Name: Una guía para examinar la formación de grasa intramuscular y su origen celular en el músculo esquelético (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprende a visualizar y cuantificar grasa intramuscular en músculo esquelético mediante fijación con PFA e inyección de glicerol. Este protocolo permite estudiar el origen celular de los adipocitos en sarcopenia y distrofia muscular de Duchenne.

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Agradecemos a los miembros del laboratorio Kopinke por ayudar con la recopilación de datos y la lectura crítica del manuscrito. También agradecemos a los miembros del Instituto de Miología de la Universidad de Florida por su valiosa contribución sobre el manuscrito. El trabajo fue apoyado por la subvención de los NIH 1R01AR079449. La Figura 2 fue creada con Biorender.

<ol><li>Milad, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+plasma+lipid+levels+exacerbate+muscle+pathology+in+the+mdx+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Increased plasma lipid levels exacerbate muscle pathology in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Skeletal Muscle. 7 (1), 19(2017).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+regional+body+fat+distribution%2C+and+the+metabolic+syndrome+in+older+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women.</a> Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+regional+adipose+tissue+distribution+and+both+type+2+diabetes+and+impaired+glucose+tolerance+in+elderly+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men and women.</a> Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+skeletal+muscle+strength%2C+mass%2C+and+quality+in+older+adults%3A+the+health%2C+aging+and+body+composition+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journals+of+Gerontology%2C+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The loss of skeletal muscle strength, mass, and quality in older adults: the health, aging and body composition study.</a> The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (10), 1059-1064 (2006).</li>
<li>Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thigh+adipose+tissue+distribution+is+associated+with+insulin+resistance+in+obesity+and+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).</li>
<li>Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+lipid+content+is+increased+in+obesity+and+decreased+by+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss.</a> Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).</li>
<li>Burakiewicz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+fat+replacement+of+muscle+by+quantitative+MRI+in+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Quantifying fat replacement of muscle by quantitative MRI in muscular dystrophy.</a> Journal of Neurology. 264 (10), 2053-2067 (2017).</li>
<li>Murphy, W. A., Totty, W. G., Carroll, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+of+normal+and+pathologic+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Roentgenology%22%5BJournal%5D)">MRI of normal and pathologic skeletal muscle.</a> American Journal of Roentgenology. 146 (3), 565-574 (1986).</li>
<li>Willcocks, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+prospective+longitudinal+study+of+magnetic+resonance+biomarkers+in+a+large+duchenne+muscular+dystrophy+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multicenter prospective longitudinal study of magnetic resonance biomarkers in a large duchenne muscular dystrophy cohort.</a> Annals of Neurology. 79 (4), 535-547 (2016).</li>
<li>Wokke, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+MRI+and+strength+measurements+in+the+assessment+of+muscle+quality+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Quantitative MRI and strength measurements in the assessment of muscle quality in Duchenne muscular dystrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (5), 409-416 (2014).</li>
<li>Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins%2C+potency%2C+and+heterogeneity+of+skeletal+muscle+fibro-adipogenic+progenitors-time+for+new+definitions%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions.</a> Skeletal Muscle. 11 (1), 16(2021).</li>
<li>El Agha, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+fibrotic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in fibrotic disease.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).</li>
<li>Joe, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li>
<li>Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+adipose+is+derived+from+a+non-Pax3+lineage+and+required+for+efficient+regeneration+of+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles.</a> Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).</li>
<li>Scott, R. W., Arostegui, M., Schweitzer, R., Rossi, F. M. V., Underhill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hic1+defines+quiescent+mesenchymal+progenitor+subpopulations+with+distinct+functions+and+fates+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hic1 defines quiescent mesenchymal progenitor subpopulations with distinct functions and fates in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Stem Cell. 25 (6), 797-813 (2019).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+adipogenesis+originate+from+a+common+mesenchymal+progenitor+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 21 3654-3664 (2011).</li>
<li>Hogarth, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroadipogenic+progenitors+are+responsible+for+muscle+loss+in+limb+girdle+muscular+dystrophy+2B%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Fibroadipogenic progenitors are responsible for muscle loss in limb girdle muscular dystrophy 2B.</a> Nature Communications. 10 (1), 2430(2019).</li>
<li>Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li>
<li>Stumm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odd+skipped-related+1+%28Osr1%29+identifies+muscle-interstitial+fibro-adipogenic+progenitors+%28FAPs%29+activated+by+acute+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Odd skipped-related 1 (Osr1) identifies muscle-interstitial fibro-adipogenic progenitors (FAPs) activated by acute injury.</a> Stem Cell Research. 32, 8-16 (2018).</li>
<li>Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+Hedgehog+signaling+restricts+injury-induced+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ciliary Hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis.</a> Cell. 170 (2), 340-351 (2017).</li>
<li>Huang, Y., Das, A. K., Yang, Q. Y., Zhu, M. J., Du, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zfp423+promotes+adipogenic+differentiation+of+bovine+stromal+vascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zfp423 promotes adipogenic differentiation of bovine stromal vascular cells.</a> PLoS One. 7 (10), 47496(2012).</li>
<li>Sun, Y. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFR%CE%B1+regulated+by+miR-34a+and+FoxO1+promotes+adipogenesis+in+porcine+intramuscular+preadipocytes+through+Erk+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">PDGFRα regulated by miR-34a and FoxO1 promotes adipogenesis in porcine intramuscular preadipocytes through Erk signaling pathway.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2424(2017).</li>
<li>Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation%2C+and+characterization+of+fibro-adipogenic+progenitors+%28FAPs%29+and+myogenic+progenitors+%28MPs%29+in+skeletal+muscle+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) in skeletal muscle in the rat.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e61750(2021).</li>
<li>Lukjanenko, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+disrupts+muscle+stem+cell+function+by+impairing+matricellular+WISP1+secretion+from+fibro-adipogenic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular WISP1 secretion from fibro-adipogenic progenitors.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446 (2019).</li>
<li>Santini, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+PDGFRalpha%28%2B%29+progenitor+cells+contribute+to+fibrosis+versus+healing+in+a+context-+and+spatiotemporally+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident PDGFRalpha(+) progenitor cells contribute to fibrosis versus healing in a context- and spatiotemporally dependent manner.</a> Cell Reports. 30 (2), 555-570 (2020).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+PDGFRalpha%2B+mesenchymal+progenitors+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of PDGFRalpha+ mesenchymal progenitors in human skeletal muscle.</a> Cell Death & Disease. 5, 1186(2014).</li>
<li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li>
<li>Soliman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+potential+of+Hic1-expressing+cardiac+stromal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogenic potential of Hic1-expressing cardiac stromal progenitors.</a> Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).</li>
<li>Chung, M. I., Bujnis, M., Barkauskas, C. E., Kobayashi, Y., Hogan, B. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-mediated+BMP%2FSMAD+signaling+regulates+lung+alveolar+stem+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Niche-mediated BMP/SMAD signaling regulates lung alveolar stem cell proliferation and differentiation.</a> Development. 145 (9), Cambridge, England. (2018).</li>
<li>Hilgendorf, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omega-3+fatty+acids+activate+ciliary+FFAR4+to+control+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Omega-3 fatty acids activate ciliary FFAR4 to control adipogenesis.</a> Cell. 179 (6), 1289-1305 (2019).</li>
<li>Waisman, A., Norris, A. M., Elías Costa, M., Kopinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+and+unbiased+segmentation+and+quantification+of+myofibers+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automatic and unbiased segmentation and quantification of myofibers in skeletal muscle.</a> Scientific Reports. 11 (1), 11793(2021).</li>
<li>Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2%2B+CNS+glial+progenitors+remain+committed+to+the+oligodendrocyte+lineage+in+postnatal+life+and+following+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration.</a> Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).</li>
<li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4(2001).</li>
<li>Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+profiling+reveals+that+transient+adipogenic+activation+is+a+hallmark+of+mouse+models+of+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration.</a> PLoS One. 8 (8), 71084(2013).</li>
<li>Mahdy, M. A., Lei, H. Y., Wakamatsu, J., Hosaka, Y. Z., Nishimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+muscle+regeneration+following+cardiotoxin+and+glycerol+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Anatomy+%3D+Anatomischer+Anzeiger%3A+Official+Organ+of+the+Anatomische+Gesellscaft%22%5BJournal%5D)">Comparative study of muscle regeneration following cardiotoxin and glycerol injury.</a> Annals of Anatomy = Anatomischer Anzeiger: Official Organ of the Anatomische Gesellscaft. 202, 18-27 (2015).</li>
<li>Pisani, D. F., Bottema, C. D., Butori, C., Dani, C., Dechesne, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+skeletal+muscle+adiposity%3A+a+glycerol+treatment+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Mouse model of skeletal muscle adiposity: a glycerol treatment approach.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (3), 767-773 (2010).</li>
<li>Kawai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+glycerol+myopathy%3A+a+histological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Experimental glycerol myopathy: a histological study.</a> Acta Neuropathologica. 80 (2), 192-197 (1990).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Bmp3b+expression+maintains+skeletal+muscle+integrity+and+decreases+in+age-related+sarcopenia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Bmp3b expression maintains skeletal muscle integrity and decreases in age-related sarcopenia.</a> The Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139617(2021).</li>
<li>Biferali, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prdm16-mediated+H3K9+methylation+controls+fibro-adipogenic+progenitors+identity+during+skeletal+muscle+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Prdm16-mediated H3K9 methylation controls fibro-adipogenic progenitors identity during skeletal muscle repair.</a> Science Advances. 7 (23), 9371(2021).</li>
<li>Biltz, N. K., Meyer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+quantification+of+fatty+infiltration+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle.</a> Skeletal Muscle. 7 (1), (2017).</li>
<li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), Cambridge, England. (2021).</li>
<li>Gómez-Gaviro, M. V., Sanderson, D., Ripoll, J., Desco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+applications+of+tissue+clearing+and+three-dimensional+imaging+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Biomedical applications of tissue clearing and three-dimensional imaging in health and disease.</a> iScience. 23 (8), 101432(2020).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li>
</ol>

