Demostración de la alineación de secuencias para predecir la susceptibilidad entre especies herramienta para una evaluación rápida de la conservación de proteínas

En el contexto de la seguridad química, el protocolo SeqAPASS proporciona un proceso rápido y simplificado para evaluar la conservación de proteínas en la diversidad de especies, para la extrapolación tanto de la toxicidad como del conocimiento de la vía biológica. SeqAPASS se desarrolló como una interfaz basada en la web simplificada, transparente y fácil de usar para la extrapolación rápida entre especies, destinada tanto para investigadores como para tomadores de decisiones. La herramienta aborda el desafío de extrapolar el conocimiento de toxicidad química utilizando la información disponible sobre la sensibilidad de las especies, para predecir consistentemente la susceptibilidad química de cientos a miles de especies que nunca podrían probarse en un entorno de laboratorio.

Para comenzar a trabajar con la herramienta SeqAPASS, primero, navegue hasta seqapass.epa.gov. Los usuarios existentes pueden seleccionar el botón de inicio de sesión en su cuenta. Los nuevos usuarios pueden crear una cuenta seleccionando el enlace en la página de inicio.

Después de iniciar sesión en la herramienta SeqAPASS, vaya a la pestaña Solicitar ejecución de SeqPASS. SeqAPASS incluye varios recursos útiles para ayudar a los usuarios a identificar un objetivo de proteína de consulta. Se puede acceder a ellos haciendo clic en los botones desplegables debajo de Identificar un objetivo proteico.

Una vez que se identifica un objetivo proteico, haga clic en Por especie o Por accesión en Comparar secuencias de aminoácidos primarios. Por ejemplo, para analizar la conservación del receptor opioide mu, haga clic en Por adhesión e introduzca el número de acceso en el cuadro de acceso de proteínas. A menos que el usuario ya haya identificado una accesión de proteínas, se recomienda la opción de búsqueda de especies.

Seleccione Solicitar ejecución para iniciar la consulta. Una vez que se haya enviado la consulta, seleccione la pestaña Estado de ejecución de SeqAPASS en la parte superior de la página para ver el estado de la ejecución enviada. El tiempo de finalización dependerá del uso actual de la herramienta.

En la pestaña Ver informes de SeqAPASS, se enumeran todas las ejecuciones realizadas en una cuenta determinada. Seleccione Ver informe para ver los datos en el explorador web y haga clic en Solicitar informe seleccionado para abrir la página Consultar información de proteínas de nivel uno y ver los resultados y las opciones de personalización de datos. Para desarrollar y ejecutar un análisis SeqAPASS de nivel dos, evaluando la conservación de dominios proteicos específicos, haga clic en el signo más junto al encabezado de nivel dos en la página Información de proteína de consulta de nivel uno para rellenar el menú de consulta de nivel dos.

Haga clic en el cuadro Seleccionar dominio para rellenar una lista de dominios funcionales para la proteína de consulta. Una vez que se identifica un dominio a partir de la base de datos de dominios conservados de NCBI y se selecciona en la lista desplegable SeqAPASS, inicie la consulta de nivel dos. Esto se hace haciendo clic en el botón Solicitar ejecución de dominio.

Haga clic en Actualizar las ejecuciones de nivel dos y tres para rellenar los datos de nivel dos. En Ver datos de nivel dos, haga clic en el cuadro Seleccionar dominio completado para seleccionar el acceso al dominio completado. A continuación, puede hacer clic en el botón Ver datos de nivel dos para abrir los resultados.

Los datos se muestran en la pestaña Ver SeqAPASS para el nivel seleccionado, primero, veamos los datos de nivel uno. En la página Consultar información de proteínas, seleccione el botón de opción situado junto al informe principal o completo para ver los datos en formato condensado o expandido. Las especies tendrán una predicción de susceptibilidad de sí o no, indicando si la proteína se conserva en relación con la secuencia de consulta.

Dentro del informe, haga clic en la accesión de proteína apropiada o ID de especie para vincular a las bases de datos del NCBI y acceder a más información. Para explorar los datos de toxicidad correspondientes para las especies con predicciones de susceptibilidad, desplácese hasta el lado derecho de la tabla Resultados para ver la columna ECOTOX. Haga clic en los enlaces para abrir la especie en cuestión dentro de la base de conocimiento de ECOTOXicology, donde puede encontrar datos de toxicidad Además de los informes completos y primarios, se puede ver un informe resumido de los datos seleccionando Ver informe resumido de nivel uno.

El informe de resumen muestra métricas de resumen y predicciones de susceptibilidad en todos los grupos taxonómicos. Los datos en cualquier formato de informe se pueden descargar fácilmente. Con el tipo de informe deseado seleccionado, haga clic en Descargar tabla para guardarlo como un archivo de hoja de cálculo.

