Con una unidad TIRF conectada a través de una fibra óptica que conserva la polarización a un combinador láser monolítico Agilent MLC400 con múltiples líneas láser con un objetivo de aceite Nikon de 100X, 1.45 NA con dos cámaras EMCCD de 512 x 512 píxeles (Photometrics Evolve 512) con un objetivo de aceite Nikon de 100X, 1.45 NA con dos cámaras EMCCD de 512 x 512 píxeles (Photometrics Evolve 512)</td></tr><tr><td>NOA88</td><td>Norland Products</td><td>8801</td><td></td></tr><tr><td>Pinza recubierta de PTFE Estilo #2A</td><td>Sonda de estructura</td><td>0S2AT-XD</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>ThermoFisher</td><td>G15925</td><td></td></tr><tr><td>El iluminador UV</td><td>Novascan</td><td>PSD PRO-UV</td><td>necesita vacío y suministro 2</td></tr></tbody></table>

reconstitución de corticidades mínimas de actina atadas a la membrana en bicapas lipídicas soportadas

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

La superficie de una célula viva proporciona una plataforma activa versátil para numerosos procesos celulares, que surgen de la interacción de la membrana plasmática con la corteza de actina subyacente. En las últimas décadas, los sistemas mínimos reconstituidos basados en bicapas lipídicas soportadas en combinación con redes de filamentos de actina han demostrado ser muy instrumentales para desentrañar los mecanismos básicos y las consecuencias de las redes de actina atadas a la membrana, así como para estudiar las funciones de las proteínas individuales asociadas a la membrana. Aquí, describimos cómo reconstituir tales sistemas compuestos activos in vitro que consisten en bicapas lipídicas soportadas por fluidos acopladas a través de proteínas de unión a actina asociadas a la membrana a filamentos dinámicos de actina y motores de miosina que se pueden observar fácilmente a través de microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Un diseño de cámara abierta permite ensamblar el sistema paso a paso y controlar sistemáticamente muchos parámetros, como la concentración de proteína enlazadora, la concentración de actina, la longitud del filamento de actina, la relación actina / miosina, así como los niveles de ATP. Finalmente, discutimos cómo controlar la calidad del sistema, cómo detectar y solucionar problemas que ocurren comúnmente y algunas limitaciones de este sistema en comparación con la superficie de la célula viva.