Los autores no declaran intereses contrapuestos.

Este protocolo describe un protocolo extenso y detallado que permite una visualización eficiente y una cuantificación rigurosa de la grasa intramuscular. Al dividir el mismo músculo en dos partes, una que se utiliza para la inmunofluorescencia y la otra para el análisis RT-qPCR, este protocolo también es muy versátil. También se puede combinar con el rastreo del linaje genético de los FAP para estudiar su conversión en adipocitos bajo ciertas condiciones y es altamente adaptable para etiquetar e imaginar múltiples tipos de células adicionales.
Las formas más utilizadas para visualizar la grasa intramuscular son las secciones de parafina seguidas de tinción de hematoxilina y eosina o las secciones congeladas teñidas para colorantes lipofílicos como Oil Red O (ORO). Sin embargo, mientras que los tejidos procesados con parafina mantienen la mejor histología, el mismo proceso también extrae todos los lípidos impidiendo el uso de colorantes lipofílicos. Aunque los métodos de tinción lipofílica funcionarán tanto en secciones de tejido fijas como no fijadas con PFA, las gotas de lípidos se desplazan fácilmente aplicando presión a la cubierta, distorsionando así la distribución espacial de la grasa intramuscular. Para evitar esto, un estudio reciente estableció un protocolo riguroso para visualizar los adipocitos ORO + utilizando un enfoque de montaje completo. Para ello, los autores descelularizaron la AT para visualizar la distribución espacial de la grasa intramuscular a lo largo de toda la AT41. Tan poderosa como es esta técnica, también evita el uso de otras co-manchas para marcar estructuras celulares adicionales. Todo el enfoque de inmunofluorescencia de montaje presentado aquí se puede utilizar para teñir conjuntamente los adipocitos con una variedad de marcadores que permiten un mapeo fino del entorno celular. Un desafío importante, sin embargo, es la penetración tisular de los anticuerpos. Cuantas más fibras se mantengan juntas, más difícil será para los anticuerpos penetrar y unirse por igual a todos los antígenos disponibles. Por lo tanto, este método es más efectivo cuando se observan pequeños grupos de fibras. Al mismo tiempo, esto también es una limitación, ya que la ubicación anatómica general de la grasa intramuscular se está perdiendo cuando se enfoca solo en pequeños haces de fibra pelados. Sin embargo, con el desarrollo actual de nuevos métodos de limpieza de tejidos más la nueva tecnología de imágenes, será posible una mayor penetración y visualización de tejidos en el futuro 42,43,44.
Si bien la fijación previa del tejido muscular preserva la morfología de los adipocitos, también crea un desafío para evaluar el tamaño de las miofiberes, una medida importante de la salud muscular. El tamaño de miofibra se determina midiendo el área de sección transversal de las miofiberes. Hemos informado previamente que la fijación previa del tejido muscular hará que la mayoría de los marcadores disponibles para delinear las miofibers fallen31. Para superar este obstáculo, hemos desarrollado una novedosa tubería de segmentación de imágenes, que permite la medición del tamaño de miofiber incluso en secciones musculares fijas31. Por lo tanto, hemos establecido una tubería de procesamiento de tejidos robusta y eficiente que, combinada con este protocolo, supera la mayoría de las desventajas causadas por la fijación previa del tejido muscular.
Otra ventaja importante de este enfoque es la versatilidad. Al dividir la AT en dos partes, se maximiza la cantidad de información que se puede obtener de un músculo. Esto no solo reduce el número de animales, sino que también agrega una capa adicional de control al confirmar la histología a través de la expresión génica y viceversa. Además, se pueden examinar muchos genes diferentes más allá de los genes adipogénicos. El ARN aislado también se puede utilizar para un experimento de RNAseq de músculo completo. Finalmente, la pieza muscular congelada al chasquido también se puede usar para el trabajo con proteínas. Una limitación de este protocolo es la posibilidad de que la lesión no sea consistente en toda la longitud de la AT. Esto podría conducir a un escenario en el que las dos partes musculares divergen en la cantidad de grasa intramuscular que contienen y puede justificar la exclusión de dicha muestra de cualquier análisis posterior. Por lo tanto, se recomienda no simplemente confiar en RT-qPCR para sacar conclusiones importantes sobre la cantidad de grasa intramuscular, sino más bien como datos de apoyo a las cuantificaciones histológicas.
Juntos, este protocolo describe una línea de procesamiento de tejidos robusta, eficiente y rigurosa que permitirá la visualización y cuantificación de la grasa intramuscular, el primer paso en el desarrollo de nuevas opciones de tratamiento para combatir la fibrosis grasa. Al mismo tiempo, es versátil y se puede adaptar a muchos tipos de células diferentes dentro del músculo, así como adipocitos en otros tejidos.

