Name: Adipocitos diferenciados de ratón en cultivo primario: un modelo de resistencia a la insulina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprende a aislar y diferenciar adipocitos primarios de ratón para estudiar resistencia a la insulina mediante análisis de Western blot. Este modelo permite evaluar señalización metabólica en células maduras.

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Agradecemos a Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla y María Antonieta Carbajo por su asistencia técnica, y a Jessica González Norris por editar críticamente el manuscrito. Este protocolo fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (a Y.M.).

Todos los experimentos con roedores fueron aprobados por el Comité de Bioética del Instituto de Neurobiología de la UNAM, protocolo número 075.
1. Aislamiento de células precursoras de adipocitos de ratón
<ol><li>Eutanasia de ratones machos C57BL/6 de 8-10 semanas de edad (por ejemplo, por inhalación de CO2 y posterior luxación cervical) (cuatro animales por aislamiento). Desinfectar los ratones frotando con etanol al 70% y obtener el tejido adiposo inmediatamente después del sacrificio. NOTA: Después de la eutanasia de roedores, aísle el tejido adiposo inmediatamente y realice todos los pasos dentro de una campana de flujo laminar estéril. Los ratones se mantienen bajo ciclos de luz/oscuridad de 12 h con acceso gratuito a alimentos y agua.</li>
	<li>Diseccionar el tejido adiposo subcutáneo inguinal de cada ratón. Retire solo el tejido adiposo, evitando la eliminación de músculo, piel o cualquier otro tejido, y recójalo en un tubo cónico de 50 ml que contenga 15 ml de solución de colagenasa tipo 1 (1.5 mg / ml) en hielo. Disuelva la colagenasa tipo 1 en la albúmina sérica bovina (BSA) de alta glucosa Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco y filtre a través de filtros de jeringa de 0,2 μm.</li>
	<li>Cortar el tejido adiposo en trozos pequeños con tijeras quirúrgicas estériles y digerir las muestras por incubación con solución de colagenasa tipo 1 a 37 °C en un agitador orbital (150 rpm) durante 30 min (colocar el tubo que contiene grasa y colagenasa en posición horizontal para una mayor superficie de agitación). Compruebe la digestión cada 10 minutos para asegurarse de que funciona (la degradación del tejido es visible) y para evitar la sobredigestión (véase la figura suplementaria S1).</li>
	<li>Filtrar con una jeringa de malla de 200 μm (previamente esterilizada en autoclave) para eliminar el tejido no digerido con colagenasa. Pase el filtro sobre el borde del tubo para drenar tantas células como sea posible en la solución. Añadir 15 ml de DMEM-1% BSA frío para detener la digestión y centrifugar a 400 × g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspirar la capa superior que contiene adipocitos maduros y la mayor parte de la capa líquida; Evite tocar o molestar el pellet. Agregue 20 ml de suero bovino fetal tamponado con fosfato frío (PBS)-2% y vuelva a suspender el pellet. Centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Retire el sobrenadante, aspirando primero la capa superior para eliminar los adipocitos y la grasa restantes. Resuspender el pellet en 1 ml de tampón de lisado de cloruro de amonio potásico (ACK) (para lisar glóbulos rojos) e incubar en hielo durante 5 min. Añadir 10 ml de PBS-2% FBS, mezclar y centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 μL de solución anti-Fc (rata purificada anti-ratón CD16/CD32 diluida en PBS-2% FBS [1:150]) para reducir la unión mediada por el receptor Fc por anticuerpos de interés. Incubar en hielo durante 5 min. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 5 ml que encaje en los bastidores preenfriados de un separador magnético de celdas y centrífuga a 400 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Eliminar el sobrenadante, añadir 200 μL de la mezcla de CD31(PECAM-1) anticuerpo monoclonal (390)-biotina (1:100) y anticuerpo monoclonal CD45 (30-F11)-biotina (1:100), mezclar bien e incubar en hielo durante 15 min (preparar diluciones de anticuerpos en solución anti-Fc; ver Tabla 1). Añadir 400 μL de PBS-2% FBS y centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C. NOTA: CD31 y CD45 son marcadores de células endoteliales y células hematopoyéticas, respectivamente.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante e incubar en 100 μL de microperlas antibiotina (1:5) durante 15 min en hielo (preparar diluciones de anticuerpos en solución anti-Fc, ver Tabla 1). Añadir 400 μL de PBS-2% FBS y centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 350 μL de PBS-2% FBS. Eliminar agregados celulares o partículas grandes de las suspensiones unicelulares con un filtro de preseparación (70 μm). Primero, active el filtro con 100 μL de PBS-2% FBS, pase la suspensión celular a través del filtro (recoja en un tubo limpio) y finalmente lave el filtro con 100 μL de PBS-2% FBS.</li>