Para la representación, aquí se muestra un perfil típico de postblanqueador de la 1ª imagen después del fotoblanqueo (imagen en t = 0 s en la Figura 3A) y su ajuste a la siguiente función28 (ver Figura 6A):
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq04.jpg" style="margin: auto;">
El valor de r e (23,94 μm) calculado por el ajuste a esta curva es muy similar al re calculado en el paso 2.8.4. (23,24 μm). Aquí, K es un parámetro de profundidad de lejía que se puede estimar directamente a partir de F0 (descrito en el paso 2.8.4.). Del mismo modo, la figura 6B muestra el perfil de recuperación y su ajuste a la siguiente función28:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq05.jpg" style="margin: auto;">
Encontramos que el valor ajustado del coeficiente de difusión es 1.34 μm 2/s, un valor que concuerda estrechamente con el valor de 1.39 μm 2/s que se calcula mediante la fórmula en el paso2.8.4. Aquí, MF representa la fracción móvil de la bicapa lipídica que representa la fracción de la población blanqueada que se recupera. La movilidad de las moléculas ancladas a lípidos depende, por supuesto, de la composición lipídica y su estado físico (fase líquida o gel). Para nuestros experimentos con membranas lipídicas basadas en DOPC, la movilidad debe ser &gt;1 μm2/s, y la fracción móvil no debe ser inferior a 0,9 para indicar una buena bicapa lipídica. Recomendamos el uso del método manual sin ajuste para una prueba rápida de la calidad y movilidad de la bicapa. El método de ajuste puede ser útil al automatizar el análisis para muchas curvas FRAP. Además, si se desea realizar un experimento FRAP más sofisticado para caracterizar sistemáticamente la difusión en el sistema, recomendamos al lector esta revisión de Lorén et al.30 para obtener más detalles sobre el ajuste de modelos y posibles dificultades en el diseño experimental.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig06.jpg"> Figura 6: Cuantificación del coeficiente de difusión de bicapas lipídicas. (A) Perfil lineal de la primera imagen después del fotoblanqueo (t = 0 s en la Figura 3A) y su ajuste a la ecuación 4 para calcular el radio de lejía efectivo. (B) El perfil de recuperación de la región blanqueada y su ajuste a la ecuación 5 para calcular el coeficiente de difusión y la fracción móvil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Un resultado típico de los experimentos descritos anteriormente que muestra el ensamblaje dinámico y la organización de una red de acto-miosina unida en una bicapa lipídica soportada fotografiada por microscopía TIRF se representa en la Figura 7 y el Video Suplementario S1.
La Figura 7 muestra un montaje de imagen de la proteína enlazadora, F-actina y miosina-II.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig07.jpg"> Figura 7: Los flujos contráctiles de actomiosina impulsan la agrupación local de la proteína enlazadora de actina de membrana HYE. Instantáneas TIRF de HYE (marcadas con YFP), filamentos de actina (marcados con maleimida Atto-635) y filamentos de miosina II (marcados con maleimida Atto-565) tras la adición de miosina II a un SLB que contiene HYE y F-actina. El tiempo se indica en la parte superior: 0 min es inmediatamente antes de que los miofilamentos fluorescentes comenzaran a aparecer en el campo TIRF. HYE y F-actina se distribuyen homogéneamente sobre la bicapa lipídica antes de la adición de miosina (0 min). La actividad de la miosina induce flujos contráctiles de actomiosina, que emergen en estructuras similares a aster en el estado estacionario (15 min), impulsando la agrupación local del componente de membrana acoplada (HYE). La fila más baja es una fusión de imágenes de actina (amarillo) y miosina II (magenta) que muestran la organización de actina y miosina en diferentes puntos de tiempo. Las imágenes utilizadas para hacer estos montajes se corrigieron en Fiji para la señal de fondo, los patrones de intensidad no uniformes y el movimiento de traslación. Barra de escala = 10 μm. Para obtener más información, consulte el vídeo complementario S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nombre del búfer</td>
			<td colspan="2">Composición</td>
		</tr><tr><td>Tampón de rehidratación lipídica</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, sacarosa al 5%, pH 7.5</td>
		</tr><tr><td>Búfer de formación SLB</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 5-6</td>
		</tr><tr><td>Búfer de almacenamiento SLB</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.2</td>
		</tr><tr><td>Tampón de dilución de proteínas</td>