La infiltración de tejido muscular sano con fibrosis grasa es una característica prominente de la distrofia muscular de Duchenne (DMD) y otras enfermedades neuromusculares, así como la sarcopenia, la obesidad y la diabetes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Aunque el aumento de la infiltración de grasa en estas condiciones está fuertemente asociado con la disminución de la función muscular, nuestro conocimiento de por qué y cómo se forma la grasa intramuscular sigue siendo limitado. Los FAPs son una población multipotente de células del estroma mesenquimal presente en la mayoría de los órganos adultos, incluido el músculo esquelético11,12. Sin embargo, con la edad y en las enfermedades crónicas, los FAP producen tejido cicatricial fibrótico y se diferencian en adipocitos, que se encuentran entre las miofibras individuales y forman grasa intramuscular 13,14,15,16,17,18,19,20.
Para comenzar a combatir la formación de grasa intramuscular, es necesario definir los mecanismos de cómo los FAP se convierten en adipocitos. PDGFRα es el marcador "estándar de oro" en el campo para identificar FAPs dentro del músculo de múltiples especies 13,16,17,18,20,21,22,23,24,25,26,27. Como resultado, se han generado varias líneas de Cre inducibles con tamoxifeno murino, bajo el control del promotor Pdgfrα, lo que permite manipular genéticamente faPs in vivo utilizando el sistema Cre-LoxP 27,28,29. Por ejemplo, al combinar esta línea cre inducible con un reportero genético, se puede realizar el rastreo de linaje de FAPs, una estrategia que hemos aplicado con éxito al mapa de destino FAPs en músculo y tejido adiposo blanco 20,30. Además del rastreo de linaje, estas líneas cre proporcionan herramientas valiosas para estudiar la conversión de FAP a grasa.
Un obstáculo importante en la definición del mecanismo de la conversión adipogénica de los FAP en grasa intramuscular es la capacidad de cuantificar de manera rigurosa y reproducible la cantidad de grasa intramuscular que se ha formado en diferentes condiciones. La clave es equilibrar la preservación del tejido muscular y graso y hacer coincidir esto con los métodos de tinción disponibles para visualizar los adipocitos. Por ejemplo, el músculo esquelético a menudo se congela sin fijación previa, preservando las miofibras pero interrumpiendo la morfología de los adipocitos (Figura 1). Por el contrario, la fijación seguida de la incrustación de parafina, al tiempo que muestra la mejor histología tisular, incluidos los adipocitos, elimina todos los lípidos, lo que hace que la mayoría de los tintes lipofílicos, como el tinte oil red O comúnmente utilizado, sean inutilizables.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig1v2.jpg"> Figura 1: Imágenes representativas de la grasa intramuscular en tejidos musculares congelados frente a tejidos musculares fijos. (A) Descripción general esquemática de la configuración experimental. Imágenes inmunofluorescentes que muestran adipocitos (amarillo), miofibras (gris) y núcleos (cian) dentro de los TA (B) congelados al presión y (C) fijos a los 21 días después de la lesión por glicerol. Barras de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El protocolo descrito aquí preserva la morfología de miofibra y adipocitos y permite la visualización y el análisis de múltiples tipos de células. Este enfoque se basa en la tinción por inmunofluorescencia de adipocitos en tejido muscular fijo de paraformaldehído (PFA), lo que permite la tinción conjunta con múltiples anticuerpos. También se puede adaptar fácilmente para mostrar espacialmente la grasa intramuscular en el tejido intacto utilizando imágenes de montaje completo, proporcionando así información sobre el microambiente celular de la grasa dentro del músculo. Además, este protocolo se puede combinar con nuestro enfoque recientemente publicado para determinar el área transversal de las miofiberes en tejidos musculares fijos31, una medida importante para evaluar la salud muscular. La combinación de este enfoque con el rastreo del linaje genético para mapear el destino, la diferenciación de los FAP en adipocitos también se describe aquí. Por lo tanto, el protocolo versátil descrito aquí permite una evaluación rigurosa y reproducible de los FAPs y su diferenciación en grasa intramuscular en secciones de tejido y tejidos intactos.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig2v2.jpg"> Figura 2: Descripción general del protocolo esquemático. Descripción general esquemática del procesamiento de tejidos en el que se extrae un tercio de la AT, se congela al instante y se homogeneiza para el posterior aislamiento de ARN y el análisis de transcripción a través de RT-qPCR. Los otros dos tercios de la AT se fijan con PFA y se procesan para inmunotinción en secciones congeladas o fibras de montaje completo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>16 % de PFA (paquete de 12 botellas de 10 ml)</td><td>Electrónica Miscroscopia Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 2,0 ml Tubos de microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td>para congelación/batido de perlas</td></tr><tr><td>2-metilbutano (4 L)</td><td>Fisher Chemical</td><td>O3551-4</td><td>isopentano</td></tr><tr><td>Etanol absoluto (200 grados)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab fragmento burro anti-ratón</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-007-003</td><td>ratón contra ratón bloqueo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 burro anti-pollo anti-cuerno anticuerpo secundario</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 burro anti-ratón anticuerpo secundario</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 burro anti-conejo anticuerpo</td> <td>secundarioInvitrogen</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 burro anti-cabra anticuerpo secundario</td><td>Invitrogen</td><td>A11057</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 burro anti-conejo