	<li>Realice la separación magnética de las células utilizando la estrategia de separación negativa con un separador magnético de células.<ol><li>Coloque la muestra en la posición A de la rejilla frigorífica (asegúrese de que la rejilla esté preenfriada) y dos tubos vacíos en la posición B y C para recuperar las celdas no etiquetadas y etiquetadas, respectivamente.</li>
		<li>Cargue el tampón de lavado y el tampón de ejecución en las botellas correspondientes antes de encender el equipo. Programar el equipo para realizar la separación magnética de celdas con el protocolo DEPLETE . NOTA: Este protocolo es para el agotamiento en modo estándar para la eliminación de células con expresión normal de antígeno (en este caso, células marcadas con anti-CD31 y anti-CD45), si la recuperación es la prioridad más alta.</li>
		<li>En la sección de separación , seleccione el número de muestras que desea separar y seleccione el protocolo DEPLETE . Presione Ejecutar e inicie la separación. Al final del programa, recuperar las células no marcadas y centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 μL de medio de cultivo (Tabla 1).</li>
	<li>Sembrar los APC en un pocillo de una placa de 12 pocillos previamente recubierta con una matriz de membrana basal al 2,5% (se obtienen aproximadamente 50.000-75.000 células). Agregue 400 μL de matriz de membrana basal al 2,5% para cubrir toda la superficie de cada pozo. Inmediatamente después de retirar el exceso de solución y dejar solo una pequeña capa, deje secar la placa (sin tapa) dentro de la campana de flujo laminar durante al menos 1 h. Incubar a 37 °C en una atmósfera deCO2 al 5%. Cambiar el medio cada 48 h hasta que las células alcancen el 80% de confluencia.</li>
	<li>Al 80% de confluencia, retirar el medio por completo y lavar con 350 μL de PBS-2% FBS. Cosechar las células con 350 μL de tripsina-EDTA al 0,05% durante 2 min a 37 °C. Agregue 2 ml de medio de crecimiento y recoja las células en un nuevo tubo cónico de 50 ml, luego centrifugar a 400 × g durante 5 min.</li>
	<li>Paso de los APC a placas de 12 pocillos (10.000-20.000 células por pozo) previamente recubiertas con una matriz de membrana basal al 2,5%. Incubar a 37 °C con 5% deCO2. Cambiar el medio cada 48 h hasta que las células alcancen el 80% de confluencia. NOTA: Los APC se pueden pasar una vez. Posteriormente, pierden su capacidad de proliferar y diferenciarse. Consulte el flujo de trabajo para el proceso de aislamiento de APC en la figura complementaria S2.</li>
</ol>2. Diferenciación de adipocitos e inducción de resistencia a la insulina
NOTA: Mantener las células a 37 °C enCO2 al 5% y realizar pasos que impliquen cambio de medio y tratamientos con TNF-α e insulina dentro de una campana estéril.
<ol><li>Al 80% de confluencia, comienza el proceso de diferenciación; aspirar cualquier medio de crecimiento y reemplazarlo con 500 μL de medio de diferenciación (Tabla 1) que contenga 3,3 nM de proteína morfogenética ósea (BMP4) en cada pocillo.</li>
	<li>Después de 48 h, reemplazar el medio con el medio de diferenciación (500 μL por pocillo) y el cóctel de diferenciación (Tabla 1).</li>
	<li>Retirar el medio 72 h más tarde y añadir 100 nM de insulina en 500 μL de medio de diferenciación fresco. NOTA: Las células comienzan a mostrar una apariencia redonda con pequeñas gotas de lípidos en el interior.</li>
	<li>Aspirar cualquier medio de diferenciación y reemplazarlo con 500 μL de medio simple-2% FBS (Tabla 1) 48 h después. Inducir resistencia a la insulina con 4 ng/mL de TNF-α. Incluir pozos de control sin tratamiento con TNF-α.</li>
	<li>Después de 24 h de incubación, agregar 4 ng/mL de TNF-α en FBS simple al 0% (Tabla 1). Mantener los pocillos de control sin tratamiento con TNF-α.</li>
	<li>Activar la vía de señalización de la insulina 24 h después añadiendo insulina 100 nM e incubar durante 15 min a 37 °C en una atmósfera deCO2 al 5%. Retirar el medio y lavar con 500 μL de PBS. Incluir pozos de control sin tratamiento con insulina.</li>
</ol>3. Evaluación de la vía de señalización de la insulina por Western blot
<ol><li>Extracción y cuantificación de proteínas<ol><li>Lave cada pocillo de células con 500 μL de PBS y manténgalo en hielo para lisar las células en 50 μL de tampón RIPA (Tabla 1) que contiene un cóctel inhibidor de la proteasa al 1% agregado justo antes del aislamiento de la muestra. Raspa toda la superficie del pozo con una punta y transfiere el lisado a un tubo de microcentrífuga de 0,6 ml (mantener en hielo).</li>
