Name: Entrenamiento de resistencia ajustado a la dosis en ratones con un riesgo reducido de daño muscular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Aprende el protocolo DART para entrenamiento de resistencia ajustado a la dosis en ratones, enfocado en los músculos tibiales anteriores con estimulación del nervio ciático. Este método reduce el daño muscular y mejora la precisión del entrenamiento en estudios preclínicos.

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Este estudio fue financiado por subvenciones de Jain Foundation Inc., R03HD091648 del NICHD, una subvención piloto de AR3T bajo NIH P2CHD086843, un premio FRAP de EACPHS en Wayne State University, un paquete de inicio de la facultad de Wayne State University y un subcontrato de 1R01AR079884-01 (Peter L. Jones PI) a JAR. Este estudio también fue financiado por una subvención de investigación de la Asociación Americana de Terapia Física - Michigan (APTA-MI) a JMB, MEP y JAR. Los autores reconocen a la Dra. Renuka Roche (Profesora Asociada, Eastern Michigan University, MI) por leer críticamente el manuscrito y proporcionar comentarios. Los autores agradecen al Sr. Anselm D. Motha por sus consejos sobre impresión 3D. Los autores agradecen a los pacientes con disferlinopatías que han compartido sus historias en el sitio web de la Fundación Jain en https://www.jain-foundation.org/patient-physician-resources/patient-stories, particularmente sus experiencias con el ejercicio.

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Este artículo presenta instrucciones paso a paso sobre cómo construir un dispositivo para realizar un tipo de entrenamiento de rehabilitación de precisión llamado entrenamiento de resistencia ajustado por dosis (DART). El trabajo también describe la aplicación del dispositivo y la metodología DART en un estudio de entrenamiento para comparar el daño muscular 3 días después de un solo episodio de DART (grupo DART) con el daño 3 días después de un episodio comparable de entrenamiento isométrico (grupo ISOM).
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El ejercicio confiere numerosos beneficios para la salud en el músculo esquelético (revisado en Vina et al.1). Específicamente, se sabe que el entrenamiento de resistencia progresiva (PRT), que consiste en realizar contracciones musculares contra cargas externas progresivamente mayores (por ejemplo, barras, mancuernas, circuitos de cable-polea-peso), ayuda a aumentar la masa muscular y la fuerza tanto en individuos sanos como en poblaciones de pacientes (revisado en publicaciones anteriores 2,3 ). La TRP se basa en el principio de sobrecarga, que establece que, cuando el músculo se contrae contra cargas externas progresivamente mayores, se adapta aumentando su área de sección transversal fisiológica, así como la capacidad de producción de fuerza4. Los modelos existentes de PRT en roedores incluyen subir escaleras con resistencia aplicada a la cola, co-contracción de los músculos agonistas contra la resistencia de los antagonistas, correr con un arnés pesado, un ejercicio de sentadilla provocado por una descarga eléctrica y resistir la carrera de la rueda 5,6,7,8,9,10 (revisado en publicaciones anteriores 11,12 ). Sin embargo, actualmente no existen herramientas de investigación para realizar PRT precisamente dirigida al músculo y ajustada a la dosis en ratones que se asemejen mucho a los métodos y dispositivos PRT utilizados en la investigación clínica humana y la práctica12,13. Esto limita la capacidad de los investigadores para estudiar la seguridad y eficacia de la PRT dosificada con precisión en estudios básicos y preclínicos en ratones.
Para superar esta barrera, en este estudio se desarrolla una metodología y un dispositivo PRT basados en los diseños de circuitos de cable-polea-peso empleados en equipos de entrenamiento de resistencia en gimnasios modernos14,15,16. Este método de PRT se conoce como entrenamiento de resistencia ajustado por dosis (DART), y el dispositivo se llama dispositivo DART. Además de su funcionalidad como herramienta de entrenamiento de rehabilitación de precisión, el dispositivo DART también se puede utilizar como un instrumento independiente para evaluar objetivamente el par contráctil concéntrico máximo que puede ser generado por el músculo tibial anterior (TA) en un ratón, similar a cómo se evalúa el máximo de una repetición (1RM, la carga máxima que se puede levantar / mover / presionar / poner en cuclillas con éxito solo una vez mientras se mantiene una buena forma) en humanos17, 18. El dispositivo DART también se puede acoplar con un dinamómetro isocinético personalizado o comercial para medir la fuerza tetánica isométrica máxima producida por el músculo TA en un ratón (comparable a la contracción voluntaria máxima [MVC] en humanos) y luego realizar PRT ajustada a la dosis con una resistencia que se basa en la fuerza tetánica máxima (por ejemplo, 50% de la fuerza máxima).
Este artículo describe la construcción del dispositivo DART y explica cómo se puede acoplar con un dinamómetro personalizado, que se ha descrito en publicaciones anteriores 19,20,21,22, para evaluar el par contráctil y realizar DART. El estudio también describe cómo se utilizó el dispositivo DART para comparar el daño muscular inducido por el ejercicio causado por un solo episodio de DART (4 series de 10 contracciones concéntricamente sesgadas con 50% de 1RM) con el daño causado por un episodio comparable de contracciones isométricas (4 series de 10 contracciones isométricas) en un modelo de ratón de distrofia muscular de cinturas tipo 2B (LGMD2B, o LGMDR2)23,24. El modelo de ratón que se estudió carece de una proteína llamada disferlina, que desempeña un papel importante en la protección del músculo esquelético contra el daño muscular de aparición tardía después de contracciones excéntricas perjudiciales 22,25,26,27,28,29,30 . También se ha demostrado en ratones machos deficientes en disferina que el ejercicio forzado concéntricamente sesgado no es tan dañino como el ejercicio forzado excéntricamente sesgado y que la exposición previa al entrenamiento concéntricamente sesgado ofrece protección contra lesiones de un episodio posterior de contracciones excéntricamente sesgadas22. Dado que el estudio actual se realizó para probar la viabilidad de la metodología y el dispositivo DART actuales para realizar entrenamiento de resistencia ajustado por dosis y sesgado concéntricamente, se eligieron ratones machos deficientes en disferlina para la investigación para comparar nuevos datos del dispositivo DART con datos anteriores. En futuros estudios, se incluirán ratones BLAJ hembra para estudiar el efecto del sexo como variable biológica en relación con la respuesta a DART. Se estudiaron ratones que tenían ~ 1,5 años de edad, ya que ya tienen cambios distróficos en muchos grupos musculares y, por lo tanto, modelan el estado fisiopatológico en el que podrían estar los músculos en pacientes que ya tienen debilidad muscular y desgaste y están buscando atención de rehabilitación para mantener la masa muscular y la fuerza26.

