Fabricación y caracterización de la nanomatriz base Janus capa por capa para promover la regeneración del cartílago
6 de julio de 2022
Este protocolo describe el ensamblaje de un andamio de nanomatriz de base Janus (JBNm) capa por capa agregando nanotubos de base Janus (JBNts), matrilina-3 y factor de crecimiento transformante beta-1 (TGF-β1) secuencialmente. El JBNm fue fabricado y caracterizado; Además, mostró una excelente bioactividad, fomentando funciones celulares como la adhesión, proliferación y diferenciación.
Este protocolo muestra cómo ensamblamos y caracterizamos el JBNm capa por capa a nivel molecular. JBNm encapsula TGF-B1 y evita su liberación en el tejido circundante, promoviendo así la condrogénesis localizada. La formación del JBNm está estandarizada, lo que permite formar diferentes JBNms para futuras aplicaciones.
La estructura única capa por capa permite la encapsulación del factor de crecimiento, creando una liberación localizada constante, que evita la hipertrofia y mantiene el crecimiento. JBNm proporciona un microambiente homeostático para la regeneración del tejido del cartílago, dentro de un lugar confinado, debido a su inyectabilidad, que se puede utilizar para diferentes escenarios, como fracturas o cavidades de forma irregular. Para comenzar, agregue ocho microlitros de un miligramo por mililitro TGF-B1, suspendido en agua a 32 microlitros de un miligramo por mililitro Matrilin-3 suspendido en agua.
Pipeta para asegurar la mezcla adecuada de estas proteínas. Añadir 80 microlitros de un miligramo por mililitro. Nanotubos de base Janus, o JBNts suspendidos en agua, a la solución TGF-B1, Matrilin-3.
Pipetear repetidamente para asegurar una mezcla adecuada. Para el grupo JBNt, agregue cinco microlitros de un miligramo por mililitro, JBNts a 50 microlitros de agua para hacer una solución de 90.9 microgramos por mililitro. Para el grupo Matrilin-3, agregue 40 microlitros de 10 microgramos por mililitro Matrilin-3 a 15 microlitros de agua, para hacer una solución de 7.3 microgramos por mililitro.
Para el grupo TGF-B1, agregue 10 microlitros de 10 microgramos por mililitro, de TGF-B1 a 45 microlitros de agua, para hacer una solución de 1.8 microgramos por mililitro. Para el grupo Janus Base Nano-Matrix o JBNm, agregue 40 microlitros de 10 microgramos por mililitro, Matrilin-3 a 10 microlitros de 10 microgramos por mililitro TGF-B1. Agitar para asegurar una mezcla adecuada.
Luego, agregue cinco microlitros de un miligramo por mililitro JBNts a la solución, pipeteando repetidamente para mezclar la muestra. Usando un espectrofotómetro, medir el espectro de absorción de cada grupo. Etiquete el TGF-B1 utilizando un kit de etiquetado de proteínas, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Agregue 20 microlitros de 20 microgramos por mililitro, etiquetados como TGF-B1, a 25 microlitros de agua, para hacer una solución de prueba de 8.9 microgramos por mililitro. Etiquete el Matrilin-3 utilizando un kit de etiquetado separado. Agregue 20 microlitros de 80 microgramos por mililitro etiquetados como Matrilin-3 a 25 microlitros de agua, para hacer una solución de prueba de 36 microgramos por mililitro.
Mezcle 20 microlitros de 80 microgramos por mililitro marcados como Matrilin-3 con 20 microlitros de 20 microgramos por mililitro marcados como TGF-B1, y cinco microlitros de agua, lo que resulta en un compuesto etiquetado TGF-B1, Matrilin-3. Pipetear la mezcla varias veces para mezclar. Agregue cinco microlitros de un miligramo por mililitro JBNts a 40 microlitros de agua, lo que resulta en una solución de 111 microgramos por mililitro.
Luego agregue cinco microlitros de un miligramo por mililitro JBNts a la solución etiquetada de TGF-B1, Matrilin-3, y pipete repetidamente para mezclar el compuesto. Transfiera cada grupo de muestra al pozo de una placa de pocillo negro 384. Cargue la placa en un lector de microplacas multimodo y tome medidas en longitudes de onda de excitación de 488 y 555 nanómetros siguiendo los protocolos del fabricante.