		<li>Incubar durante 1 h a 4 °C en una coctelera giratoria, mezclar por vórtice y centrifugar a 8.000 × g durante 15 min a 4 °C y recuperar el sobrenadante (mantener en hielo).</li>
		<li>Determine la concentración de proteína utilizando el ensayo de Bradford (no diluya la muestra para cuantificar).</li>
		<li>Tomar el volumen necesario correspondiente a 40-60 μg y desnaturalizar con 6x tampón Laemmli (Tabla 1) incubando a 97 °C durante 15 min mientras agita a 550 rpm. Congelar hasta su uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS<ol><li>Realizar electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) con un gel de poliacrilamida al 7,5% de 1,5 mm de espesor. Inserte el gel en el tanque y llénelo con el tampón de corriente (Tabla 1).</li>
		<li>Agregue 3 μL de proteína estándar preteñida al primer pocillo del gel y cargue cada muestra en los pocillos posteriores.</li>
		<li>Ejecute el gel a 80 V durante aproximadamente 15 minutos para asegurarse de que la muestra entre en la matriz de gel del concentrador de poliacrilamida. A partir de entonces, aumente el voltaje a 90 V durante 2,5 h o hasta que se pueda ver el marcador de peso molecular de 37 kDa en el borde inferior del gel.</li>
		<li>Transfiera las proteínas del gel a una membrana de nitrocelulosa en una cámara semiseca durante 35 minutos a 25 V. De antemano, sumerja el gel, la membrana y los filtros en el tampón de transferencia (Tabla 1) durante unos minutos.</li>
	</ol></li>
	<li>Western blot<ol><li>Después de la transferencia, lavar la membrana con solución salina tamponada con Tris (TBS) que contiene 0,1% de Tween 20 (TBS-T 0,1%) (Tabla 1) durante 3 min con agitación a 30 rpm.</li>
		<li>Bloquear la membrana con solución de bloqueo (Tabla 1) a 4 °C durante 1 h en rotación constante.</li>
		<li>Cortar la membrana en tres partes según el marcador de peso molecular para incubar durante la noche con diferentes anticuerpos primarios (diluidos en solución de bloqueo) a 4 °C en rotación constante: anticuerpo Phospho-IRS1 (Tyr608) (1:1.000), banda esperada a 180 kDa; Receptor de fosfoinsulina β (Tyr1150/1151) anticuerpo (1:1.000), banda esperada a 95 kDa; Anticuerpo Phospho-Akt (Ser473) (1:1.000), banda esperada a 60 kDa.</li>
		<li>Lave las membranas 5 veces durante 5 minutos cada una con TBS-T 0.1%.</li>
		<li>Incubar las membranas con el correspondiente anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa (diluido en solución de bloqueo) durante 2 h a temperatura ambiente en rotación constante: peroxidasa affiniPure burro anti-conejo IgG (H+L) (1:5.000).</li>
		<li>Lave las membranas 5 veces durante 5 minutos cada una con TBS-T 0.1%.</li>
		<li>Detectar las proteínas mediante el sistema de detección de quimioluminiscencia. Prepare el sustrato de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Coloque la mancha en una bolsa de plástico y agregue 200 μL de sustrato quimioluminiscente para cubrir completamente la membrana. Drene el exceso de sustrato y elimine las burbujas de aire.</li>
		<li>Exponga cada mancha durante 30-60 s en un sistema de imágenes de alto rendimiento compatible con quimioluminiscencia.</li>
		<li>Pelar las membranas (pasos 10-13 de la sección Western blot) para romper las interacciones anticuerpo-antígeno y así permitir que las membranas de nitrocelulosa se vuelvan a borrar. Recuperar las membranas y lavar 3 veces durante 5 min cada una con TBS-T 1% a 50 rpm.</li>
		<li>Incubar durante 7 min con 10 mL de NaOH 0,2 M a 50 rpm.</li>
		<li>Lave 3 veces durante 5 minutos cada una con agua del grifo a 50 rpm.</li>
		<li>Lavar durante 10 min con TBS-T 1% a 50 rpm.</li>
		<li>Repita los pasos 2-9 de la sección Western blot para incubar la membrana con tubulina anti-beta (55 kDa) como control de carga utilizando dilución 1:1.000.</li>
		<li>Realice análisis densitométrico25 para cada proteína utilizando el software ImageJ (https://imagej.nih.gov/).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Este artículo proporciona un método para estudiar la resistencia a la insulina que utiliza adipocitos primarios en cultivo tratado con TNF-α. Este modelo tiene la ventaja de que los adipocitos primarios pueden ser cultivados bajo condiciones definidas durante largos períodos de tiempo con un estricto control de los factores ambientales celulares26. La duración del ensayo es de 15-20 días, aunque pueden ocurrir variaciones en el porcentaje de adipocitos diferenciados entre experimentos. Los adipoci...

