Name: Detección y cuantificación de nanotubos de túnel utilizando imágenes de vista de volumen 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Aprende a detectar y cuantificar nanotubos de túnel mediante imágenes de vista de volumen 3D. Este método manual permite identificar estructuras de F-actin que conectan células vecinas en modelos de enfermedades neurodegenerativas y cáncer.

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D.K.V y A.R agradecen a la Academia Manipal de Educación Superior por la beca TMA Pai. Agradecemos a la Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería de la India por SERB-SRG (#SRG/2021/001315), así como al Consejo Indio de Investigación Médica de la India (# 5/4-5 / Ad-hoc / Neuro / 216 / 2020-NCD-I) y al fondo intramuros de la Academia Manipal de Educación Superior, Manipal, India. Agradecemos a la instalación confocal de JNCASR (Centro Jawaharlal Nehru para la Investigación Científica Avanzada, India) y a B. Suma por la microscopía confocal en JNCASR.

NOTA: Las células SH-SY5Y cultivadas en medios DMEM/F-12 se diferenciaron con ácido retinoico 10 μM durante 7 días y se trataron con oligómeros oAβ de 1 μM durante 2 h a 37 °C (5% deCO2). Después del tratamiento, las células se fijaron con la solución fijadora de Karnovsky y se inmunotiñeron dos veces con el anticuerpo fosfo-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) y faloidina de unión a actina F. Más tarde, se tomaron imágenes confocales de la pila z utilizando un microscopio de barrido láser confocal. Los TNT se cuantificaron mediante conteo manual y se distinguieron de otras protuberancias neuritas / células mediante la construcción de imágenes de vista de volumen 3D e identificando las estructuras a partir de su característica de flotar entre dos células sin tocar el sustrato (Figura 1).
1. Cultivo celular y diferenciación
<ol><li>Cultivar las células neuronales SH-SY5Y en medios DMEM/F12 (Ham) 1:1 con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de mezcla de penicilina-estreptomicina-neomicina (PSN). Siembra las células en un plato de imágenes de 35 mm con un pozo de 14 mm compuesto por un cubreobjetos # 1.5 en el centro del plato unido a la parte inferior. Siembra las células en la placa de imagen a una concentración de 12.000 células/cm2 y realiza los experimentos a una confluencia del 60%-70%.</li>
	<li>Diferenciar parcialmente las células con ácido retinoico (AR) de 10 μM de una solución madre de 100 mM (5 mg de AR en 15 ml de dimetilsulfóxido [DMSO]). Luego, incubar las células durante 7 días a 37 °C (5%CO2) para diferenciarlas con cambio de medios cada 2 días. NOTA: Tenga cuidado al mantener la confluencia (60%-70%) de las células (tanto células indiferenciadas como parcialmente diferenciadas). La densidad celular puede influir en la formación de TNT entre las células.</li>
</ol>2. Preparación de oligómeros de amiloide-β1-42 (oAβ) para tratar células neuronales
<ol><li>Disolver Aβ 1-42 (1 mg) en 200 μL de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol y dividir la solución en 20 alícuotas, cada una de las cuales contiene 0,05 mg de péptidos. Liofilizar y almacenar las alícuotas a −20 °C para su uso posterior.</li>
	<li>Preparar la solución madre (5 mM) del Aβ 1-42 liofilizado en DMSO añadiendo 2,2 μL de DMSO a 0,05 mg de péptido liofilizado. Para disolver cuidadosamente los péptidos, vortex la solución y sonicar durante 2 minutos en un sonicador de baño de agua.</li>
	<li>Diluir la solución madre a una concentración de 100 μM en DMEM, pH 7.4, y vórtice para convertir los péptidos en monómeros, seguido de la incubación a 4 °C durante 24 h para obtener oligómeros de Aβ 1-42 (oAβ)12,21,22. </li>
	<li>Caracterizar oAβ antes de los experimentos como se informó anteriormente21,22 por imágenes de microscopía electrónica de transmisión.</li>
	<li>Tratar las células SH-SY5Y parcialmente diferenciadas con 1 μM oAβ. Retire el medio antes de los tratamientos y agregue DMEM fresco libre de FBS. Después del cambio de medio, añadir oAβ previamente preparado (100 μM) al medio hasta una concentración final de 1 μM. Incubar las células con 1 μM oAβ durante 2 h a 37 °C (5% CO2). Incluir un control negativo en forma de células no tratadas.</li>
</ol>3. Inmunotinción de F-actina y activado-PAK1 para la caracterización de TNTs
<ol><li>Realizar inmunotinción diferencial mediante el uso de anticuerpos fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) y faloidina falotoxina fijadora a actina F.</li>
	<li>Lave las células de control y tratadas con oAβ con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 2 x 2 min antes de la fijación. Preparar la solución fijadora de Karnovsky utilizando fijador de formalina al 2% y glutaraldehído al 2,5% disuelto en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,2. Luego, fije las células en la placa de imágenes agregando la solución fijadora de Karnovsky (lo suficiente para cubrir las células) durante 45 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave las celdas fijas 2 x 2 min usando tampón de incubación. Preparar el tampón de incubación (20x) disolviendo 0,1 g de saponina en 5 mL de FBS y diluir a 1x añadiendo 95 mL de 1x PBS.</li>