anti-conejo anticuerpo</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Anticuerpo faloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A12380</td><td>Disuelto en 1,5 mL de metanol (~66 &micro; M solución de trabajo)</td></tr><tr><td>BioLite Multiplatos de 24 pocillos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>930186</td><td>placa de 24 pocillos para la incubación de tejidos PFA</td></tr><tr><td>Biometra TOne</td><td>analytikjena</td><td>8462070301</td><td>Termociclador</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-GFP de pollo</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo/alcohol isoamílico 24:1(v/v) para biología molecular, sin ADNasa, ARNasa y proteasa</td><td>ThermoFisher Aceite</td><td>de maíz AC327155000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Scientific Sigma Aldrich</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>DAPI tinción</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>150 &micro; M solución de trabajo en dH2O</td></tr><tr><td>Donkey Serum (100 mL)</td><td>Millipore Sigma</td><td>5058837</td><td>para solución de bloqueo</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5 Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>pinzas de punta afilada</td></tr><tr><td>Tijeras finas rectas 9 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>medio de montaje</td></tr><tr><td>Glicerol, 99,5%, para biología molecular (500 mL)</td><td>Acros Organics</td><td>327255000</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-PDGFR&alfa; anticuerpo</td><td>R& D</td><td>AF1062</td><td></td></tr><tr><td>Horno de hibridación</td><td>VWR</td><td>230301V</td><td>para incubación de tamoxifeno</td></tr><tr><td>Pluma PAP de barrera hidrofóbica ImmEdge</td><td>Vector Laboratories</td> Pluma <td>hidrofóbica</td><td>H-4000</td></tr><tr><td>Jeringa de insulina con aguja intravenosa microfina (28 g)</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de insulina con punta deslizante, 1 mL</td><td>BD</td><td>329654</td><td>Jeringa de insulina sin aguja, para vía oral </td></tr><tr><td>Kit de síntesis de ADNc</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Patterson</td><td></td> Microscopio 78938441 <td></td></tr><tr><td>invertido Leica DMi8 Microscopio invertido Leica DMi8</td><td></td><td>utilizado para la obtención de imágenes confocales y FI de campo amplio</td>Micro portaobjetos VWR 48311-703 portaobjetos de microscopio con carga positiva anticuerpo anti-MYOD de ratón <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>MA1-41017</td><td></td></tr><tr><td>ratón anticuerpo anti-PAX7 (sobrenadante)</td><td>DSHB</td><td>AB 428528</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Premier+ Hojas de micrótomo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3052835</td><td>Espectrofotómetro</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND2000</td><td>Espectrofotómetro para rendimiento de ARN</td></tr><tr><td>Play-Doh Compuesto de</td> modelado <td>Hasbro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Mezcla Maestra Verde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A25742</td><td>colorante verde Mezcla maestra de PCR</td></tr><tr><td>Puralube Pomada veterinaria</td><td>Puralube</td><td>17033-211-38</td><td>pomada oftálmica veterinaria</td></tr><tr><td>QuantStudi 6 Flex Sistema de PCR en tiempo real de 384 pocillos Máquina de</td><td>qPCR</td><td>4485694</td> de <td>Applied Biosystems</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-perilipina de conejo</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9349S</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de rotor rojo</td><td>Hoefer Scientific</td><td>PR70-115V</td><td>agitador para tinción de FI</td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Slip-Rite Cubreobjetos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>152460</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td>contiene mini columnas de centrifugación</td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes 1,5 ml, naturales</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de muestra RB (2 mL)</td><td>QIAGEN</td><td>990381</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Alfa Aesar</td><td>14314</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de acero inoxidable, 2,8 mm</td><td>Precellys</td><td>KT03961-1-101. Cuentas pequeñas BK</td><td></td></tr><tr><td>Cuentas de acero inoxidable, 5 mm</td><td>QIAGEN</td><td>69989</td><td>cuentas medianas</td></tr><tr><td>Cuentas de acero inoxidable, 7 mm</td><td>QIAGEN</td><td>69990</td><td>cuentas grandes</td></tr><tr><td>Bisturíes desechables de acero inoxidable Bisturí</td><td>Miltex</td><td>327-4102</td><td>Tubo</td>de</tr><tr><td>alimentación de acero inoxidable, 20 G x 38 mm, recto</td><td>Aguja de sonda nasogástrica</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>FTSS-20S-3 de Instech LaboratoriesTamoxifeno</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>T006000</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Plus O.C.T. Compuesto</td><td>Fisher HealthCare</td><td>4585</td><td>medio de inclusión</td></tr><tr><td>TissueLyser LT</td><td>QIAGEN</td><td>85600</td><td>batidor de perlas</td></tr><tr><td>TissueLyser LT Adaptador, 12 tubos</td><td>QIAGEN</td><td>69980</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura</td><td>4566</td><td>moldes de muestras</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa</td><td>Aesar A16046</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reactivo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596026</td><td>tiocianato de guanidio</td></tr><tr><td>Tween20 (500 mL)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>VWR Micro Slides - Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311703</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Frascos de tinción Coplin</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6016</td><td>Tarro Coplin</td></tr></tbody></table>