La insulina es una hormona anabólica producida por las células β de los islotes pancreáticos y el regulador clave del metabolismo de la glucosa y los lípidos. Entre sus múltiples funciones, la insulina regula la captación de glucosa, la síntesis de glucógeno, la gluconeogénesis, la síntesis de proteínas, la lipogénesis y la lipólisis1. La señal molecular inicial después de la interacción de la insulina con su receptor (IR) es la activación de la actividad intrínseca de la proteína tirosina quinasa de IR2, lo que resulta en su autofosforilación3 y la posterior activación de una familia de proteínas conocidas como sustratos receptores de insulina (IRS), que se une a proteínas adaptadoras que conducen a la activación de una cascada de proteínas quinasas4 . La insulina activa dos vías principales de señalización: fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K)-proteína quinasa B (AKT) y proteína quinasa activada por mitógenos Ras (MAPK). El primero constituye un importante punto de ramificación o nodo 4,5 para la activación de numerosos efectores aguas abajo implicados en diversas funciones fisiológicas, incluida la regulación de la homeostasis del combustible, mientras que el segundo regula el crecimiento y la diferenciación celular 4,6. Las acciones de la insulina dependen en última instancia del tipo de célula y del contexto fisiológico7.
Uno de los principales tejidos metabólicos sensibles a la insulina es el tejido adiposo. El tejido adiposo blanco es el tipo de grasa más abundante en humanos y roedores, distribuida dentro de la grasa subcutánea (entre la piel y los músculos) y la grasa visceral (alrededor de los órganos de la cavidad abdominal). Dado su gran volumen, los adipocitos o células grasas son el tipo de célula más abundante en el tejido adiposo. Estas células grasas pueden ser marrones/beige (termogénicas), rosadas (en la glándula mamaria) y blancas 8,9. Los adipocitos blancos mantienen las principales reservas de energía en el cuerpo en forma de triglicéridos, un proceso dependiente de la insulina. La insulina promueve el transporte de glucosa y la lipogénesis, mientras que inhibe la lipólisis o la descomposición lipídica 7,10. También facilita la diferenciación de los preadipocitos en adipocitos, las células maduras que almacenan grasa11.
La resistencia a la insulina ocurre cuando un nivel normal de insulina produce una respuesta biológica atenuada, resultando en hiperinsulinemia compensatoria12. La resistencia a la insulina es una condición asociada al sobrepeso y la obesidad5, que cuando se combina conduce a la diabetes tipo 2 (DT2) y otras enfermedades metabólicas13. La hiperinsulinemia compensa la resistencia a la insulina en los tejidos periféricos para mantener niveles normales de glucosa en sangre14. Sin embargo, la eventual pérdida o agotamiento de β células, junto con la resistencia exacerbada a la insulina, conduce a niveles elevados de glucosa en sangre consistentes con DT25. Por lo tanto, la resistencia a la insulina y la hiperinsulinemia pueden contribuir para el desarrollo de enfermedades metabólicas derivadas de la obesidad15. Además, la obesidad puede causar inflamación local crónica de bajo grado que promueve la resistencia a la insulina en el tejido adiposo15,16,17. Además, las alteraciones derivadas de la obesidad en el tejido adiposo, como la fibrosis, la inflamación y la reducción de la angiogénesis y la adipogénesis, conducen a niveles séricos más bajos de adiponectina (un sensibilizador a la insulina) y al aumento de la secreción de factores como el inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI-1), ácidos grasos libres y exosomas en el torrente sanguíneo, exacerbando la resistencia a la insulina17.
Muchos aspectos subyacentes a la resistencia a la insulina siguen siendo desconocidos. Se han desarrollado modelos in vitro e in vivo para estudiar los mecanismos que median la resistencia a la insulina en los principales tejidos diana, incluido el tejido adiposo. La ventaja de los modelos in vitro es que los investigadores tienen más control de las condiciones ambientales y pueden evaluar la resistencia a la insulina en tipos específicos de células. En particular, las células precursoras de adipocitos (APC) tienen el fenotipo individual del tejido del donante, que podría reflejar la fisiología mejor que las líneas celulares de adipocitos. Un factor principal que induce la resistencia a la insulina in vitro es el factor de necrosis tumoral α (TNF-α). El TNF-α es una citocina proinflamatoria secretada por adipocitos y macrófagos en el tejido adiposo18. Si bien es necesario para la correcta remodelación y expansión del tejido adiposo19, la exposición a largo plazo al TNF-α induce resistencia a la insulina en el tejido adiposo in vivo y en los adipocitos in vitro20. El tratamiento crónico con TNF-α de varios tipos de células conduce a un aumento de la fosforilación de serina tanto de IR como de IRS-1, promoviendo así la disminución de la fosforilación de tirosina21. El aumento de la fosforilación de IRS-1 en los residuos de serina inhibe la actividad de la tirosina quinasa IR y puede ser uno de los mecanismos clave por los cuales el tratamiento crónico con TNF-α perjudica la acción de la insulina22,23. El TNF-α activa vías que involucran el inhibidor de la serina/treonina quinasa del factor nuclear ĸB quinasa β (IKKβ) y la quinasa terminal c-Jun N (JNK)24. JNK induce un complejo programa transcripcional proinflamatorio, pero también fosforila directamente IRS-16.
Comprender la patogénesis de la resistencia a la insulina se ha vuelto cada vez más importante para guiar el desarrollo de futuras terapias contra la DT2. Las APC han demostrado ser un excelente modelo para el estudio de la biología de las células grasas, incluida la sensibilidad y la resistencia a la insulina, y para identificar las propiedades intrínsecas de los adipocitos independientemente del entorno sistémico. Las APC pueden obtenerse fácilmente de diferentes depósitos adiposos y, en las condiciones adecuadas, diferenciarse en adipocitos maduros. Con este método, se pueden evaluar los efectos directos sobre la resistencia/sensibilidad a la insulina en los adipocitos.