	<li>Después de la fijación, añadir el primer anticuerpo contra phopho-PAK1 a una dilución de 1:250 en el tampón de incubación e incubar durante la noche a 4 °C en una cámara húmeda oscura.</li>
	<li>Al día siguiente, después de 24 h de incubación, lavar las células 2 x 2 min con el tampón de incubación; luego, agregue el anticuerpo secundario conjugado a Alexa Fluor 488 (dilución 1: 1,000) y faloidina 555 (dilución 1: 1,000). Incubar las células en la cámara húmeda oscura durante 1,5 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Después de la incubación, lavar las celdas 2 x 2 min con tampón de incubación. Manchar el núcleo añadiendo 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en una dilución 1:2.000 e incubar durante 5 min a 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Prepare el medio de montaje DABCO utilizando 25 mg de DABCO en 90% de glicerol y 10% 1x PBS. Para disolver correctamente, ajuste el pH a 8.6 usando grado espectrofotométrico, diluya HCl (diluido 1:20 con agua) y mantenga la solución en un balancín para mezclar.</li>
	<li>Como agente antiblanqueador, agregue el medio de montaje DABCO directamente sobre la placa de imagen que contiene el cubreobjetos en la parte inferior. Espere al menos 1-2 h y proceda directamente a realizar imágenes confocales. NOTA: No se requieren adhesivos para fijar los cubreobjetos.</li>
</ol>4. Inmunotinción de F-actina y tubulina β-III para distinguir los TNT de las neuritas
<ol><li>Realizar inmunotinción diferencial con el anticuerpo de tubulina β-III y la faloidina falotoxina fijadora a actina F.</li>
	<li>Lave las células tratadas con oAβ 2x con 1x PBS antes de agregar la solución fijadora de Karnovsky. Incubar las celdas durante 45 min a temperatura ambiente y lavar las celdas 2 x 2 min con tampón de incubación.</li>
	<li>Después de la fijación, añadir el anticuerpo contra la tubulina β-III (TUBb3) a una dilución de 1:250 en el tampón de incubación e incubar a 4 °C durante la noche en la cámara húmeda oscura.</li>
	<li>Al día siguiente, lave las células con tampón de incubación (2 x 2 min) y agregue el anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 (dilución 1: 1,000) y Phalloidin 555 (dilución 1: 1,000) juntos al mismo plato. Luego, incubar las células durante 1,5 h a temperatura ambiente en la cámara húmeda oscura.</li>
	<li>Lave las células 2 veces con tampón de incubación y agregue DAPI de tinción nuclear en una dilución 1: 2,000 durante 5-10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Agregue el agente antiblanqueador DABCO en el medio de montaje como se mencionó anteriormente y espere 2 horas antes de obtener imágenes.</li>
</ol>5. Imagen con microscopía confocal
<ol><li>Para identificar TNT, capture imágenes z-stack de células inmunoteñidas utilizando un microscopio de barrido láser confocal. Tome las imágenes utilizando el objetivo DIC de aceite 40x / 1.40 con DAPI, isotiocianato de fluoresceína (FITC) y conjuntos de filtros de tetrametilrodamina (TRITC).</li>
	<li>Primero, seleccione los canales haciendo clic secuencialmente en los láseres requeridos en las ventanas Track 1, Track 2 y Track 3 en el software confocal. Haga clic en la opción T-PMT debajo de la ventana Pista 1 para tomar las imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC) con canales de fluorescencia. NOTA: Las imágenes DIC son capturadas por un detector diferente etiquetado como T-PMT.</li>
	<li>Seleccione la pestaña de adquisición del software, haga clic en la pestaña Z-stack y espere a que se abra una ventana. Luego, haga clic en escaneo en vivo para enfocar las celdas en la parte inferior del plato. Seleccione esa imagen enfocada como la primera pila. Luego, concéntrese hacia arriba para ver la parte superior de la celda y selecciónela como la última pila. Detenga el escaneo en vivo y haga clic en el número junto a la pestaña óptima para corregir el tamaño del paso de las pilas. El tamaño del paso determina el número de cortes y los intervalos en función del grosor de las celdas. NOTA: El tamaño del paso se seleccionará en función del muestreo de Nyquist para tomar suficientes cortes y garantizar que no haya espacios entre las dos pilas. El muestreo de Nyquist se determina sobre la base del objetivo y las longitudes de onda de las luces23.</li>
	<li>Tome imágenes secuenciales de tres canales de DAPI, FITC y TRITC con láseres de 405 nm, 488 nm y 561 nm y capture con un tiempo de permanencia de píxeles de 1,02 μs. Capture imágenes en el canal DIC con canales de fluorescencia para observar el límite celular.</li>
	<li>Captura una pila de imágenes con las dimensiones de x: 224,92 μm e y: 224,92 μm, con cada píxel de 220 nm 2 de tamaño y escala z de 415 nm.</li>
	<li>Tome imágenes capturando varias pilas z (15-22 pilas) desde la parte inferior hasta la parte superior de las celdas. Adquiera al menos 10 imágenes del campo aleatorio de la placa de cultivo para obtener un total de ~ 200-300 células.</li>