<table><tbody><tr><td>Rodamiento de bolas de cerámica AnMiao Star 608</td><td>Anmiao Star (N / A)</td> <td>AMS127</td><td>Rodamiento de rueda de alta precisión y baja fricción. Si la marca y el modelo no están disponibles comercialmente, una versión alternativa de un rodamiento de rueda 608 de baja fricción, diámetro de 8 mm, &nbsp; 22 mm de diámetro exterior, con bolas cerámicas de nitruro de silicio en carcasa de acero inoxidable 420 debería ser suficiente. El exceso de fricción en el cojinete de la rueda afectará negativamente el rendimiento del dispositivo DART y aumentará la resistencia general a las contracciones musculares.</td></tr><tr><td>Microscopio Axio Scope.A1</td><td>Carl Zeiss (Peabody, MA)</td><td>Producto #Axio Scope.A1</td><td>Microscopio de luz y fluorescencia</td></tr><tr><td>B6. A-Dysfprmd/GeneJ (también conocido como ratones BLAJ)</td><td>El Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME).&nbsp; Colonia especial mantenida por The Jain Foundation Inc. para colaboradores que estudian la disferlina.</td><td>Stock #012767</td><td>Ratones con deficiencia de disferlina que modelan la distrofia muscular de cinturas humanas tipo 2B/R2.</td></tr><tr><td>Electrodo de estimulación eléctrica neuromuscular (NMES) bipolar, transcutáneo Aparato de</td><td>Harvard, Holliston, MA</td><td>BS4 50&ndash; 6824</td><td>Electrodo para NMES.&nbsp; Si este electrodo no está disponible comercialmente, póngase en contacto con el autor correspondiente para obtener alternativas.</td></tr><tr><td>Plato de tinción Coplin</td><td>ThermoFisher (Waltham, MA)</td><td>Catálogo No. S17495</td><td>Plato/frasco de tinción para hematoxilina y eosina (H& E) tinción de secciones</td></tr><tr><td>Cura 4.4.1. Software</td><td>Ultimaker, Utrecht, Países Bajos</td><td>Ultimaker Cura 4.4.1.</td><td>Software de corte para convertir archivos de estereolitografía en archivos G-CODE</td></tr><tr><td>Almohadilla térmica de gel isotérmico Deltaphase</td><td>Braintree Scientific (Braintree, MA)</td><td>Artículo #39DP</td><td>Almohadilla térmica para proporcionar soporte térmico a los animales mientras están bajo anestesia</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Millipore Sigma (Burlington, MA)</td><td>HT110132-1L</td><td>Tinción citoplasmática rosa</td></tr><tr><td>Gorilla Super Glue</td><td>The Gorilla Glue Company (Cincinnati, OH)</td><td>Gorilla Super Glue Micro Preciso Adhesivo</td><td>de cianoacrilato para unir componentes de PLA</td></tr><tr><td>Solución de hematoxilina, branquia No.3</td><td>Millipore Sigma (Burlington, MA)</td><td>GHS332-1L</td><td>Tinción azul oscuro para núcleos</td></tr><tr><td>HM525NX criostato</td><td>ThermoFisher (Waltham, MA)</td><td>Catálogo #HM525NX</td><td>Criostato para hacer secciones congeladas de</td></tr><tr><td>toallitas de laboratorio musculares.&nbsp; Kimberly-Clark Profesional Kimtech Science Kimwipes Limpiaparabrisas para tareas delicadas, 1 capa</td><td>ThermoFisher (Waltham, MA)</td><td>Catálogo No. 06-666.&nbsp; Fabricante #34120</td><td>Toallitas de laboratorio para secar el aceite mineral del tejido muscular antes de la congelación instantánea y para otros fines.</td></tr><tr><td>Labview 2014</td><td>National Instruments, Austin, Texas, EE.UU</td>. <td>Labview 2014</td><td>Software para programas/rutinas escritas a medida que operan el dinamómetro y activan el estimulador NMES.</td></tr><tr><td>Frascos Dewar de HDPE de nitrógeno líquido</td><td>ThermoFisher (Waltham, MA)</td><td>S34074B.