<table><tbody><tr><td><fuerte>1. Aislamiento de células precursoras de adipocitos de ratón</</td>tampón de lisado fuerte><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACK&nbsp;</td><td>LONZA</td><td>10-548E Microperlas</td><td></td></tr><tr><td>anti-biotina&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31</td><td>eBioscience</td><td>13-0311-85</td><td></td></tr><tr><td>Separador AutoMACS Pro</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal (matrigel)</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>Factor de crecimiento</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Equitech-Bio, Inc.</td><td>BAC63-1000</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Anticuerpo monoclonal (30-F11) - Biotina&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>13-0451-85</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo 1</td><td>Worthington Biochem</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>DMEM baja glucosa</td><td>GIBCO</td><td>31600-034</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Factor de crecimiento</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>ITS mix</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico 2-fosfato</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>Millipore</td><td></td><td>ESG1107 Factor de crecimiento</td></tr><tr><td>Ácido linoleico-albúmina</td><td>Sigma</td><td>L9530</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 201 medio</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-2</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>315-18 Factor de</td><td>crecimiento</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>BioWest</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de Pre-Separación (70 &micro; m)</td> <td>Miltenyi</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Rata purificada Anti-Ratón CD16 / CD32 &nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>2. Diferenciación de adipocitos e inducción de resistencia a la insulina</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina [IBMX]</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td>Cóctel de diferenciación</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>5020-BP-010 Cóctel de</td><td>diferenciación</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td>Cóctel de diferenciación</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazona</td><td>Cayman</td><td>71742</td><td>Cóctel de diferenciación</td></tr><tr><td>TNF&alpha;</td><td>R& D Sistemas</td><td>210-TA-005&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>3. Evaluación de la vía de señalización de la insulina mediante western blot</anticuerpo anti-beta</td> tubulina fuerte Abcam ab6046 Azul >de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bromofenol</td><td>BioRad</td><td>161-0404</td><td>Tampón Laemmli Tampón</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>Tampón RIPA</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td>Tampón RIPA</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Sistema FluorChem E <td></td></tr><tr><td></td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>Tampón Laemmli</td></tr><tr><td>Tampón de Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td>Tampón de Funcionamiento y Transferencia</td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td>Tampón RIPA</td></tr><tr><td>2- mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>Tampón Laemmli</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>JT Baker</td><td>907007</td><td>Tampón</td></tr> <tr><td>de transferenciaNaCl</td><td>JT Baker</td><td>3624-05</td><td>TBS-T</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>77F-0379</td><td>Tampón</td></tr><tr><td>RIPA NaOH&nbsp;</td><td>JT Baker</td><td>3722-19</td><td></td></tr><tr><td>Na4P2O7</td><td>Sigma</td><td>114F-0762</td><td>Tampón RIPA</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td>Tampón RIPA</td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Leche en polvo descremada</td><td>BioRad</td><td>1706404</td><td>solución bloqueante</td></tr><tr><td>Estándar de proteína preteñida&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610395</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8340-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidasa AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H + L) &nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-035-132</td><td></td></tr><tr><td>Receptor de fosfo-insulina y beta; &nbsp;</td><td>Señalización celular</td><td>3024</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Phospho-Akt (Ser473)</td><td>Señalización celular</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Phospho-IRS1 (Tyr608)</td><td>Millipore</td><td>9432</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa&nbsp;</td><td>Tampón JT Baker</td><td>407205</td><td>RIPA</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad</td><td>1610302</td><td>Tampón de funcionamiento y laemmli</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS Sustrato quimioluminiscente</td><td>Thermo Scientific</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>Tampón de funcionamiento, transferencia y laemmli</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>TJ Baker</td><td>4103-02</td><td>Tampón RIPA - TBS</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>TBS-T</td></tr></tbody></table>