	<li>Analice las imágenes capturadas sin conexión para identificar los TNT mediante el análisis de vista de volumen 3D</li>
</ol>6. Análisis de imágenes confocales z-stack para identificar y cuantificar TNTs
<ol><li>Abra las imágenes confocales guardadas en formato de datos .czi en el software Fiji para su análisis.</li>
	<li>Seleccione la opción Hyperstack para ver cada z-stack y canal de la imagen. Busque las hiperpilas de las pilas z y los canales, que se abren en una sola ventana, como se muestra en la Figura 2. Desplácese por las barras de desplazamiento del canal (indicado por flechas rojas y verdes) y la pila z (indicada por flechas azules) para seleccionar la pila exacta de un canal de interés en particular. NOTA: En las celdas fijas, como los TNT flotantes o los conductos de membrana permanecen por encima de la superficie, las estructuras no son visibles en las partes inferiores de las pilas z. Sin embargo, en las células fijas, las neuritas se encuentran en la superficie y son detectables en las partes inferiores de las pilas z (z = 0 a 2). Consulte la figura 2 para conocer los pasos de identificación.</li>
	<li>Como se muestra en la Figura 2, seleccione primero el canal teñido con actina F (indicado con flechas rojas) desplazándose por la barra de canales. Luego, desplácese manualmente por las pilas z (indicadas por flechas azules) para ver cada pila una por una. Identifique las estructuras teñidas con actina F que parecen estar conectando células, son visibles en las partes inferiores de las pilas z y están cerca de la superficie de la placa de imágenes (z = 2) como neuritas (indicadas por flechas blancas). NOTA: La mayoría de las neuritas son fáciles de identificar, ya que aparecen como protuberancias extendidas (indicadas por flechas rosas).</li>
	<li>Identifique los TNT, los conductos de célula a celda positivos para la actina F, desplazándose por las pilas z hacia la parte superior (de z = 4 en la Figura 2; indicado por flechas amarillas). Busque neuritas cerca de las partes inferiores de las pilas z hacia la superficie y observe que comienzan a desaparecer con el desplazamiento de las pilas z hacia la parte superior (en z = 6 en la Figura 2; las neuritas no son claramente visibles).</li>
	<li>Identifique los TNT fosfo-PAK1 positivos de manera similar a los TNT positivos para la actina F analizando la naturaleza flotante de los conductos de las pilas z. Como la tinción de fosfo-PAK1 es más débil que la tinción de actina F, busque TNT teñidos con fosfo-PAK1 en z = 4 (apenas visible) y en z = 6 (prominente).</li>
	<li>Además, observe las imágenes DIC para verificar que las estructuras TNT teñidas con F-actina y fosfo-PAK1 son conductos de membrana entre las células (Figura 3). Además, fusionar los canales F-actina (rojo) y fosfo-PAK1 (verde) para verificar que los TNT identificados son estructuras co-teñidas con F-actina y fosfo-PAK1 (Figura 3).</li>
	<li>Para cuantificar los TNT, cuente los números totales de celdas y los TNT identificados manualmente y represente los números como porcentajes.</li>
	<li>Para distinguir los TNT positivos para la actina F y los conductos flotantes positivos para la tubulina β-III (TUBb3) y similares al TNT de las imágenes de pila z, combine los canales F-actina (rojo) y TUBb3 (verde) (Figura 4). Luego, analice las pilas z de las imágenes combinadas.<ol><li>Busque TNT teñidos exclusivamente con actina F que sean apenas visibles en z = 3 y prominentes en z = 6 y z = 9 (flechas amarillas). Del mismo modo, identifique conductos flotantes tipo TNT doblemente positivos con actina F y tubulina β-III (TUBb3) en z = 6 y z = 9 (flechas cian). Identifique otras protuberancias no flotantes teñidas con actina F y β-III de las partes inferiores de las pilas z (flechas blancas).</li>
	</ol></li>
	<li>Mida el diámetro de los TNT utilizando la herramienta de línea en Fiji. Verifique la escala de medición haciendo clic en Analizar | Establezca Escala para que la "distancia en píxeles" se establezca automáticamente a partir de las imágenes .czi. Mida los diámetros de los TNT en el plano xy. NOTA: La mayoría de los diámetros están entre 1 píxel y 4 píxeles (es decir, 220-880 nm); Cada píxel es de 220 nm. Consulte la figura 5 para obtener un resumen del protocolo para el análisis de imágenes confocales z-stack.</li>
</ol>7.3D reconstrucción de imágenes z-stack para caracterizar TNTs
<ol><li>Utilice el complemento de visor de volumen en Fiji, que permite la resegmentación 3D y la visualización 3D habilitada para umbrales (Figura 6).</li>
	<li>Divida las imágenes z-stack en canales individuales. Luego, recorte las imágenes de pila z de un solo canal (canal F-actina) para usar la vista de reconstrucción 3D para resaltar uno o dos TNT o neuritas a la vez. Habilite el complemento de vista de volumen para visualizar las vistas xy, yz y xz.</li>