Para ver los datos de nivel dos, desplácese hasta la parte superior de la pestaña Ver SeqAPASS y seleccione Nivel dos. Los datos de SeqAPASS de nivel dos se muestran en informes como el del nivel uno, y también están disponibles en la parte inferior de la página Consultar información de proteínas. Seleccione el botón de opción junto al tipo de informe deseado para ver los datos.

Los informes de nivel dos muestran información similar a la del nivel uno, con información adicional sobre el dominio de la proteína. Los datos de SeqAPASS se pueden visualizar fácilmente para facilitar la interpretación. Haga clic en el signo más junto a Visualización, seguido del botón Visualizar datos, para abrir un Diagrama de cuadro interactivo en una pestaña nueva.

En la nueva pestaña, seleccione el botón BoxPlot. En la parte superior de la página Diagrama de caja, las opciones de control pueden ayudar al usuario a personalizar el gráfico. Los usuarios pueden agregar o eliminar grupos taxonómicos del gráfico, pueden seleccionar especies que se mostrarán en una leyenda, elegir cómo se muestran los nombres de las especies y resaltar subconjuntos de especies específicas, como especies amenazadas o en peligro de extinción.

Las visualizaciones se pueden exportar y guardar fácilmente. Haga clic en Descargar BoxPlot para seleccionar un tipo de archivo y descargar la figura. Antes de la descarga, los usuarios pueden personalizar la resolución del tipo de archivo de la imagen.

Aunque la configuración predeterminada del informe es suficiente para la mayoría de los análisis, los parámetros se pueden cambiar utilizando los submenús en la parte superior del menú Consultar información de proteínas. Para registrar la configuración actual del informe, haga clic en el botón Descargar configuración actual del informe para descargar un archivo que capture la configuración actual aplicada. Esto se puede hacer para el nivel uno y el nivel dos.

Aquí el ejemplo es para el nivel uno. Para iniciar un análisis SeqAPASS de nivel tres, vaya a la página Información de proteína de consulta de nivel uno y haga clic en el signo más junto al encabezado de nivel tres para rellenar el menú de consulta de nivel tres que permite comparaciones individuales de residuos de aminoácidos. Antes de que se pueda realizar un análisis de nivel tres, se deben identificar residuos de aminoácidos específicos a través de una revisión de la literatura existente.

Haga clic en el signo más situado junto al Explorador de referencias para abrir la herramienta Explorador de referencias. Esto puede ayudarle a generar una cadena booleana predefinida para consultar la literatura disponible. Haga clic en Generar enlace de Google Académico para generar una cadena de búsqueda de literatura.

Esto puede copiarse y usarse para buscar en las bases de datos bibliográficas deseadas. O bien, al seleccionar Buscar en Google Académico, se buscará automáticamente en la literatura de Google Académico utilizando la cadena de búsqueda predefinida. Una vez que se han seleccionado los residuos de aminoácidos, los usuarios pueden configurar un análisis de nivel tres.

Seleccione la secuencia de plantilla con la que se alinearán y compararán las especies seleccionadas por el usuario. Opcionalmente, se pueden introducir secuencias de plantilla adicionales en el cuadro Comparaciones adicionales. Antes de alinear secuencias específicas, los usuarios deben introducir un nombre de ejecución definido por el usuario.

Esto se utilizará para identificar la ejecución. Seleccione el grupo taxonómico en el cuadro Elegir grupo taxonómico. Cabe señalar que este proceso se repetirá para todos los grupos taxonómicos para los cuales el usuario desee evaluar para su conservación.

Una vez seleccionadas todas las especies deseadas para alinearlas con la secuencia de plantillas, seleccione Solicitar ejecución de residuos. Una vez alineadas todas las especies, haga clic en Actualizar las ejecuciones de nivel dos y tres para rellenar el menú Seleccionar nombre de ejecución de nivel tres con los trabajos de nivel tres completados. Los datos de nivel tres se pueden ver por grupo taxonómico individual o en múltiples grupos taxonómicos.

Haga clic en Combinar datos de nivel tres para abrir el cuadro de diálogo combinado de nivel tres y analizar varios grupos taxonómicos juntos al mismo tiempo. Mediante el cuadro de diálogo Combinar informes de nivel tres, seleccione la plantilla de nivel tres que desea utilizar como base para la comparación. A continuación, elija qué trabajos completados desea comparar.

Solicite trabajos de nivel tres como desee y haga clic en Ver datos de nivel tres para generar una página de informe de nivel tres. En la página Información de proteína de plantilla de nivel tres, se muestran las posiciones de aminoácidos previamente identificadas de la secuencia de la plantilla y se pueden seleccionar para la alineación. Introduzca posiciones en el cuadro de texto separadas por comas o, alternativamente, seleccione en la lista de residuos.