adipocitos diferenciados de ratón en cultivo primario: un modelo de resistencia a la insulina

Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance

La resistencia a la insulina es un efecto reducido de la insulina en sus células diana, generalmente derivado de la disminución de la señalización del receptor de insulina. La resistencia a la insulina contribuye al desarrollo de diabetes tipo 2 (DT2) y otras enfermedades derivadas de la obesidad de alta prevalencia en todo el mundo. Por lo tanto, comprender los mecanismos subyacentes a la resistencia a la insulina es de gran relevancia. Se han utilizado varios modelos para estudiar la resistencia a la insulina tanto in vivo como in vitro; Los adipocitos primarios representan una opción atractiva para estudiar los mecanismos de resistencia a la insulina e identificar moléculas que contrarresten esta condición y las dianas moleculares de los fármacos sensibilizantes a la insulina. Aquí, hemos establecido un modelo de resistencia a la insulina utilizando adipocitos primarios en cultivo tratados con factor de necrosis tumoral α (TNF-α).
Las células precursoras de adipocitos (APC), aisladas del tejido adiposo subcutáneo de ratón digerido por colagenasa mediante tecnología de separación celular magnética, se diferencian en adipocitos primarios. La resistencia a la insulina es inducida por el tratamiento con TNF-α, una citoquina proinflamatoria que reduce la fosforilación / activación de la tirosina de los miembros de la cascada de señalización de insulina. La disminución de la fosforilación del receptor de insulina (IR), el sustrato del receptor de insulina (IRS-1) y la proteína quinasa B (AKT) se cuantifican mediante Western blot. Este método proporciona una excelente herramienta para estudiar los mecanismos que median la resistencia a la insulina en el tejido adiposo.

En los últimos años, el aumento de la prevalencia de obesidad y DT2 ha impulsado una intensa búsqueda de los mecanismos que median la resistencia a la insulina en el tejido adiposo. Con el protocolo descrito aquí, las APC se pueden diferenciar en adipocitos maduros para evaluar la resistencia y sensibilidad a la insulina. Una vez que las APC alcanzan la confluencia, se necesitan 10 días para completar su diferenciación en adipocitos maduros y su inducción mediada por TNF-α de resistencia a la insulina (<strong class="xfi...

Este protocolo describe el aislamiento de preadipocitos de ratón de la grasa subcutánea, su diferenciación en adipocitos maduros y la inducción de resistencia a la insulina. La acción de la insulina se evalúa mediante la fosforilación/activación de los miembros de la vía de señalización de la insulina a través del western blot. Este método permite la determinación directa de la resistencia/sensibilidad a la insulina en adipocitos primarios.

Adipocitos diferenciados de ratón en cultivo primario: un modelo de resistencia a la insulina

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance ...