			<td colspan="2">20 mM HEPES, 100 mM KCl, 1mM TCEP o DTT, pH 7.2</td>
		</tr><tr><td>1X ME o tampón de intercambio iónico de actina</td>
			<td colspan="2">50 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7,2 (almacenar a 4°C)</td>
		</tr><tr><td>1X KMEH o tampón de polimerización de actina</td>
			<td colspan="2">50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM HEPES, pH 7.2</td>
		</tr><tr><td>Stock de ATP de 100 mM</td>
			<td colspan="2">100 mM de ATP sal disódica, 50 mM de Tris, 50 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, 2 mM de EGTA, pH 7,5 (conservar a -20°C)</td>
		</tr><tr><td>2x Búfer de destino</td>
			<td colspan="2">2x KMEH, 2 mg/ml BSA, 2mM ATP, 5mM TCEP (almacenado a 4°C)</td>
		</tr><tr><td>G-buffer</td>
			<td colspan="2">2 mM Tris, 0,1 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 0,5 mM TCEP, 0,04 % NaN3, pH 8 (almacenar a 4°C)</td>
		</tr><tr><td>Tampón de miosina II</td>
			<td colspan="2">500 mM KCl, 1 mM EDTA, 10-20 mM Hepes, pH 7.0</td>
		</tr><tr><td>Tampón de cromatografía de filtración en gel</td>
			<td colspan="2">50 mM Tris-HCl, 150-300 mM NaCl, 5 mM TCEP, 0,1% Tween-20, pH 7.5</td>
		</tr><tr><td>Tapado de proteínas Tampón de almacenamiento</td>
			<td colspan="2">10 mM Tris· Cl, 50 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7.5, 20% glicerol</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Lista de composiciones de búfer utilizadas en este protocolo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Problemas comunes y su solución de problemas</td>
			<td>Problema</td>
			<td colspan="4">Causa</td>
			<td colspan="4">Posibles soluciones</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>La bicapa lipídica no muestra difusión</td>
			<td colspan="4">La causa más probable de este problema es el vidrio sucio que puede ocurrir cuando la solución de limpieza está envejecida o el calentamiento no tuvo lugar durante la sonicación del baño. Estas bicapas tienen una apariencia "vesicular" porque las vesículas reventadas se adhieren al vidrio de cubierta pero no se fusionan entre sí. El uso de MLV de más de 6 semanas o SUV de más de 6 días, o la adición de cantidades bajas de SUV también puede conducir a la formación de bicapas vesiculares.</td>
			<td colspan="4">Use una solución de limpieza fresca. Asegúrese de que el calentador esté encendido y que la temperatura esté entre 45-65 ° C. Use mezclas de lípidos frescos. (El uso de una sonda de lípidos fluorescentes frente a una sonda de proteína fluorescente a veces puede manifestarse de manera diferente. Por ejemplo, si la bicapa tiene defectos de subdifracción y se omite el paso de pasivación superficial (o no funciona), la sonda lipídica mostrará una distribución de intensidad uniforme, pero la sonda de proteína fluorescente puede mostrar puntos fluorescentes brillantes).</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>La bicapa lipídica tiene parches brillantes</td>
			<td colspan="4">La incubación prolongada de SUV para la formación de bicapas puede crear una bicapa lipídica que se difunde en general pero con parches brillantes ocasionales. Estos parches pueden ser bicapas de varias capas que pueden atraer grandes cantidades de sondas fluorescentes.</td>
			<td colspan="4">15-20 minutos de incubación con SUV es suficiente. Asegúrese de que la sonda no se agrega: un giro rápido y duro de la proteína enlazadora (300 x g durante 15 min a 4 °C) puede eliminar los agregados</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>La bicapa lipídica tiene agujeros oscuros</td>
			<td colspan="4">Esto sucede cuando la bicapa está hecha de SUV viejos y se toma una imagen durante horas prolongadas (&gt; 4 horas después de la formación), o el pH de la solución cambia drásticamente debido a imágenes prolongadas (por ejemplo, en el estado de ATP alto y en presencia de ciertos eliminadores de oxígeno), o cuando la superficie está sobrepasivada con beta-caseína (agregando demasiada beta-caseína durante más de 10-15 minutos y o no lavándola).</td>
			<td colspan="4">Use lípidos frescos. Reduzca la velocidad de fotogramas de imagen o el tiempo de iluminación láser efectivo. Utilice búferes con mayor capacidad de almacenamiento en búfer.</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>La bicapa lipídica muestra una difusión lenta</td>
			<td colspan="4">Las bicapas lipídicas con alto porcentaje de colesterol, los lípidos saturados largos o los lípidos cargados se difunden más lentamente.</td>