&nbsp; Thermo Scientific 41502000/EMD</td><td>Matraz para contener nitrógeno líquido para la congelación rápida de músculo u otro tejido</td></tr><tr><td>Crema depilatoria mágica</td><td>Softsheen Carson (Nueva York, NY)</td><td>N/A</td><td>Crema depilatoria sin afeitar</td></tr><tr><td>Pinza metálica de cocodrilo</td><td>JINSHANGTOPK (negocio basado en la web)</td><td>24 piezas Clip de cocodrilo metálico de 51 mm Abrazaderas de</td><td>resorte Abrazadera de resorte para sujetar el pin tibial</td></tr><tr><td>Diapositivas de microscopio</td><td>Globe Scientific (Mahwah, NJ)</td><td>1354W. Portaobjetos de cristal blanco diamante</td><td>Portaobjetos de microscopio cargados</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>ThermoFisher (Waltham, MA)</td><td>BP26291</td><td>Aceite mineral para crioproteger el tejido muscular antes de la congelación</td></tr><tr><td>instantánea Filamento de impresora 3D premium Monoprice PLA</td><td>Monoprice (Rancho Cucamonga, CA)</td><td>#11778</td><td>Filamento de impresora 3D premium PLA 1,75 mm 1 kg/bobina, gris. Este es el material utilizado para imprimir en 3D los componentes del dispositivo.</td></tr><tr><td>Monoprice Select Mini V2 3D</td><td>printer Monoprice (Rancho Cucamonga, CA)</td><td>Mini V2</td><td>Impresora 3D para la fabricación asistida por ordenador de componentes de dispositivos.</td></tr><tr><td>NIH Image software</td><td>National Instritues of Health (NIH, Bethesda, MD)</td><td>NIH Image for Windows</td><td>Software de procesamiento y análisis de imágenes utilizado para cuantificar el área de daño muscular.&nbsp; La imagen de los NIH también se conoce como imagen J.</td></tr><tr><td>Photoshop CS4</td><td>Adobe (San José, CA)</td><td>Creative Suite (CS4). Versión de 64 bits para Windows</td><td>Software de procesamiento y análisis de imágenes utilizado para generar imágenes en mosaico/cosidas de toda la sección transversal del músculo a partir de imágenes de campos individuales superpuestos Unidad de</td></tr><tr><td>aislamiento de estimulación PSIU6</td><td>Grass Instruments (West Warwick, RI)</td><td>Unidad</td> <td>de aislamiento PSIU6Unidad de aislamiento para NMES. Los estimuladores, como el modelo 4100 de A-M, vienen con una unidad de aislamiento de estimulación incorporada</td></tr><tr><td>Material de sutura trenzado negro de seda Roboz 4-0</td><td>Roboz Surgical (Gaithersburg, MD)</td><td>Roboz Surgical SUT152</td><td>Material de sutura para conectar la placa de pie del dispositivo DART a la placa de pie del dinamómetro o resistencia para el entrenamiento de resistencia</td></tr><tr><td>Estimulador de pulso cuadrado S48</td><td>Grass Instruments (West Warwick, RI)</td><td>Estimulador</td> <td>S48Estimulador eléctrico de laboratorio para NMES .&nbsp; Si este estimulador no está disponible comercialmente, el estimulador de alta potencia aislado modelo 4100 de los sistemas A-M podría ser una alternativa. Póngase en contacto con el coautor Jones para obtener más información.</td></tr><tr><td>Scott' s reactivo de azulado</td><td>Ricca Chemical Company (Arlington, TX)</td><td>6697-32</td><td>Solución azulada que intensifica la tinción nuclear de hematoxilina</td></tr><tr><td>SigmaStat versión 3.5</td><td>Systat Software (San José, CA)</td><td>SigmaStat versión 3.5</td><td>Paquete de software estadístico para análisis estadísticos</td></tr><tr><td>Vaporizador de isoflurano de mesa</td><td>VetEquip (Livermore, CA)</td><td>Artículo #901801</td><td>Sistema</td></tr> <tr><td>de anestesia de mesa inhaladoUngüento de primeros auxilios con triple antibiótico</td><td>Global Health Products (negocio basado en el miércoles)</td><td>Globe Ungüento antibiótico de primeros auxilios triple, 1 oz (paquete de 2) ungüento antibiótico de primeros auxilios</td><td>ungüento antibiótico aplicado en el clavo tibial como parte de la atención posterior al procedimiento</td></tr></tbody></table>