En condiciones fisiológicas, el espectro de potencial zeta de Matrilin-3 se cargó negativamente debido a su punto isoeléctrico. Después de la adición del TGF-B1 a la Matrilina-3, el potencial zeta del compuesto TGF-B1 Matrilina-3 aumentó a un valor casi neutro. El potencial zeta de JBNm fue el más alto entre los tres grupos.
Los espectros de absorción UV visibles confirmaron la formación de la estructura interior jerárquica capa por capa del JBNm, los anillos aromáticos de las cadenas laterales de lisina, y los JBNts contribuyeron a los picos de absorción, a 220 y 280 nanómetros respectivamente. Se utilizó TEM para caracterizar la morfología de los JBNts y JBNm. Después de combinarse con proteínas, se observaron haces gruesos de JBNm formando una estructura de andamio.
La microscopía de fluorescencia confirmó la presencia de la estructura capa por capa, y demostró la sección transversal del JBNm. Después de etiquetar, el fluorescente rojo Matrilin-3 envolvió los haces JBNt y formó la capa externa del JBNm, mientras que el TGF-B1 fluorescente verde formó una capa interna. La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia mostró picos de emisión a 520 nanómetros para los grupos TGF-B1 marcados y 570 nanómetros para los grupos Matrilin-3.
Se exploró el efecto de JBNm en la adhesión y proliferación celular de HMSC. El JBNm mostró HMSC agrupados junto con él, mientras que menos células se adhirieron a JBNts. La alineación de las células y el tamaño de las células en el JBNm demostraron que los JBNts desempeñaron un papel en la adhesión celular, mientras que las proteínas aumentaron la afinidad de la adhesión celular.
Después del primer día de cultivo celular, los grupos JBNm y TGF-B1 mostraron una proliferación celular significativa en comparación con los otros grupos. Cuando la duración de la estructura celular se incrementó a tres y cinco días, los grupos JBNm y TGF-B1 demostraron una proliferación celular aún mayor. Al etiquetar fluorescentemente el JBNm, es importante que el TGF-B1 y el Matrilin-3 se etiqueten individualmente y se mezclen antes de agregar los JBNts, para permitir la formación adecuada de la estructura capa por capa.
Una evaluación adicional del andamio puede proporcionar una comprensión de cómo son efectivos en los tratamientos terapéuticos. Más específicamente, un ensayo de proliferación de alto rendimiento, puede determinar la dosis óptima in vitro, y más tarde in vivo. Esta nueva creación de NanoMatriX permite a los investigadores utilizar un andamio inyectable basado en nanomateriales para regenerar el cartílago.
Este enfoque de imitación poli permite una androgénesis mejorada y la proliferación del contrasitio.
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Descripción general
Este protocolo demuestra el ensamblaje y la caracterización de un andamiaje nano-matriz Janus de capas sucesivas (JBNm). La JBNm encapsula TGF-β1, promoviendo la condrogénesis localizada y proporcionando un microambiente homeostático para la regeneración del tejido cartilaginoso.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biomateriales
- Ingeniería de tejidos
- Medicina regenerativa
Antecedentes
- Los nanotubos de base Janus (JBNts) se utilizan en el ensamblaje de andamios.
- El TGF-β1 es crucial para promover las funciones celulares.
- La estructura de JBNm permite la liberación controlada de factores de crecimiento.
- La inyectabilidad de JBNm posibilita su aplicación en defectos de forma irregular.
Objetivo del estudio
- Crear un andamio que soporte la regeneración del tejido cartilaginoso.
- Normalizar la formación de JBNm para diversas aplicaciones.
- Encapsular factores de crecimiento para una liberación sostenida y evitar la hipertrofia.
Métodos Utilizados
- Adición secuencial de TGF-β1 y Matrilina-3 para formar JBNm.
- Caracterización del andamio a nivel molecular.
- Evaluación de la bioactividad relacionada con la adhesión y proliferación celular.
- Evaluación de la inyectabilidad del andamio para aplicaciones prácticas.