			<td colspan="4">En tales casos, prepare su muestra a alta temperatura. También se puede usar una composición lipídica simple y probada como control junto con composiciones lipídicas complejas y no probadas. Asegúrese de que el vidrio esté limpio.</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>La actina no polimeriza</td>
			<td colspan="4">El amortiguador objetivo es viejo, el stock de actina G es demasiado viejo, la actina G vieja y la nueva fueron copolimerizadas.</td>
			<td colspan="4">Asegúrese de que el Ca 2+ se sustituye por Mg2+ antes de la polimerización (utilizando tampón ME). Utilice caldo ATP-Mg2+ fresco. Use G-actina recién reciclada. Asegúrese de que la concentración de actina F (en términos de actina G) añadida a la bicapa sea superior a 0,2 μM. Para concentraciones más bajas, use faloidina estabilizada F-actina.</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>La actina no se une a la bicapa</td>
			<td colspan="4">El enlazador de actina de membrana no se agrega ni se agrega a una concentración muy baja; esto se puede inferir de la fluorescencia de la proteína del vinculador. Si la fluorescencia es decente, el enlazador membrana-actina ha perdido capacidad de unión a la actina. Además, si la proteína enlazadora no se une específicamente a la superficie del vidrio (cuando la bicapa es mala), es posible que no reclute filamentos de actina.</td>
			<td colspan="4">Asegúrese de que la bicapa se esté difundiendo. Use proteína enlazadora fresca</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td>La señal fluorescente de actina F es débil</td>
			<td colspan="4">La proporción de actina marcada a oscura es demasiado baja. La actina marcada o la actina no marcada es demasiado antigua y no se están copolimerizando entre sí.</td>
			<td colspan="4">Recicle la actina de nuevo y vuelva a intentar la ploimerización con actina recién reciclada. El fotodaño puede destruir o despolimerizar la actina F; Si es posible, use tintes rojos o rojos lejanos para la actina (y la miosina).</td>
		</tr><tr><td>8</td>
			<td>La miosina no muestra contractilidad</td>
			<td colspan="4">se puede observar que después de agregar ATP al sistema infundido con miosina, no hay contractilidad de la actomiosina.</td>
			<td colspan="4">Compruebe si la concentración de miosina o el nivel de pureza son buenos. Use miosina recién reciclada (úsela dentro de las 6 semanas posteriores al reciclaje). Agregar ATP fresco a la mezcla de miosina puede ayudar. Desgasificación de tampones y uso de eliminadores de oxígeno, etc. Puede reducir el fotodaño de los motores.  Se puede encontrar más información en los protocolos de Plastino et al. o Stam et al. de la misma colección de métodos</td>
		</tr><tr><td>9</td>
			<td>El vidrio de cubierta no es hidrófilo</td>
			<td colspan="4">El vidrio cubierto no se limpia correctamente.</td>
			<td colspan="4">El vidrio de cubierta hidrófilo limpio es crucial para la formación de la bicapa lipídica. Una lectura visual útil de la hidrofilicidad del vidrio de cubierta después del protocolo de limpieza es observar la humectación del vidrio por agua. Agregue un pequeño volumen de agua a un cubreobjetos plano. El agua permanecerá en forma de gota redonda si el cubreobjetos no se limpia adecuadamente. Sin embargo, el mismo volumen de agua se extenderá y formará una capa delgada, sobre un vidrio de cubierta hidrófilo tratado. Este comportamiento humectante del agua en la superficie del vidrio de la cubierta se puede utilizar para determinar si los pasos de limpieza con la solución de limpieza / NaOH han funcionado.</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Guía de solución de problemas que resume los problemas comunes y las soluciones correspondientes. 
Video complementario S1: Los flujos contráctiles de actomiosina impulsan la agrupación local de la proteína de enlace de actina de membrana HYE. Timelapse TIRF de HYE (marcado con YFP), filamentos de actina (marcados con maleimida Atto-635) y filamentos de miosina II (marcados con maleimida Atto-565) tras la adición de miosina II a un SLB que contiene HYE y F-actina. El tiempo se indica en la parte superior: 0 min es inmediatamente antes de que los miofilamentos fluorescentes comenzaran a aparecer en el campo TIRF. Barra de escala = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/S1Movie_Act_myo_Hye_merge_timestamp_15fps.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este protocolo describe la formación de bicapas lipídicas soportadas y la adición de filamentos citoesqueléticos y proteínas motoras para estudiar la dinámica de las redes citoesqueléticas reconstituidas y atadas a la membrana utilizando microscopía de fluorescencia.