una guía para examinar la formación de grasa intramuscular y su origen celular en el músculo esquelético

A Guide to Examining Intramuscular Fat Formation and its Cellular Origin in Skeletal Muscle

Los progenitores fibroadipogénicos (FAP) son células del estroma mesenquimal que desempeñan un papel crucial durante la homeostasis y regeneración del músculo esquelético. Los FAP construyen y mantienen la matriz extracelular que actúa como un andamio molecular de miofibra. Además, los FAP son indispensables para la regeneración de miofiberes, ya que secretan una multitud de factores beneficiosos detectados por las células madre musculares (MuSC). En estados enfermos, sin embargo, los FAPs son el origen celular de la grasa intramuscular y el tejido cicatricial fibrótico. Esta fibrosis grasa es un sello distintivo de la sarcopenia y las enfermedades neuromusculares, como la distrofia muscular de Duchenne. Una barrera importante para determinar por qué y cómo los FAP se diferencian en grasa intramuscular es la preservación efectiva y la posterior visualización de los adipocitos, especialmente en las secciones de tejido congelado. Los métodos convencionales de procesamiento del tejido muscular esquelético, como la congelación instantánea, no preservan adecuadamente la morfología de los adipocitos individuales, lo que impide una visualización y cuantificación precisas. Para superar este obstáculo, se desarrolló un riguroso protocolo que preserva la morfología de los adipocitos en las secciones del músculo esquelético, lo que permite la visualización, la obtención de imágenes y la cuantificación de la grasa intramuscular. El protocolo también describe cómo procesar una porción de tejido muscular para RT-qPCR, lo que permite a los usuarios confirmar los cambios observados en la formación de grasa al ver las diferencias en la expresión de genes adipogénicos. Además, se puede adaptar para visualizar adipocitos mediante inmunofluorescencia de montaje completo de muestras musculares. Finalmente, este protocolo describe cómo realizar el rastreo genético del linaje de los FAPs que expresan Pdgfrα para estudiar la conversión adipogénica de los FAPs. Este protocolo produce consistentemente imágenes inmunofluorescentes de alta resolución y morfológicamente precisas de adipocitos, junto con la confirmación por RT-qPCR, lo que permite una visualización y cuantificación robustas, rigurosas y reproducibles de la grasa intramuscular. En conjunto, la línea de análisis descrita aquí es el primer paso para mejorar nuestra comprensión de cómo los FAP se diferencian en grasa intramuscular, y proporciona un marco para validar nuevas intervenciones para prevenir la formación de grasa.