	<li>Ancle un solo TNT o neurita en el plano xy (las flechas blancas representan neuritas en la Figura 6A; las flechas amarillas representan TNT en la Figura 6B) y marque las secciones transversales de los ejes xz (rojo) e yz (verde). Observe las neuritas en la parte inferior del plano xz en los planos xz e yz (flechas blancas, Figura 6A) y los TNT en las pilas z superiores (flechas amarillas, Figura 6B).</li>
	<li>Seleccione el TNT o neurita individual para reconstruir la vista de volumen 3D en el plano xz (Figura 6C, D). En la reconstrucción 3D, observe las neuritas en la parte inferior del plano z (flechas blancas, Figura 6C) y los TNT que aparecen como estructuras flotantes que conectan dos células sin tocar el plano z inferior (flechas amarillas, Figura 6D).</li>
</ol>

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<li>Haimovich, G., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+mRNA+transfer+between+mammalian+cells+in+coculture+by+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization+%28smFISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH).</a> Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).</li>
<li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+in+investigative+and+toxicologic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology.</a> Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).</li>
<li>Qin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+paraformaldehyde+and+glutaraldehyde+is+a+potential+fixative+for+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria.</a> Biomolecules. 11 (5), 711(2021).</li>
<li>Graham, R. C., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histochemical+demonstration+of+monoamine+oxidase+activity+by+coupled+peroxidatic+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).</li>
</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

Varios investigadores en las últimas 2 décadas han estado tratando de entender y caracterizar la estructura de TNTs18. La falta de marcadores específicos dificulta el progreso, y existe una creciente demanda de un método conveniente y estandarizado que se pueda utilizar para identificar, caracterizar y cuantificar los TNT. Los TNT se definen como conductos de membrana basados en actina F que flotan entre dos células. Los estudios han demostrado que las neuritas en desarrollo β positivas para la tu...

Los nanotubos de túnel (TNT) son conductos de membrana basados principalmente en actina F, principalmente abiertos, y desempeñan un papel vital en la transferencia intercelular de carga y orgánulos1. La característica única de los TNT es que conectan las células vecinas sin ningún contacto con el sustrato; Tienen más de 10-300 μm de longitud y sus diámetros varían entre 50 nm a 1 μm 2,3. Los TNT son estructuras transitorias, y su vida dura entre unos pocos minutos y varias horas. Los TNT se demostraron por primera vez en células neuronales PC121; Posteriormente, numerosos estudios demostraron su existencia en varios tipos celulares in vitro e in vivo 4,5. Varios estudios han revelado la importancia patológica de los TNT en diversos modelos de enfermedades, como enfermedades neurodegenerativas, cáncer e infecciones virales 6,7,8.
Las heterogeneidades estructurales de los TNT han sido demostradas por varios estudios en diversos sistemas celulares9. Las diferencias se basan en la composición del citoesqueleto, el mecanismo de formación y los tipos de carga transferidos10. Principalmente, se considera que la continuidad de membrana abierta y positiva para actina F que se cierne entre dos células vecinas y transfiere orgánulos consiste en TNT11. Sin embargo, la falta de claridad o diversidad observada en la formación de TNT se suma a la dificultad en el desarrollo de marcadores específicos de TNT. Por lo tanto, es difícil identificar estructuras de TNT por métodos de detección convencionales y distinguir nanotubos de membrana en términos de protuberancias abiertas y cerradas12. Sin embargo, la característica de los TNT de flotar como protuberancias de membrana de actina F entre dos células es relativamente más fácil y más factible de identificar utilizando técnicas de imagen convencionales. Otras protuberancias celulares basadas en actina, como los filopodios y los filopodios dorsales, no pueden flotar entre dos células distantes, particularmente cuando las células son fijas. Cabe destacar que las neuritas en desarrollo cerradas, acopladas eléctricamente, a menudo se denominan estructuras similares al TNT13.
Se sabe que la actina F juega un papel importante en la formación de TNT, y varios estudios han demostrado que el inhibidor de la actina F citocalasina D inhibe la formación de TNTs14,15. En contraste, los inhibidores de los microtúbulos no tienen ningún efecto sobre la formación de TNT16. En las últimas 2 décadas se han producido varios informes sobre el importante papel que desempeñan los TNT en la propagación de la patología y la resistencia tumoral y la terapia17. Por lo tanto, existe una demanda interminable de mejores técnicas para la caracterización de TNT.