Reconstitución de corticidades mínimas de actina atadas a la membrana en bicapas lipídicas soportadas

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

Aquí, demostramos un procedimiento relativamente simple y directo para ensamblar redes de actomiosina atadas a membrana y estudiar la dinámica utilizando técnicas microscópicas de luz avanzadas. La ventaja clave es que nuestro ensayo permite la adición secuencial de proteínas y moléculas pequeñas sin perturbar las redes atadas a la membrana. Este método se puede adaptar fácilmente para estudiar otras proteínas citoesqueléticas o redes compuestas.La parte más crítica del protocolo es garantizar que la bicapa lipídica soportada se forme correctamente, por lo que primero, tuvimos que dominar este paso antes de comenzar a agregar las proteínas citoesqueléticas. Para comenzar, tome de tres a cinco cubreobjetos de vidrio rectangulares y colóquelos dentro de un frasco de coplin. Encienda el sonicador de baño y ajuste la temperatura a 65 grados centígrados.Llene el frasco de coplin con una solución de limpieza al 2% para sumergir completamente los cubreobjetos y colóquelo en el sonicador durante 30 minutos en modo de pulso completo. Use pinzas recubiertas de PTFE romo para quitar los cubreobjetos uno por uno. Enjuáguelos bien con agua destilada y colóquelos en otro frasco de coplin lleno de dos hidróxido de sodio normales.Sonica los cubreobjetos durante 20 minutos en modo de pulso completo. Retire los cubreobjetos, enjuague bien con agua destilada y colóquelos en otro frasco de coplin lleno de agua destilada. Antes de comenzar el experimento, tome el frasco en una campana química equipada con un suministro de gas nitrógeno.Use guantes y pinzas para quitar los cubreobjetos y secarlos bajo la corriente de nitrógeno. Seque ambos lados y colóquelos en una rejilla de plástico limpia con una cubierta. Coloque la caja con los cubreobjetos en un desecador para evitar el contacto con partículas de polvo, luego tome tubos de PCR esterilizados en autoclave y corte sus tapas y mitades cónicas inferiores con una cuchilla quirúrgica afilada.Tome los tubos cilíndricos de medio corte, aplique adhesivo curable UV en el borde liso de cada tubo cortado y colóquelo invertido en un cubreobjetos recién limpiado de modo que el borde quede plano sobre el cubreobjetos. No mueva el cilindro lateralmente una vez que esté colocado en el cubreobjetos para asegurarse de que el pegamento no se derrame en el espacio central de la cámara. Coloque los cubreobjetos del cojinete de la cámara dentro de un limpiador de ozono UV con suministro de oxígeno y vacío.Encienda la luz UV e ilumine durante tres a cinco minutos para permitir que el adhesivo polimerice. Saque los cubreobjetos y pruebe las cámaras para detectar fugas, y deseche las cámaras con fugas. Lave cada cámara con tampón de formación SLB, dejando 100 microlitros de tampón al final.Marque el nivel del tampón a 100 microlitros con un marcador permanente, luego agregue dos microlitros de cloruro de calcio molar 0.1 a la cámara, seguido de ocho microlitros de la solución SUV a cada cámara e incube durante 15 minutos a 25 grados centígrados. Retire 50 microlitros del tampón de formación SLB, dejando solo 50 microlitros en la cámara de muestra, luego agregue 100 microlitros de un XKMEH a la cámara y mezcle suavemente. Retire 100 microlitros del tampón sin tocar el fondo.Repita los lavados de ocho a 10 veces agregando 100 microlitros de un XKMEH y retirando 100 microlitros. Agregue 10 microlitros de un miligramo por mililitro de beta-caseína a la bicapa, mezcle suavemente e incube durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente. Lave la beta-caseína tres veces con un XKMEH y vuelva a llevar el nivel de tampón a la marca de 100 microlitros.Durante la incubación de beta-caseína, saque una alícuota de proteína enlazadora de actina de membrana por menos 80 grados centígrados descongelada rápidamente a 37 grados centígrados, y luego manténgala en hielo. Diluir la alícuota con tampón de dilución de proteínas hasta una concentración de un micromolar. Agregue la proteína enlazadora a la solución a una concentración final definida y mezcle suavemente.Incubar durante 30 a 40 minutos a temperatura ambiente y lavar de tres a cinco veces con un tampón XKMEH para eliminar la proteína HSE no unida. Lleve el nivel de amortiguación en cada cámara a la marca de 100 microlitros. El ejemplo ya está listo para la creación de imágenes.Encienda el microscopio, los láseres de excitación y las cámaras de detección. Asegúrese de que el láser esté alineado, que el objetivo se limpie y que el software esté listo para adquirir imágenes. Ponga aceite en el objetivo de 100 veces, monte la muestra en la etapa del microscopio y enfoque el objetivo en la bicapa.Asegúrese de que la posición del láser sea tal que sufra una reflexión interna total en la muestra. Utilice una excitación de 488 nanómetros. Para determinar la integridad de la bicapa, realice un ensayo FRAP rápido seleccionando una región