Visualización inmunofluorescente de la grasa intramuscular Siguiendo los pasos anteriores y viendo la Figura 1A, se recolectaron secciones de tejido de TA de una lesión posterior al glicerol de 21 días que se congelaron inmediatamente después de la recolección en isopentano enfriado con LN2 o se fijaron en PFA al 4% durante 2,5 h. Después de crioseccionar y teñir ambas muestras, se tomaron imágenes en la mitad del vientre, el área más grande de la AT. Los adipocitos PERILIPIN+ de las AATT no fijadas (Figura 1B) han alterado significativamente la morfología en comparación con las secciones fijas (Figura 1C), lo que hace que su identificación, visualización y posterior cuantificación sean mucho más difíciles y potencialmente inexactas. A tener en cuenta, las primeras gotas lipídicas de PERILIPIN+ se detectaron alrededor de los 5 días posteriores a la lesión, y la mayoría de los adipocitos se formaron en el día 7. A los 21 días después de la lesión, los adipocitos habían madurado completamente.
Como la cantidad de grasa por TA se correlaciona fuertemente con la gravedad de la lesión inducida, los TA deben lesionarse significativamente para observar y estudiar eficazmente la formación de grasa intramuscular. Practicar inyecciones con tinta en los AATT de cadáveres es una excelente manera de mejorar la gravedad de las lesiones. Las lesiones exitosas tienden a estar por encima del 50% del músculo. Para tener en cuenta, las áreas lesionadas del músculo representan áreas desprovistas de fibras musculares o áreas que están pobladas por fibras musculares que contienen al menos un núcleo ubicado centralmente, un sello distintivo conocido de una fibra muscular regeneradora.
Este protocolo se puede adaptar fácilmente para manchar para FAPs y grasa en 3D. Para esto, múltiples miofibras de la TA posterior a la fijación se separaron cuidadosamente, seguidas de inmunofluorescencia de montaje completo. La clave es asegurar adecuadamente las fibras al portaobjetos de vidrio y, al mismo tiempo, evitar la compresión excesiva del tejido. Mediante el uso de pies de arcilla moldeables, el usuario puede ajustar el grosor requerido y asegurar el deslizamiento a la corredera, incluso permitiendo el uso de un microscopio invertido (Figura 4A). Este método se utilizó con éxito para etiquetar PDGFRα+ FAPs, Fiberas de faloidina+ y adipocitos que expresan PERILIPIN (Figura 4B, Video Suplementario 1 y Video Suplementario 2). Después de obtener imágenes en múltiples planos z que abarcan hasta 150 μm de espesor, se utilizó el módulo de renderizado 3D dentro del software del microscopio para crear una reconstrucción 3D.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig4v3.jpg"> Figura 4: Tinción inmunofluorescente de montaje completo. (A) Vista superior y lateral de cómo montar la muestra y agregar una cubierta para la tinción de montaje completo. (B) Reconstrucciones 3D representativas de FAPs (verde; izquierda) y adipocitos (rojo; derecha) junto con miofibras (gris) y núcleos (azul). Barras de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig4v3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Cuantificación de la grasa intramuscular Una vez que se han tomado imágenes de grasa intramuscular, se utilizó la función de contador celular en ImageJ/FIJI para contar manualmente el número de adipocitos PERLIPIN+ (Figura 5A). A continuación, se determinó el área total de la sección muscular, así como el área lesionada, definida por núcleos ubicados centralmente dentro de las miofiberes. Para controlar la gravedad de la lesión, el número total de adipocitos se dividió por el área lesionada, lo que resultó en el número de células grasas por 1 mm2 de músculo lesionado. Por lo general, las AATT que muestran un daño &lt;30% se excluyen de las cuantificaciones. A tener en cuenta, aunque los adipocitos son raros sin lesión, oscilando entre cero y ocho por área transversal, el número total de adipocitos todavía está normalizado por área total. Como se destaca en la Figura 5B, una lesión por glicerol causa cantidades masivas de grasa intramuscular en comparación con un músculo TA no lesionado. Alternativamente, como la tinción de perilipina es muy limpia con una alta relación señal-ruido, también es posible utilizar la función Analizar partícula para determinar el área total ocupada por perilipina. Sin embargo, este método no podrá distinguir entre adipocitos más pequeños y menos. Se tomaron imágenes y cuantificaron hasta tres secciones de un mínimo de cuatro animales individuales, y se informó el número promedio de células grasas presentes por ratón.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig5v2.jpg"> Figura 5: Cuantificaciones de la grasa intramuscular. (A) Imagen representativa de cómo contar los adipocitos PERILIPIN+ (blanco) utilizando la función Contador Celular en ImageJ. Barra de escala: 50 μm. (B) Cuantificaciones de adipocitos TA enteros 21 días después de la inyección de glicerol normalizadas a 1 mm2 del área lesionada. Cada punto representa el promedio de un ratón. Barras de error mostradas como SEM. **** = p &lt; 0,0001. (C) La capa de ARN después de la homogeneización y la posterior separación de fases por cloroformo se está utilizando para el análisis RT-qPCR. (D) Cambios en los niveles de expresión de Pparg y Cepbα, genes adipogénicos tempranos, y Plin1 y Adipoq, dos marcadores de adipocitos maduros, en diferentes puntos de tiempo después de la lesión por glicerol. Cada punto representa el promedio de un ratón. Barras de error que se muestran como SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig5v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para confirmar de forma independiente la cantidad de grasa intramuscular presente, se pueden determinar los niveles de expresión génica de varios marcadores adipogénicos. Para esto, el ARN se puede aislar de una porción del mismo músculo TA utilizado para la inmunofluorescencia (ver pasos arriba) en diferentes puntos después de la lesión. Se utilizó un batidor de cuentas en combinación con tiocianato de guanidio para homogeneizar el tejido. Después de agregar cloroformo seguido de centrifugación, la capa superior que contiene ARN se extrajo cuidadosamente y se utilizaron mini columnas de espín para la limpieza de ARN (Figura 5C). Este método produce rutinariamente alta calidad y cantidad de ARN adecuado para todos los análisis posteriores, como RT-qPCR y RNAseq. Para RT-qPCR, se determinaron los niveles de expresión relativos de los genes adipogénicos a los de limpieza, y se evaluaron los cambios relativos siguiendo el método ΔΔCT38. Como se describe en la Figura 5D, en comparación con el músculo TA no lesionado, la lesión por glicerol induce la expresión de marcadores adipogénicos tempranos como Pparg y Cebpα tan pronto como 3 días después de la lesión. Los marcadores maduros, como la adiponectina (Adipoq) y la perilipina (Plin1), se pueden detectar tan pronto como 5 días después de la lesión por glicerol.
Rastreo genético del linaje de los adipocitos El protocolo de tinción de adipocitos presentado aquí se puede adaptar fácilmente para incluir el rastreo genético del linaje de los FAP para mapear y seguir su destino en adipocitos. Por ejemplo, hemos demostrado previamente que la recombinación podría inducirse mediante la administración de tamoxifeno en PdgfrαCreERT2; RatonesRosa26 EYFP 2 semanas antes de la lesión, eliminando efectivamente la codificación de parada floxed y activando indeleblemente la expresión de EYFP en FAPs (Figura 6A). Logramos altas eficiencias de recombinación con el régimen de tamoxifeno presentado aquí, con ~ 75% de PDGFRα + FAPs expresando EYFP20, similar a lo que otros laboratorios han reportado 27,39,40. Demostrando que los FAP son de hecho el origen celular de la grasa intramuscular, la mayoría de los FAP se han convertido en adipocitos que expresan EYFP + PERILIPIN 7 días después de la lesión por glicerol (Figura 6B).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig6v3.jpg"> Figura 6: Trazado de linaje de FAPs. (A) Visión general esquemática de la configuración experimental. (B) Imágenes inmunofluorescentes representativas que muestran una recombinación y activación exitosas de EYFP (amarillo) dentro de los FAPs PDGFRα+ (rojo, puntas de flecha) y los adipocitos PERILIPIN+ (rojo, asteriscos). Barras de escala: 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig6v3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Detección de múltiples tipos de células Este protocolo también se puede utilizar para visualizar el compartimento miogénico. Usando anticuerpos contra PAX7 y MYOD1, las células madre musculares (MuSC) y los mioblastos, respectivamente, se pueden detectar fácilmente 5 días después de la lesión por glicerol incluso en la sección de tejido muscular fijado por PFA (Figura 7). Por lo tanto, el protocolo presentado es versátil y adaptable no solo a los adipocitos de etiqueta e imagen y a los FAPs, sino también a otros tipos de células del linaje miogénico.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig7v2.jpg"> Figura 7: Tinción inmunofluorescente de células madre musculares y mioblastos. (A) Descripción general esquemática de la configuración experimental. (B) Imágenes inmunofluorescentes representativas que muestran una tinción exitosa de células madre musculares (MuSC) (amarillo, izquierda) con PAX7 y mioblastos (amarillo, derecha) con MYOD1. LAMININ delinea las miofibras (blancas), y los núcleos están en cian. Barras de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig7v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Video suplementario 1: Renderizado 3D de FAPs. Reconstrucción tridimensional de miofibras, FAPs y núcleos teñidos para PHALLOIDIN (gris), PDGFRα (verde) y DAPI (azul), respectivamente, 21 días después de la lesión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/FAPs.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video suplementario 2: Representación 3D de grasa intramuscular. Representación volumétrica de haces de miofiber (gris, FALOIDINA) y grasa intramuscular (rojo, PERILIPINA), que ha reemplazado a una miofibra 21 días después de la lesión por glicerol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/FAT.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>

El reemplazo del tejido muscular sano con grasa intramuscular es una característica prominente de las enfermedades y afecciones humanas. Este protocolo describe cómo visualizar, visualizar y cuantificar la grasa intramuscular, lo que permite el estudio riguroso de los mecanismos subyacentes a la formación de grasa intramuscular.