La falta de marcadores específicos de TNT y la diversidad en morfología y composición citoesquelética dificultan el desarrollo de un método único de caracterización. Algunos estudios han utilizado técnicas automatizadas de detección de imágenes y cuantificación de TNT18,19. Sin embargo, hay varias ventajas del actual método de análisis manual de volumen 3D sobre el análisis automático de imágenes para la detección y cuantificación de TNT. A menudo, los ojos humanos entrenados pueden detectar estas nanoestructuras flotantes más fácilmente que un método automatizado de detección de imágenes. Además, los métodos de detección automática podrían ser difíciles de implementar en laboratorios que carecen de experiencia en algoritmos. El presente método podría ser ampliamente adoptado por los investigadores debido a su precisión y reproducibilidad.
En un estudio reciente, demostramos que oAβ promueve la biogénesis de TNTs en células neuronales a través de un mecanismo de endocitosis mediado por PAK1, dependiente de actina12. oLos TNT inducidos por Aβ también expresan PAK1 activado (o fosfo-PAK1). Desarrollamos un método de reconstrucción de imágenes de vista de volumen 3D para distinguir TNT inmunoteñidos con oAβ, F-actina y fosfo-PAK1. Las neuritas en desarrollo β-III positivas para tubulina a menudo se asemejan a estructuras flotantes similares al TNT20. Por lo tanto, distinguimos aún más los TNT basados en actina F de las neuritas β-III tubulina positivas y otras protuberancias similares al TNT. Las imágenes de vista de volumen 3D se han utilizado para identificar TNT sobre la base de sus características de flotar sobre el sustrato y permanecer conectado entre dos células vecinas. Este artículo describe la identificación y detección de conductos de membrana que contienen actina o TNT utilizando imágenes confocales de pila z y, finalmente, la cuantificación manual de las estructuras identificadas a partir de imágenes de reconstrucción de vista de volumen 3D. El método presentado no puede distinguir los TNT propios de final abierto de las estructuras similares al TNT de extremo cerrado; este método ayuda a identificar TNT en cultivo celular 2D in vitro en un sustrato plano. Sin embargo, el método es fácil de implementar y reproducir y puede ser ampliamente utilizado para la cuantificación precisa de TNT basados en actina y para distinguirlos de las neuritas y las estructuras similares al TNT positivas para β-tubulina.

<table><tbody><tr><td>Plato de 35 mm con tamaño de pocillo de 14 mm hecho de cubreobjetos #1.5</td><td>Cellvis</td><td>D35-14-1.5-N Plato de</td><td>imagen utilizado para sembrar células para experimentos de tinción</td></tr><tr><td>A&beta; (1-42) 1 mg</td><td>AnaSpec</td><td>#64129</td><td>Oligómeros de beta amiloide para tratar las células Harina de</td></tr><tr><td>Alexa 488 Cabra Anti-conejo IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11070</td><td>Anticuerpo secundario para fosfo-PAK1</td></tr><tr><td>Cabina de seguridad biológica</td><td>Thermo Scientific (MSC Advantage)</td><td>51025411</td><td>Proporcionar condiciones específicas durante el cultivo</td></tr> celular <tr><td>CO2 Incubadora</td><td>Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)</td><td>51026556</td><td>Para el crecimiento de células a temperatura corporal o cerca</td></tr> de ella <tr><td>Microscopio de barrido láser confocal</td><td>ZEISS (Carl Zeiss)</td><td>LSM 880</td><td>Capaz de generar imágenes tridimensionales de muestras grandes a superresolución</td></tr><tr><td>DABCO [1,4-Diazobiciclo-(2,2,2) octano]</td><td>Merck</td><td>8034560100</td><td>Reactivo antiblanqueador</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-fenilindol)</td><td>Sigma</td><td>D9542-1MG</td><td>Neuclear tinción</td></tr><tr><td>DMEM media</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>Utilizado para la preparación de 100uM de A&beta; (1-42)</td></tr><tr><td>&nbsp; DMEM/F12 (mezcla 1:1 de DMEM y Jamón) s F12)</td><td>Gibco</td><td>12500062</td><td>medios de cultivo para SH-SY5Y</td></tr><tr><td>DMSO (sulfuro de dimetilo) Grado de cultivo celular</td><td>Cryopur</td><td>CP-100 Grado de</td><td>cultivo celular utilizado como agente de disolución para el ácido retinoico</td></tr><tr><td>DMSO (sulfuro de dimetilo) Grado molecular</td><td>Himedia</td><td>MB058</td><td>Utilizado como uno de los agentes disolventes para el A y beta liofilizado; (1-42)</td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>&nbsp; Suplemento principal para medios de cultivo (origen en EE. UU.)</td></tr><tr><td>Fijador de formalina (10% tamponado neutro)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT5014-120ML</td><td>Componente en la solución fijadora de Karnovsky</td></tr><tr><td>Glutaraldehído (Grado I, 25% en H2O)</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td>Componente en la solución fijadora de Karnovsky</td></tr><tr><td>HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol)</td><td>solución TCI</td><td>H024</td><td>Se utiliza para disolver A y beta; (1-42)</td></tr><tr><td>Software de procesamiento/análisis de imágenes de 1 mg: FIJI (ImageJ)</td><td>Instituto Nacional de Salud (NIH)</td><td></td><td>Se utiliza para procesar/analizar las imágenes y diferenciar los TNT de las neuritas utilizando su complemento llamado "visor de volumen".