de interés en la bicapa y registrando algunas imágenes del campo de visión utilizando condiciones de imagen que proporcionen una relación señal/ruido de cinco a uno o más.Pause la grabación y cierre el diafragma de campo del microscopio TIRF para enfocar un rayo láser concentrado en una pequeña región circular de la bicapa para blanquear localmente los fluoróforos. Encienda el láser a su salida máxima para fotoblanquear la pequeña región durante tres a 10 segundos, y luego apague el láser. Vuelva a abrir el diafragma de campo a su radio original, reaajuste la condición de imagen a la configuración previa al blanqueador y reanude inmediatamente la grabación de la recuperación de la señal fluorescente en el campo de visión.Compruebe si la bicapa es fluida y guarde las imágenes como archivos TIF de punto de 16 bits. Mezcle la actina G no marcada y marcada con fluorescencia en una proporción molar de 10 a uno, y rellénela con tampón G para que la concentración de actina G sea de 20 micromolares. Agregue una décima parte de 10 veces el tampón ME a la mezcla para obtener una solución única e incube durante dos minutos a temperatura ambiente.A continuación, descongele el vial de tapado de proteínas rápidamente a 37 grados centígrados, y luego manténgalo en hielo. Diluir con tampones G de tal manera que la concentración de proteína de tapado ahora sea el doble de su concentración final deseada, luego agregue un volumen igual de la solución de proteína de taponado diluida a la mezcla de actina. Finalmente, agregue un volumen igual de tampón objetivo fresco dos veces a la mezcla de reacción.El volumen final de la solución debe ser cuatro veces el volumen de la mezcla de actina. Asegúrese de que la concentración final de los componentes sea como se describe en el texto manuscrito. Incubar las muestras en la oscuridad a 25 grados centígrados durante 45 a 60 minutos para permitir la polimerización.Pipetear suavemente cinco actina polimerizada micromolar con una punta de pipeta de extremo romo y agregarla a un tubo de PCR limpio en autoclave. Agregue un XKMEH al tubo para que el volumen final sea superior a 20 microlitros, y mezcle suavemente para evitar el cizallamiento de la actina F. De la cámara de muestra montada, retire un volumen igual del tampón.Agregue la solución de actina polimerizada a la cámara y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo tres veces sin tocar la bicapa en la parte inferior. Monte la muestra en el microscopio TIRF y déjela reposar durante 20 a 30 minutos. Grabe algunas imágenes de diferentes campos de visión después de que la adición de F-actina haya alcanzado un estado estable.Después de 30 minutos de incubación de actina, vuelva a montar la muestra en el microscopio. Compruebe la señal en la proteína enlazadora y los canales de actina F. Ajuste las condiciones de imagen si es necesario.Seleccione una buena región para una grabación de lapso de tiempo largo. Grabe de 10 a 15 fotogramas a 0,1 a 0,2 hercios antes de la adición de miosina y detenga la grabación. Pipetear el volumen requerido de miosina muscular reciclada dos del vial material con una punta de pipeta roma y añadirlo a un tubo de PCR en autoclave limpio.Agregue inmediatamente un XKMEH al tubo para que el volumen sea superior a 20 microlitros y mezcle suavemente. Retire con cuidado un volumen igual del tampón KMEH de la cámara de muestras montada sin molestarla, y agregue suavemente la solución de miosina a la cámara de muestra. No pipetear hacia arriba y hacia abajo, ya que perturbará los filamentos unidos a la superficie.Reanude inmediatamente la grabación de lapso de tiempo y guarde todas las imágenes, luego tome imágenes de fondo para todos los canales utilizando una muestra de solo búfer. Guarde todas las imágenes como archivos TIF. El valor ajustado del coeficiente de difusión fue de 1,34 micrómetros cuadrados por segundo, lo que concuerda estrechamente con el valor calculado basado en fórmulas de 1,39 micrómetros cuadrados por segundo.El perfil de línea después del fotoblanqueo y el perfil de recuperación de la región blanqueada se ajustan a las ecuaciones cuatro y cinco, respectivamente. La fracción móvil de la bicapa lipídica que representa la fracción de la población blanqueada que se recupera fue mayor que 0,9, lo que indica una buena bicapa lipídica. La actividad de la miosina indujo flujos de actomiosina contráctil que emergieron en estructuras similares a los astros en el estado estacionario, impulsando la agrupación local del componente de membrana acoplada.Se puede utilizar una variedad de técnicas de microscopía, como la microscopía de dispersión interferométrica para estudiar la dinámica de las redes de actomiosina no marcadas sin inducir ningún daño fotográfico, o utilizar la microscopía de fluorescencia de súper resolución. Esta técnica allana el camino para que los investigadores interesados en comprender cómo los complejos de proteínas de membrana interactúan con una red dinámica de actomiosina modulen su arquitectura y composición.