Una vez introducidas todas las posiciones, seleccione Copiar a la lista de residuos para trasladar los residuos al cuadro de selección. Una vez que se hayan seleccionado todas las posiciones de aminoácidos y se haya comprobado su exactitud, haga clic en Actualizar informe para actualizar las secuencias alineadas con las posiciones especificadas. Desplácese hasta la parte inferior de la página para ver un informe de los resultados.

Al igual que los niveles anteriores, seleccione el botón de opción junto al informe principal o completo para seleccionar el tipo de informe. Los informes de nivel tres muestran especies y proteínas similares, e incluyen información de alineación y conservación para cada residuo de aminoácido evaluado. Para guardar el informe, haga clic en Descargar tabla en la parte inferior del informe y guárdelo como un archivo de hoja de cálculo.

Los usuarios también pueden seleccionar Ver informe de resumen de nivel tres para ver y descargar una tabla de informe de resumen. Para ver una visualización de datos de nivel tres, haga clic en el signo más situado junto al encabezado de visualización y seleccione Visualizar datos para abrir una nueva página. Haga clic en Mapa de calor en la página de información de visualización para abrir el gráfico interactivo y los controles.

En la página de visualización, en Controles, seleccione los grupos taxonómicos que se mostrarán en el mapa de calor, transplácelos con el botón de flecha y vuelva a ordenarlos si lo desea. De forma predeterminada, la visualización del mapa de calor muestra el nombre común de la especie, las predicciones generales de susceptibilidad y el estado de coincidencia de cada residuo de aminoácido. Las opciones para manipular la configuración del mapa de calor se encuentran en los menús expandibles bajo el encabezado Control.

En Opciones de informe, se puede seleccionar un informe simple o completo, y las especies mostradas se pueden alternar entre nombres comunes o científicos. En Selecciones opcionales, se pueden seleccionar y resaltar en el mapa de calor subconjuntos de especies, como candidatos ortológicos, especies amenazadas, especies en peligro de extinción y organismos modelo comunes. En Configuración del mapa de calor, la información que se muestra en el mapa de calor se puede personalizar, desmarcando y marcando las casillas.

Se pueden eliminar las predicciones de susceptibilidad y el texto de susceptibilidad, y se pueden eliminar las alineaciones de aminoácidos y la información de aminoácidos. Para guardar la visualización del mapa de calor, haga clic en Descargar mapa de calor y elija el tipo de archivo deseado. SeqAPASS presenta un informe de resumen de decisiones, que permite a los usuarios evaluar rápidamente las predicciones de susceptibilidad en todos los niveles y especies simultáneamente.

Al hacer clic en Push Level to DS Report (Nivel de inserción en el informe DS) desde las páginas Resultados o Visualización de datos, se transferirán los datos a la ficha DS Report, donde se pueden combinar y mostrar todos los niveles de análisis. Los resultados del análisis de nivel uno para el receptor opioide mu muestran un límite de susceptibilidad del 55% con similitudes porcentuales para mamíferos, aves, reptiles, anfibios y la mayoría de las especies de peces que caen por encima de este límite, y reciben una predicción de susceptibilidad de Sí. Esas casillas completamente por debajo del límite reciben una predicción de susceptibilidad de un no.

El análisis de nivel dos para el dominio funcional opioide mu identificó un límite de susceptibilidad más alto del 88% de similitud con mamíferos, aves, reptiles, anfibios y la mayoría de las especies de peces por encima de este límite, proporcionando otra línea de evidencia para la conservación, o el receptor opioide mu a través de vertebrados. Dentro del análisis de nivel tres, todas las especies evaluadas dieron como resultado una predicción de susceptibilidad de sí. Como estos aminoácidos son importantes en la unión tanto de agonistas fuertes de receptores opioides mu como de antagonistas fuertes, estos datos sugieren que los compuestos opioides dirigidos a los receptores humanos pueden interactuar de manera similar con los receptores en todas las especies de vertebrados.

El nivel tres de SeqAPASS es útil para la generación de hipótesis. Incluso si los residuos de aminoácidos críticos no se conocen para la proteína de interés, la herramienta se puede utilizar para mirar a través de las especies e identificar dónde existe la conservación, o está menos conservada. Estas hipótesis se pueden probar con técnicas de biología molecular, como los estudios de mutagénesis dirigida al sitio.

El enfoque inicial de SeqAPASS fue en objetivos químicos. Sin embargo, nuestra investigación se está expandiendo para explorar enzimas metabolizadoras primarias, proteínas de transporte, así como proteínas involucradas en la bioacumulación.