</td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>Cristo, Alfa</td><td>2,4 LDmás</td><td>0,05 mg alícuotas de A&beta; (1-42) se puede almacenar en -20 &deg; C solo después de la liofilización</td></tr><tr><td>Mezcla de penicilina-estreptomicina-neomicina</td><td>Thermo fisher Scientific 15640055</td><td></td><td>Mezcla de antibióticos</td></tr><tr><td>Phalloidin-iFlor 555</td><td>Abcam</td><td>ab176756</td><td>Tinción de unión a F-actina</td></tr><tr><td>Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Conejo]</td><td>CST</td><td>#2601</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal contra Tubulina Beta 3 (TUBb3)</td><td>Clon de</td> <td>la nubePAE711Hu01</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Ácido retinoico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-50MG</td><td>Reactivo diferenciador</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Merck</td><td>8047-15-2</td><td>Detergente utilizado en el Tampón de incubación en inmunotinción</td></tr><tr><td>Sonicador de baño de agua (Quart, Válvula de drenaje Calentador)</td><td>Limpiador ultrasónico</td><td>3.0 L/3.2</td><td>Sonicador utilizado para disolver A y beta; (1-42) caldo, después de agregarle DMSO durante la preparación de 100 &micro; M A y beta; (1-42)</td></tr><tr><td>Software de microscopía</td><td>ZEN ZEISS (Carl Zeiss)</td><td></td><td>Software de adquisición de imágenes para la adquisición de imágenes de microscopía confocal con automatización inteligente</td></tr></tbody></table>

detección y cuantificación de nanotubos de túnel utilizando imágenes de vista de volumen 3d

Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images

Descubrimientos recientes han revelado que las células realizan una transferencia intercelular directa y de largo alcance a través de conductos de membrana de actina a nanoescala, a saber, "nanotubos de túnel" (TNT). Los TNT se definen como extensiones de membrana abiertas rodeadas de bicapa lipídica que median la continuidad entre células vecinas de diámetros que oscilan entre 50 nm y 1 μm. Los TNT se demostraron inicialmente en células neuronales, pero estudios sucesivos han revelado la existencia de TNT en varios tipos de células y enfermedades, como enfermedades neurodegenerativas, infecciones virales y cáncer. Varios estudios se han referido a nanoestructuras de membrana cerradas y acopladas eléctricamente entre células vecinas como TNT o estructuras similares a TNT.
La elucidación de la ultraestructura en términos de continuidad de la membrana en el punto final es técnicamente desafiante. Además, los estudios sobre la comunicación célula-célula son desafiantes en términos de la caracterización de TNT utilizando métodos convencionales debido a la falta de marcadores específicos. Los TNT se definen principalmente como protuberancias de membrana abiertas basadas en actina F. Sin embargo, una limitación importante es que la actina F está presente en todos los tipos de protuberancias, lo que dificulta la diferenciación de los TNT de otras protuberancias. Una de las características notables de los TNT basados en actina F es que estas estructuras flotan entre dos células sin tocar el sustrato. Por lo tanto, los distintos TNT teñidos con actina F se pueden distinguir convenientemente de otras protuberancias como los filopodios y las neuritas en función de su flotación entre las células.
Recientemente hemos demostrado que la internalización de la β amiloide oligomérica 1-42 (oAβ) a través de endocitosis dependiente de actina estimula la quinasa-1 activada por p21 activada (PAK1), que media la formación de TNT que contienen actina F coexpresados con fosfo-PAK1 entre las células neuronalesSH-SY5Y. Este protocolo describe un método de análisis de volumen 3D para identificar y caracterizar TNT a partir de las imágenes capturadas de la pila z de protuberancias de membrana inmunoteñidas con actina F y fosfo-PAK1 en células neuronales tratadas con oAβ. Además, los TNT se distinguen del desarrollo de neuritas y excrecencias neuronales basadas en conductos de membrana inmunoteñidos con tubulina F-actina y β-III.

Aquí, identificamos y caracterizamos TNT inducidos por oAβ en células neuronales SH-SY5Y mediante la construcción de vistas de volumen 3D a partir de imágenes confocales de pila z (Figura 1). Las células fueron doblemente inmunoteñidas con actina F y fosfo-PAK1. Se analizaron imágenes confocales de pila z de células inmunoteñidas para identificar TNT (Figura 2). Además, se analizaron imágenes DIC para verificar que las estructuras de TNT teñidas con F-actina y f...