La resistencia a la insulina se puede evaluar en adipocitos primarios, lo que permite el estudio de donantes en diferentes contextos fisiopatológicos, como magros versus obesos, o células de diferentes depósitos de grasa. Los adipocitos primarios conservan muchas de sus propiedades intrínsecas y pueden cultivarse en condiciones definidas durante un largo período de tiempo, con un estricto control de los factores ambientales celulares. Para iniciar el proceso de diferenciación, las células deben estar al 80% de confluencia.Si la diferenciación comienza en una confluencia menor o mayor, las células se diferenciarán menos o perderán su capacidad de diferenciación. Después de sacrificar al animal, desinfecte a los ratones frotando con etanol al 70%. Diseccionar el tejido adiposo subcutáneo inguinal de cada ratón y recogerlo en un tubo cónico de 15 mililitros, que contiene 15 mililitros de solución de colagenasa tipo uno en hielo.Cortar el tejido adiposo en trozos pequeños con tijeras quirúrgicas estériles y digerir las muestras por incubación con solución de colagenasa tipo uno a 37 grados centígrados en un agitador orbital a 150 RPM durante 30 minutos. Revise la digestión cada 10 minutos para asegurarse de que funciona y para evitar la digestión excesiva. Filtre con una jeringa de malla de 200 micrómetros para eliminar el tejido no digerido con colagenasa y pase el filtro sobre el borde del tubo para drenar tantas células como sea posible en la solución.Agregue 15 mililitros de DMEM frío 1% BSA para detener la digestión y centrifugar a 400 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Aspirar la capa superior que contiene adipocitos maduros y la mayor parte de la capa líquida. Agregue 20 mililitros de PBS 2% FBS frío y vuelva a suspender el pellet.Después de centrifugar nuevamente durante cinco minutos, retire el sobrenadante aspirando la capa superior para eliminar los adipocitos y la grasa restantes. Resuspender el pellet en un mililitro de tampón de lisado ACK. Incubar en hielo durante cinco minutos.Agregue 10 mililitros de PBS 2%FBS y mezcle. Después de centrifugar durante cinco minutos y aspirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de solución anti-FC. Incubar en hielo durante cinco minutos y transferir la suspensión celular a un tubo de cinco mililitros que encaja en los bastidores preenfriados de un separador de celdas magnéticas.Después de centrifugar durante cinco minutos y eliminar el sobrenadante, agregue 200 microlitros de la mezcla de biotina de anticuerpos monoclonales CD 31 y biotina de anticuerpos monoclonales CD 45. Mezclar bien e incubar en hielo durante 15 minutos. Luego agregue 400 microlitros de PBS 2% FBS y centrifugar nuevamente a 400 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Aspirar el sobrenadante e incubarlo en 100 microlitros de microperlas antibiotina durante 15 minutos en hielo. Agregue 400 microlitros de PBS 2% FBS y centrifugar nuevamente a 400 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, como se mostró anteriormente. Después de desechar el sobrenadante, resuspender el pellet en 350 microlitros de PBS 2% FBS.Para eliminar los agregados celulares, o partículas grandes, de las suspensiones de células individuales con un filtro de preseparación de 70 micrómetros, active el filtro con 100 microlitros de PBS 2% FBS. Pase la suspensión celular a través del filtro y recójala en un tubo limpio. Luego lave el filtro con 100 microlitros de PBS 2% FBS.Para realizar la separación magnética de las células utilizando la estrategia de separación negativa, coloque la muestra en la posición A de la rejilla refrigerada y dos tubos vacíos en las posiciones B y C para recuperar las células no marcadas y etiquetadas. Luego cargue el tampón de lavado y el tampón de ejecución en las botellas correspondientes. En la sección de separación, seleccione el número de muestras que desea separar y seleccione el protocolo de agotamiento.Presione ejecutar e inicie la separación. Al final del programa, recupere las celdas no etiquetadas. A continuación, cubra una placa de 12 pocillos con una matriz de membrana basal agregando 400 microlitros de matriz de membrana basal al 2,5% para cubrir toda la superficie de cada pozo.Retire el exceso de solución y deje que la placa se seque dentro de la campana de flujo laminar durante al menos una hora. Después de centrifugar durante cinco minutos y desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de medio de crecimiento. Sembrar las células precursoras de adipocitos, o APC, en un pocillo de la placa de 12 pocillos previamente recubierta con una matriz de membrana basal al 2,5%.Incubar a 37 grados centígrados en una atmósfera de dióxido de carbono al 5%, y cambiar el medio cada 48 horas hasta que las células alcancen el 80% de confluencia. Después de eliminar el medio por completo, lave las células con 350 microlitros de PBS 2% FBS. Cosechar las células con 350 microlitros de 0,05% tripen EDTA durante dos minutos a 37 grados centígrados, y añadir dos mililitros de medio de crecimiento.Recoja las células en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y centrifugar a 400 G durante cinco minutos. Pasar los APC a placas de 12 pocillos, previamente recubiertas con una matriz de membrana basal al 2,5%, e incubar a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Cambiar el medio cada 48 horas hasta que las células alcancen el 80% de confluencia.Al 80% de confluencia, aspirar cualquier medio de crecimiento y reemplazarlo con 500 microlitros de medio de diferenciación, que contiene 3,3 nanomolares de proteína morfogenética ósea en cada pocillo. Después de 48 horas, reemplace el medio con 500 microlitros por medio de diferenciación de pozo, y el cóctel de diferenciación. Retirar el medio 72 horas después y añadir 100 nanomolares de insulina en 500 microlitros de medio de diferenciación fresco.48 horas después, inducir resistencia a la insulina con cuatro nanogramos por mililitro de factor de necrosis tumoral alfa, o TNF alfa. Aspirar cualquier medio de diferenciación y sustituirlo por 500 microlitros de medio simple 2% FBS con TNF alfa. Después de incubar durante 24 horas, agregue cuatro nanogramos por mililitro de TNF alfa en un medio simple 0% FBS.Active la vía de señalización de la insulina 24 horas después agregando 100 nanomolares de insulina e incube durante 15 minutos a 37 grados centígrados en una atmósfera de dióxido de carbono al 5%, como se mostró anteriormente. Después de la incubación, retire el medio y lave con 500 microlitros de PBS, incluya un pozo de control sin el tratamiento con insulina. Extraer proteínas y medir la fosforilación de marcadores de señalización de insulina mediante Western blot.En esta figura se muestran células precursoras de adipocitos subcutáneos al 80% de confluencia antes de inducir la diferenciación en las placas de cultivo de 12 pocillos, y adipocitos primarios después de siete días de diferenciación inductora. La resistencia a la insulina inducida por TNF alfa en adipocitos primarios subcutáneos se demostró por la disminución de la fosforilación inducida por insulina del receptor de insulina, el sustrato del receptor de insulina uno y la proteína quinasa B o AKT. La membrana se probó con receptor de insulina antifosforilada, sustrato de receptor de insulina antifosforilada uno, AKT antifosforilada y se utilizó tubulina antibeta como control de carga.La señal se visualizó con detección de quimioluminiscencia. Aquí se muestran las manchas representativas y la cuantificación de tres experimentos independientes. Al intentar este procedimiento, una cosa que debe tenerse en cuenta es que la inducción de resistencia a la insulina con TNF alfa es con 2% FBS durante 24 horas y con 0% FBS durante las últimas 24 horas.