reconstitution-membrane-tethered-minimal-actin-cortices-on-supported

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Describimos un protocolo para la preparación de bicapas lipídicas soportadas y su caracterización utilizando microscopía de fuerza atómica y espectroscopía de fuerza.

Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

A continuación, se presenta un protocolo para detectar eventos individuales, SNARE mediada por liposomas y de fusión entre bicapas soportadas en los canales de microfluidos utilizando TIRFM polarizado, con sensibilidad única molécula y ~ 15 ms tiempo de resolución. Lípidos y liberación de carga solubles se pueden detectar de forma simultánea. tamaño de los liposomas, de difusividad de los lípidos, y poro de fusión propiedades se miden.

La fusión mediada por SNARE de proteoliposomas individual con bicapas soportadas atados en una celda de flujo de microfluidos supervisado por microscopía TIRF polarizada

Este artículo describe un método para evaluar las interacciones y ensamblajes de proteínas integrales de membrana in vitro con varios factores asociados en un entorno proximal de lípidos.

El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal In Vitro

Proporcionamos un protocolo para in vitro ensayos de autoorganización de la mente y la mía en una bicapa lipídica apoyado en una cámara abierta. Además, se describe cómo adjuntar el ensayo en lípido-clad PDMS microcompartments imitar en vivo condiciones de confinamiento de la reacción.

In Vitro Reconstitución de la uno mismo-organización de patrones de proteínas en bicapas lipídicas soportadas

La fusión mitocondrial es una reacción homeostática importante subyacente a la dinámica mitocondrial. Aquí se describe un sistema de reconstitución in vitro para estudiar la fusión de membrana interna mitocondrial que puede resolver el anclaje de membrana, acoplamiento, hemisfusión y apertura de poros. Se discute la versatilidad de este enfoque en la exploración de los sistemas de membrana celular.

Una plataforma de membrana modelo para la reconstitución de la dinámica de membrana mitocondrial

Este protocolo describe la formación de vesículas unilipídicas y multilipídicas que imitan a las células, bicapas lipídicas soportadas y bicapas lipídicas suspendidas. Estos modelos in vitro se pueden adaptar para incorporar una variedad de tipos de lípidos y se pueden utilizar para investigar diversas interacciones de moléculas y macromoléculas.

Ensamblaje de modelos de bicapa lipídica soportada y suspendida de imitación celular para el estudio de interacciones moleculares

Este artículo presenta un método simple para la producción expedita de vesículas unilamelares gigantes con proteínas citoesqueléticas encapsuladas. El método demuestra ser útil para la reconstitución ascendente de estructuras citoesqueléticas en confinamiento e interacciones citoesqueleto-membrana.

Encapsulación rápida del citoesqueleto reconstituido dentro de vesículas unilamelares gigantes

En este manuscrito, demostramos las técnicas experimentales para encapsular el citoesqueleto de actina F en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (también llamadas liposomas), y el método para formar una capa de actina F que imita la corteza en la valva interna de la membrana liposómica.

In vitro Reconstitución del citoesqueleto de actina dentro de vesículas unilamelares gigantes

Este protocolo es una guía para visualizar actina dinámica y microtúbulos utilizando un ensayo de microscopía de fluorescencia interna total (TIRF) in vitro .

Visualización de la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos in vitro mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

La reconstitución libre de células ha sido una herramienta clave para comprender el ensamblaje del citoesqueleto, y el trabajo en la última década ha establecido enfoques para estudiar la dinámica de la septina en sistemas mínimos. Aquí se presentan tres métodos complementarios para observar el ensamblaje de la septina en diferentes contextos de membrana: bicapas planas, soportes esféricos y soportes de varilla.

Reconstitución del ensamblaje de septina en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas

Aquí, presentamos métodos para preparar ensamblajes de actina cuasi-bidimensionales (2D) entrelazados, reticulados y de cristal líquido a partir de proteínas purificadas.

Ajuste de los modos de contractilidad y deformación de ensamblajes activos basados en actina in vitro: de redes activas bidimensionales a gotas de cristal líquido

Aprende a ensamblar redes de actomiosina unidas a membrana en bicapas lipídicas soportadas para estudiar dinámicas citoesqueléticas mediante microscopía avanzada. Este protocolo permite la adición secuencial de proteínas sin perturbar la integridad de la red.

Reconstitución de corticidades mínimas de actina atadas a la membrana en bicapas lipídicas soportadas

Explorar más videos