Los nanotubos de túnel (TNT) son principalmente nanotubos de membrana de actina F abiertos que conectan las células vecinas, facilitando la comunicación intercelular. La característica notable que distingue a los TNT de otras protuberancias celulares es la naturaleza flotante de los nanotubos entre las células. Aquí, caracterizamos los TNT mediante la construcción de una vista de volumen 3D de imágenes confocales de pila z.

Detección y cuantificación de nanotubos de túnel utilizando imágenes de vista de volumen 3D

Recent discoveries have revealed that cells perform direct, long-range, intercellular transfer via nano-scale, actin-membrane conduits, namely ...

La falta de marcadores específicos de nanotubos de túnel restringe el progreso en el campo y existe una creciente demanda de un método para identificar, caracterizar y cuantificar nanotubos de túnel. Los métodos de detección automática son difíciles de implementar sin la experiencia para desarrollar un algoritmo y / o cambiar el algoritmo existente, pero nuestro método manual es fácil de implementar con mejor precisión. La transferencia intercelular de largo alcance a través de nanotubos de túnel se implementa de varias maneras en varios modelos de enfermedades, incluida la patología neurodegenerativa, la propagación viral y el cáncer.Por lo tanto, los estudios sobre nanotubos de túnel para comprender su papel en la patogénesis son importantes. Es posible que los nanotubos de túnel se rompan durante el proceso de tinción. Evite usar hojas de cobertura y montaje en las diapositivas, utilizando platos de imágenes con fondo de vidrio en su lugar.El protocolo de fijación modificado ayuda a mantener intactos los nanotubos de túnel. Demostrando el procedimiento estará Deepak KV, un estudiante de doctorado del laboratorio de Sangeeta NAF. Para comenzar, lave las células de control y oligoméricas tratadas con A-beta dos veces con PBS durante dos minutos antes de la fijación.Preparar la solución fijadora de Karnovsky utilizando fijador de formalina al 2% y glutaraldehído al 2,5% disuelto en tampón fosfato molar 0,1 de pH 7,2. Luego fije las células en la placa de imágenes agregando la solución fijadora de Karnovsky durante 45 minutos a temperatura ambiente. Prepare el tampón de incubación disolviendo 0.1 gramos de saponina en cinco mililitros de FBS y diluyéndolo agregando 95 mililitros de PBS.Luego lave las celdas fijas dos veces usando tampón de incubación durante dos minutos. Después de la fijación, agregue el primer anticuerpo contra fosfo-PAK1, agregue una dilución de uno a 250 en el tampón de incubación e incube durante la noche a cuatro grados centígrados en una cámara oscura y húmeda. Al día siguiente, después de 24 horas de incubación, lave las células dos veces con el tampón de incubación durante dos minutos.Luego agregue el anticuerpo secundario conjugado a Alexa Fluor 488 y Phalloidin 555. Incubar las células en la cámara oscura y húmeda durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, lave las células dos veces con tampón de incubación durante dos minutos.Tiñe el núcleo agregando DAPI en una dilución de uno a 2000 e incubar durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Prepare el medio de montaje DABCO utilizando 25 miligramos de DABCO en 90% de glicerol y 10% de PBS. Para disolver correctamente, ajuste el pH a 8.6 usando ácido clorhídrico diluido de grado espectrofotométrico y mantenga la solución en un balancín para mezclar.Como agente antiblanqueador, agregue el medio de montaje DABCO directamente sobre la placa de imagen que contiene el deslizamiento de la cubierta en la parte inferior. Espere al menos una o dos horas y proceda directamente a realizar imágenes confocales. Para identificar nanotubos de túnel, capture imágenes de pila Z de células inmunoteñidas utilizando un microscopio de escaneo láser confocal seleccionando primero los canales y haciendo clic secuencialmente en los láseres requeridos en la pista uno, pista dos y pista tres de Windows en el software confocal.Haga clic en la opción TPMT debajo de la ventana de pista uno para tomar las imágenes de contraste de interferencia diferencial con canales de fluorescencia. Seleccione la pestaña Adquisición del software, haga clic en la pestaña Z-stack y espere a que se abra una ventana. A continuación, haga clic en Live Scan para enfocar las celdas en la parte inferior del plato.Seleccione esa imagen enfocada como la primera pila y, a continuación, enfóquese hacia arriba para ver la parte superior de la celda y selecciónela como la última pila. Detenga el escaneo en vivo y haga clic en el número junto a la pestaña Óptimo para corregir el tamaño del paso de las pilas que determina el número de sectores y los intervalos en función del grosor de las celdas. Tome imágenes secuenciales de tres canales de DAPI, FITC y TRITC con láseres de 405 nanómetros, 488 nanómetros y 561 nanómetros y capture con un tiempo de permanencia de píxeles de 1,02 microsegundos.Capture imágenes en el canal DIC con canales de fluorescencia para