Resultados principales
- El JBNm exhibió una excelente bioactividad, promoviendo las funciones celulares.
- Se logró la liberación localizada de TGF-β1, mejorando la condrogénesis.
- El andamiaje mantuvo un entorno homeostático para la regeneración del tejido.
- La formación estandarizada permite aplicaciones versátiles en ingeniería de tejidos.
Conclusiones
- El andamio de JBNm por capas sucesivas es eficaz para la regeneración del cartílago.
- La encapsulación de factores de crecimiento es beneficiosa para la reparación localizada del tejido.
- Este método puede adaptarse a diversos escenarios clínicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La nano-matriz base Janus capa por capa (JBNm) permite la localización precisa de factores de crecimiento y el control sostenido del microentorno, abordando un desafío clave en medicina regenerativa e ingeniería de tejidos. Esta plataforma brinda confianza predictiva en la selección de biomateriales en etapas tempranas y reduce los riesgos en el avance traslacional al minimizar efectos fuera del blanco e hipertrofia. Su ensamblaje estandarizado y su inyectabilidad la posicionan como una capacidad reutilizable para diversos modelos preclínicos de reparación del cartílago.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite el análisis de la condrogénesis mediada por factores de crecimiento en microentornos controlados.
- Apoya la desactivación mecanicista de riesgos mediante el aislamiento de los efectos de TGF-β1 dentro de andamios confinados.
- Facilita la validación funcional de las interacciones entre biomateriales y proteínas para la regeneración tisular.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona un andamio estandarizado y reproducible para ensayos cuantitativos de adhesión y proliferación celular.
- Permite la evaluación de alto rendimiento de la composición del andamio y la encapsulación de factores de crecimiento.
- Ofrece resultados consistentes y cuantificables para la evaluación comparativa de candidatos de biomateriales.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad al favorecer la regeneración localizada del cartílago in vitro e in vivo.
- Mantiene la continuidad traslacional mediante andamios inyectables y adaptables para defectos irregulares.
- Reduce el riesgo de hipertrofia y efectos fuera del blanco, lo que apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
La plataforma JBNm integra desde el descubrimiento temprano hasta la validación preclínica, permitiendo la comprobación de hipótesis, el desarrollo de ensayos y la investigación traslacional en flujos de trabajo de reparación del cartílago.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la evaluación basada en hipótesis de los efectos de los factores de crecimiento en microentornos diseñados.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles para la adhesión y proliferación celular.
- Análisis: Permite mediciones de UV-Vis, fluorescencia y potencial zeta para la caracterización del andamiaje.
- Investigación Traducional: Facilita la continuidad desde la selección in vitro hasta modelos de regeneración del cartílago in vivo.
- Reutilización Empresarial: El ensamblaje estandarizado permite la adaptación en diversos programas de biomateriales e ingeniería de tejidos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la regeneración tisular mediada por andamiajes y en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Proporciona protocolos estandarizados y escalables para la fabricación y análisis reproducibles de andamiajes.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de continuar o no continuar al minimizar los efectos fuera del objetivo de los factores de crecimiento.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos de biomateriales para las líneas de desarrollo en medicina regenerativa.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en ensamblaje de biomateriales, marcado de proteínas y técnicas de caracterización de andamios.
- Necesita acceso a infraestructura de espectrofotometría, microscopía de fluorescencia y microscopía electrónica de transmisión (TEM).
- Exige estandarización entre equipos para la preparación y análisis reproducible de andamios.
- Es adaptable a diversos sistemas modelo, pero puede requerir optimización para objetivos tisulares específicos.
- Las limitaciones prácticas incluyen el control preciso de las proporciones de los componentes y la eficiencia del marcado.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Fabrication of the Janus Base Nano-Matrix (JBNm), Composed of Janus Base Nanotube (JBNt)/Matn1/Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1)
1:41
Observation of Specimens with Ultraviolet-Visible (UV-Vis) Spectroscopy
3:12
Absorption Spectra Measurement of Fluorescent-Labeled Proteins
5:08
Results: Layer-By-Layer Assembly of Janus Base Nano-Matrix Structure Scaffold for a Cartilage Tissue Construct
8:01
Conclusion