Una guía para examinar la formación de grasa intramuscular y su origen celular en el músculo esquelético

Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) are mesenchymal stromal cells that play a crucial role during skeletal muscle homeostasis and regeneration. FAPs build ...

Una barrera importante en el estudio de la grasa intramuscular, un sello distintivo de la sarcopenia y las enfermedades neuromusculares, es la preservación efectiva y la posterior visualización de los adipocitos, especialmente en las secciones de tejido congelado. El protocolo preserva la morfología de los adipocitos y las secciones del músculo esquelético alineadas para una visualización y cuantificación robusta, rigurosa y reproducible de la grasa intramuscular. Nuestra línea de análisis proporciona un marco para validar intervenciones novedosas para prevenir la formación de grasa en enfermedades como la distrofia muscular de Duchenne Demostrando el procedimiento estará Connor Johnson, un técnico de investigación de mi laboratorio.Para comenzar, limpie la pierna para inyectarla con una toallita con alcohol fresco para desinfectar. Extraiga de 30 a 50 microlitros de glicerol al 50% en la jeringa de insulina. Cepille suavemente el cabello en la espinilla para exponer la ubicación de la AT. Después de localizar la AT, inserte la aguja en la TA distalmente cerca del tobillo.Inserte completamente la aguja en el músculo e inyecte lentamente glicerol, mientras retira gradualmente la aguja, lo que ayuda a lesionar la mayor parte del músculo. Rocíe generosamente cualquier área del ratón que se corte con etanol al 70% para ayudar a mantener el cabello fuera del área de disección y los instrumentos. Use tijeras para cortar la piel alrededor de la parte superior de la pierna cerca de la pelvis.Tire suavemente de la piel de la pierna desde la parte superior hasta el tobillo. Primero, retire la capa externa de tejido conectivo con pinzas de punta afilada antes de cosechar el TA. Deslice las pinzas debajo de la TA desde la parte inferior del músculo, comenzando en el tendón distal y tire suavemente hacia arriba hacia la rodilla. Deténgase en el extremo del músculo.No empuje más allá de la resistencia que se siente en la parte inferior de la rodilla. Si hay una resistencia significativa antes de llegar a la parte inferior de la rodilla, deténgase y continúe eliminando las capas sobrantes de tejido conectivo. Una vez que la AT se haya levantado parcialmente de la pierna con las pinzas, use el mismo movimiento con un bisturí para cortar la conexión de la TA con la parte inferior de la rodilla.Destripe el tendón en el tobillo con tijeras para eliminar completamente la AT. Solo maneje el músculo en el tendón para evitar dañar las fibras. Corte un tercio de la AT en el extremo, frente al tendón. Póngalo en el tubo de la micro centrífuga y congélelo dejándolo caer en nitrógeno líquido.Sumergir los otros dos tercios del tejido en un pozo marcado con 4% de PFA para histología. Asegúrese de realizar un seguimiento de cuándo se colocó el primer y último tejido en fijador. Coloque en un nutator durante dos a dos horas y media a cuatro grados centígrados.Después de la fijación, retire el PFA de los pozos. Enjuague los pañuelos con un X PBS frío dos o tres veces y luego lave dos o tres veces con 1X PBS frío durante cinco minutos por lavado. Retire el PBS de los pocillos y agregue suficiente 30% de sacarosa en 1X PBS para permitir que el tejido flote.Coloque en el nutator a cuatro grados centígrados durante la noche. Encienda el microscopio e inicie el software de imágenes. Asegure la diapositiva en el escenario.Utilice cualquier canal para identificar el área a la que se va a crear una imagen. En el software de imágenes, ajuste el tiempo de ganancia y exposición para cada canal. Tome imágenes de todo el tejido en cada canal y fusione mosaicos individuales para hacer un compuesto de la sección transversal completa de TA.Antes de comenzar, precaliente el agua libre de RNasa a 45 grados centígrados y prepare etanol fresco al 70%. Añadir 1000 microlitros de tiocianato de guanidinio a cada tubo que contenga la muestra. Es importante que se utilicen tubos aprobados por Bead Beater.Agregue tres cuentas medianas, o una grande y una pequeña, a cada tubo. Homogeneice el tejido a 50 Hertz durante dos a cuatro minutos usando un Bead Beater. Dependiendo del tipo de tejido y el tamaño de la muestra, puede tardar hasta 10 minutos.añadir 200 microlitros de cloroformo. Agite las muestras durante 15 segundos. Incubar durante dos o tres minutos a temperatura ambiente.Centrifugar durante 15 minutos a 12.000 veces G.Pipetear 350 microlitros del sobrenadante transparente y añadir a un nuevo tubo de microcentrífuga que contiene 350 microlitros de etanol al 70%. Tenga cuidado de no aspirar las capas inferiores de proteína y/o ADN. Transfiera hasta 700 microlitros de esta mezcla a una mini columna de centrifugado colocada en un tubo de recolección de dos mililitros.Continúe con el aislamiento de ARN siguiendo las instrucciones del fabricante. Elute con 30 a 50 microlitros de agua libre de RNasa, dependiendo del rendimiento esperado. Mantenga el ARN en hielo y mida el rendimiento con un espectrofotómetro.Mantenga el ARN almacenado a menos 80 grados centígrados. Utilice hasta un microgramo de ARN para sintetizar ADNc con un kit de síntesis de ADNc, siguiendo las instrucciones del fabricante. Una vez completada la carrera, agregue 80 microlitros de agua libre de RNasa.Almacene las muestras a menos 20 grados centígrados. Usando un formato de 384 pozos, agregue un microlitro de imprimación al fondo de cada pozo. Las imprimaciones de secado libre dan como resultado réplicas técnicas más ajustadas.Dejar tapado hasta que los cebadores se hayan evaporado por completo. Configure reacciones de muestra con cuatro a ocho réplicas técnicas. Una vez completada la ejecución de PCR, normalice los valores umbral del ciclo bruto a los niveles de genes de limpieza y determine los cambios de pliegue mediante el cálculo de delta-delta Ct.La perilipina y los adipocitos positivos de los AATT no fijos han alterado significativamente la morfología en comparación con las secciones fijas, lo que hace que su identificación, visualización y una cuantificación posterior sean mucho más difíciles y potencialmente inexactas.Por el contrario, la fijación de PFA preserva la morfología de los adipocitos, lo que permite una detección precisa de la grasa intramuscular. En comparación con el músculo TA no lesionado, la lesión por glicerol induce la expresión de marcadores adipogénicos tempranos, como PPAR gamma y CEBP alfa tan pronto como tres días después de la lesión. Los marcadores maduros como la adiponectina y la perilipina se pueden detectar tan pronto como cinco días después de la lesión por glicerol.Utilizando el rastreo genético del linaje, la mayoría de los FAP alfa del receptor PDGF expresan el marcador de linaje EYFP. Siete días después de la lesión por glicerol, los FAP positivos para EYFP se han convertido en perilipina EYFP positiva que expresa adipocitos, lo que demuestra que los FAP son de hecho el origen celular de la grasa intramuscular. El protocolo también se puede adaptar para visualizar el compartimento miogénico.Usando anticuerpos contra PAX7 y MYOD1, los marcadores de células madre y mioblastos musculares, respectivamente, se pueden detectar fácilmente cinco días después de la lesión por glicerol, incluso en secciones de tejido muscular fijo de PFA. Este protocolo también se puede adaptar para visualizar y cuantificar adipocitos y otros tejidos adultos. Además, nuestra técnica de preservación de tejidos es compatible con la variedad de diferentes técnicas de pie.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Los principales tipos de células adherentes derivadas del músculo humano son las células miogénicas y los fibroblastos. Aquí, las poblaciones celulares se enriquecen mediante la clasificación de células activadas magnéticamente basadas en el antígeno CD56. El posterior inmunomarcaje con anticuerpos específicos y el uso de técnicas de análisis de imagen permiten cuantificar las características citoplasmáticas y nucleares de las células individuales.