differentiated-mouse-adipocytes-primary-culture-model-insulin

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este vídeo demuestra la diferenciación de las células estromales de la médula ósea (BMSC) en adipocitos. En el proceso de dos pasos, en presencia de factores de crecimiento y hormonas específicas, las BMSC indiferenciadas primero se diferencian en preadipocitos. El segundo paso, que implica el tratamiento con glucosa e insulina, conduce a la formación de adipocitos maduros con múltiples gotas de lípidos.

Diferenciación in vitro de células estromales de médula ósea de ratón en adipocitos

Preadipocitos primarios blancas aisladas de tejidos adiposos blancos en ratones se pueden diferenciar en células beige / brite. Se presenta aquí un sistema fiable modelo celular para estudiar la regulación molecular de "color" de la grasa blanca.

Aislamiento y diferenciación de las células del estroma vascular a células Beige / Brite

El cultivo agregado de adipocitos maduros de membrana (MAAC) es un nuevo método para el cultivo de adipocitos humanos maduros. Aquí detallamos cómo aislar adipocitos de adiposo humano y cómo configurar MAAC.

Aislamiento y cultivo de adipocitos maduros humanos utilizando cultivos agregados de adipocitos maduros de membrana (MAAC)

Aquí se presenta un protocolo para administrar oligonucleótidos como ARN de interferencia pequeña (siRNA), imitadores de microARN (miR) o anti-micro-ARN (anti-miR) en adipocitos maduros para modular la expresión de proteínas y microARN.

Un modelo de cultivo celular de adipocitos para estudiar el impacto de la modulación de proteínas y microARN en la función de los adipocitos

Este informe describe un protocolo para el aislamiento simultáneo de preadipocytes marrones y blancos primarios de ratones recién nacidos. Las células aisladas se pueden cultivar en cultivo e inducir a diferenciarse en adipocitos blancos y marrones completamente maduros. El método permite la caracterización genética, molecular y funcional de las células de grasa primarias en cultivo.

Aislamiento Y Diferenciación De Preadipocitos Blancos Y Marrones Primarios De Ratones Recién Nacidos

Los preadipocitos se aíslan de la fracción vascular estromal del tejido adiposo marrón interescapular de ratones recién nacidos y se diferencian en células que acumulan gotas de lípidos, expresan marcadores moleculares y muestran la morfología mitocondrial de los adipocitos marrones maduros. Estas células se analizan posteriormente mediante inmunofluorescencia y microscopía electrónica de transmisión.

Diferenciación e imagen de adipocitos marrones de la fracción vascular estromal de tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos

Este protocolo describe el aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y lograr la diferenciación de los adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de la colagenasa reduce la variación experimental y aumenta la reproducibilidad.

Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

El tamaño y la fragilidad de los adipocitos maduros han limitado las técnicas y herramientas disponibles para su estudio y aislamiento. En este trabajo se describe un protocolo para el aislamiento de adipocitos murinos maduros, que puede adaptarse fácilmente a diferentes depósitos de adiposo y dietas de ratones.

Aislamiento y cultivo de adipocitos murinos primarios de ratones delgados y obesos

Este procedimiento describe un método para el aislamiento y la cultura del órgano de Corti murino con o sin el limbo espiral y las neuronas del ganglio espiral. También demostramos un método para la expresión de un gen reportero exógenos en el órgano de Corti explante de la electroporación.

Cultura primaria y electroporación plásmido del órgano de Corti murino.

Ortotópico modelos animales de cáncer de ovario reproducir mejor las enfermedades humanas y por lo tanto, mejorar nuestra comprensión de la progresión del cáncer y la respuesta del tumor a la terapia. Un modelo de ratón recibe una inyección intrabursal de luciferasa que expresan las células tumorales de ovario. El tratamiento se administra a través de una sonda nasogástrica. El crecimiento del tumor está controlado...

En vivo de imágenes y tratamientos terapéuticos en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario

Aprende a aislar y diferenciar adipocitos primarios de ratón para estudiar resistencia a la insulina mediante análisis de Western blot. Este modelo permite evaluar señalización metabólica en células maduras.

Adipocitos diferenciados de ratón en cultivo primario: un modelo de resistencia a la insulina

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