observar el límite celular. Abra las imágenes confocales guardadas en formato de datos czi en el software Fiji para su análisis. Seleccione la opción Hyperstack para ver cada Z-stack y canal de la imagen.Desplácese por el canal y las barras de desplazamiento de la pila Z para seleccionar la pila exacta de un canal de interés en particular. Luego seleccione primero el canal teñido de actina F desplazándose por la barra de canales y desplácese manualmente por las pilas Z para ver cada pila una por una. Identifique las estructuras teñidas con actina F que parecen estar conectando células que son visibles en las partes inferiores de las pilas Z y están cerca de la superficie de la placa de imágenes con Z igual a dos como neuritas.Identifique los nanotubos de túnel, los conductos de célula a célula flotantes positivos de actina F desplazándose las pilas Z hacia la parte superior de Z es igual a cuatro. Busque neuritas cerca de las partes inferiores de las pilas Z hacia la superficie y observe que comienzan a desaparecer con el desplazamiento de las pilas Z hacia la parte superior en Z igual a seis. Identifique los nanotubos de túnel fosfo-PAK1 positivos de manera similar a los nanotubos de túnel positivos de actina F mediante el análisis de la naturaleza flotante de los conductos de las pilas Z.Como la tinción de fosfo-PAK1 es más débil que la tinción de actina F, busque nanotubos de túnel teñidos con fosfo-PAK1 en Z igual a cuatro y en Z igual a seis. Además, observe las imágenes DIC para verificar que las estructuras de nanotubos de túnel teñidas con F-actina y fosfo-PAK1 son conductos de membrana entre las células. Además, fusione los canales F-actina y fosfo-PAK1 para verificar que los nanotubos de túnel identificados son estructuras co-teñidas de F-actina y fosfo-PAK1.Para cuantificar los nanotubos de túnel, cuente manualmente el número total de células y los nanotubos de túnel identificados y represente los números como porcentajes. Para distinguir los nanotubos de túnel positivos para la tubulina F y beta III como conductos flotantes de imágenes de pila Z, combine los canales de tubulina F y beta III, luego analice las pilas Z de las imágenes fusionadas. Busque exclusivamente nanotubos de túnel teñidos con actina F que sean apenas visibles en Z igual a tres y prominentes en Z igual a seis y Z igual a nueve.Del mismo modo, identifique la actina F y la tubulina beta III. nanotubos de túnel doblemente positivos como conductos flotantes en Z igual a seis y Z igual a nueve. Identificar otras protuberancias no flotantes teñidas de actina F y beta III tubulina de las partes inferiores de las pilas Z.Mida el diámetro de los nanotubos de túnel con la herramienta Line en Fiji. Verifique la escala de medida haciendo clic en Analizar y, a continuación, establezca la escala para que la distancia en píxeles se establezca automáticamente a partir de las imágenes czi. Mida los diámetros de los nanotubos de túnel en el plano XY.Usando el complemento Volume Viewer en Fiji, que permite la resegmentación 3D y la visualización 3D habilitada para umbrales, divida las imágenes de la pila Z en canales individuales. A continuación, recorte las imágenes de pila Z de un solo canal para usar la vista de reconstrucción 3D para resaltar uno o dos nanotubos o neuritas de túnel a la vez. Fije un solo nanotubos de túnel o neurita en el plano XY y marque las secciones transversales de acceso XZ e YZ.Observe las neuritas en la parte inferior del plano XZ, en los planos XZ y YZ, y los nanotubos de túnel en las pilas Z superiores. Seleccione los nanotubos de túnel individuales o la neurita para reconstruir la vista de volumen 3D en el plano XZ. En la reconstrucción 3D, observe las neuritas en la parte inferior del plano Z y los nanotubos de túnel que aparecen como estructuras flotantes que conectan dos células sin tocar el plano Z inferior.Se analizaron imágenes confocales de pila Z de células inmunoteñidas con actina F y fosfo-PAK1 para identificar nanotubos de túnel. Además, se analizaron imágenes DIC para verificar que las estructuras de nanotubos de túnel teñidas con F-actina y fosfo-PAK1 eran conductos de membrana entre las células. Las células fueron inmunoteñidas doblemente con actina F y tubulina beta III y la actina F similar a nanotubos túnel y los conductos de membrana doble positivos de túnel tipo nanotubo F y tubulina beta III se distinguieron de solo nanotubos de túnel positivos para F-actina.Los nanotubos de túnel coexpresados con fosfo-PAK1 y F-actina se distinguieron de las protuberancias celulares de otras neuritas mediante la construcción de imágenes de vista de volumen 3D basadas en su característica de flotar entre dos células sin tocar el sustrato. El uso del agente fijador correcto es importante ya que la fijación imperfecta de la muestra puede conducir a una rápida degradación proteolítica de las proteínas diana y una reducción de la inmunorreactividad específica.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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