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

Debido a la conexión drástico y negativo entre la obesidad y otras comorbilidades, la investigación sobre el papel adiposo desempeña en la enfermedad y la salud en general se justifica. Se presenta un protocolo para el aislamiento y la escisión de los depósitos de tejido adiposo que permitan el estudio de tejido adiposo usando in situ y métodos in vitro.

Localización, identificación y Escisión de depósitos adiposos murino

Los adipocitos existen en depósitos discretos y tienen diversos roles dentro de sus microambientes únicos. A medida que se descubren las diferencias regionales en el carácter y la función de los adipocitos, la identificación y el aislamiento estandarizados de los depósitos es crucial para el avance del campo. Aquí, presentamos un protocolo detallado para la escisión de varios depósitos adiposos de ratón.

Identificación y disección de diversos depósitos de adipose de ratón

La creciente evidencia indica que la infiltración excesiva de lípidos dentro del músculo esquelético resulta en lipotoxicidad y diabetes. Aquí, presentamos un protocolo completo, que incluye procesamiento de tejidos, tinción con Bodipy, adquisición de imágenes y análisis, para cuantificar el tamaño, la densidad y la distribución subcelular de las gotas lipídicas de una manera específica de tipo de fibra.

Tipo de fibra y análisis subcelular específico del contenido de gotas lipídicas en el músculo esquelético

Los preadipocitos se aíslan de la fracción vascular estromal del tejido adiposo marrón interescapular de ratones recién nacidos y se diferencian en células que acumulan gotas de lípidos, expresan marcadores moleculares y muestran la morfología mitocondrial de los adipocitos marrones maduros. Estas células se analizan posteriormente mediante inmunofluorescencia y microscopía electrónica de transmisión.

Diferenciación e imagen de adipocitos marrones de la fracción vascular estromal de tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos

El presente estudio describe metodologías basadas en la descelularización para visualizar y cuantificar la deposición de tejido adiposo intramuscular (IMAT) a través del volumen muscular intacto, así como cuantificar las métricas de los adipocitos individuales que componen IMAT.

Cuantificación basada en la descelularización de la infiltración grasa del músculo esquelético

Investigamos el tejido muscular esquelético en Bos indicus y toros cruzados para explicar las diferencias en los rasgos de calidad de la carne. Se encontró que la fuerza de corte de Warner-Bratzler (WBSF) oscilaba entre 4,7 kg y 4,2 kg. Las isoformas de cadena pesada de miosina revelaron diferencias entre los animales, y el índice de fragmentación de miofibrillas proporcionó más información sobre las variaciones de sensibilidad (WBSF).

Explorando el músculo Longissimus: Desentrañando su correlación con la calidad de la carne en Bos indicus y toros cruzados

La biología del tejido adiposo intermuscular (IMAT) está en gran parte inexplorada debido a la limitada accesibilidad del tejido humano. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento de núcleos y la preparación de bibliotecas de IMAT humano congelado para la secuenciación de ARN de núcleos individuales para identificar la composición celular de este depósito adiposo único.

Aislamiento de núcleos de tejido adiposo intermuscular humano y secuenciación de ARN de núcleos individuales posteriores

En este estudio, describimos un método sencillo para realizar el análisis de Evans Blue Dye (EBD) en larvas de pez cebra.  Esta técnica es una herramienta poderosa para la caracterización de la integridad del músculo esquelético y la delineación de modelos de distrofia muscular de pez cebra, y es un método valioso para el desarrollo de nuevas terapias.

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

peces cebra son un excelente modelo para estudiar la función muscular y las enfermedades. Durante la embriogénesis temprana, el pez cebra comienza a realizar contracciones musculares regulares produciendo un comportamiento rítmico de natación, que se altera cuando el músculo se interrumpe. Aquí describimos una respuesta evocada por el tacto y un ensayo de locomoción para examinar el rendimiento de la natación como una medida de la función muscular.

Usando respuesta evocada-Touch y la locomoción ensayos para evaluar el rendimiento muscular y la función en el pez cebra

Aprende a visualizar y cuantificar grasa intramuscular en músculo esquelético mediante fijación con PFA e inyección de glicerol. Este protocolo permite estudiar el origen celular de los adipocitos en sarcopenia y distrofia muscular de Duchenne.

Una guía para examinar la formación de grasa intramuscular y su origen celular en el músculo esquelético

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