entrenamiento de resistencia ajustado a la dosis en ratones con un riesgo reducido de daño muscular

Dosage-Adjusted Resistance Training in Mice with a Reduced Risk of Muscle Damage

El entrenamiento de resistencia progresiva (PRT), que implica realizar contracciones musculares contra cargas externas progresivamente mayores, puede aumentar la masa muscular y la fuerza en individuos sanos y en poblaciones de pacientes. Se necesitan herramientas de rehabilitación de precisión para probar la seguridad y eficacia de PRT para mantener y / o restaurar la masa muscular y la fuerza en estudios preclínicos en modelos animales pequeños y grandes. La metodología y el dispositivo PRT descritos en este artículo se pueden usar para realizar entrenamiento de resistencia ajustado por dosis (DART). El dispositivo DART se puede utilizar como un dinamómetro independiente para evaluar objetivamente el par contráctil concéntrico generado por los dorsiflexores del tobillo en ratones o se puede agregar a un sistema de dinamometría isocinética preexistente. El dispositivo DART se puede fabricar con una impresora 3D estándar basada en las instrucciones y los archivos de impresión 3D de código abierto proporcionados en este trabajo. El artículo también describe el flujo de trabajo de un estudio para comparar el daño muscular inducido por la contracción causado por un solo ataque de DART con el daño muscular causado por un episodio comparable de contracciones isométricas (ISOM) en un modelo de ratón de distrofia muscular de cinturas tipo 2B / R2 (ratones BLAZ). Los datos de ocho ratones BLAJ (cuatro animales para cada condición) sugieren que menos del 10% del músculo tibial anterior (TA) se dañó por un solo ataque de DART o ISOM, siendo DART menos dañino que ISOM.

Se estudiaron ratones machos BLAZ, que tenían ~ 1.5 años de edad. Los ratones BLAJ modelan la enfermedad muscular humana, LGMD2B / R2. Estos ratones son particularmente susceptibles al daño muscular de aparición tardía de un solo episodio de contracciones musculares excéntricas22,29. Por lo tanto, se eligieron ratones BLAJ para estos estudios para saber si DART podría realizarse de manera no perjudicial ajustando con precisión la resistencia contra la cual el mús...

El presente protocolo describe una técnica única llamada entrenamiento de resistencia ajustado por dosis (DART), que puede incorporarse a estudios de rehabilitación de precisión realizados en animales pequeños, como ratones.

Entrenamiento de resistencia ajustado a la dosis en ratones con un riesgo reducido de daño muscular

Progressive resistance training (PRT), which involves performing muscle contractions against progressively greater external loads, can increase muscle ...

Este protocolo es uno de los primeros estudios que permite a los científicos realizar entrenamiento de resistencia ajustado a la dosis en ratones similar a cómo se realiza en humanos. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los investigadores ajustar con precisión la resistencia contra la que los músculos tibiales anteriores del ratón tienen que trabajar durante el entrenamiento de resistencia. Además, dado que las contracciones musculares están excéntricamente sesgadas, hay una menor probabilidad de lesión muscular inducida por la contracción.Nuestra técnica de entrenamiento de resistencia ajustada a la dosis se puede incorporar en estudios básicos y preclínicos en ratones para desarrollar intervenciones para la mejora o el mantenimiento de la masa muscular y la fuerza en una amplia gama de enfermedades. El aspecto más desafiante del protocolo es estimular con precisión la rama fibular del nervio ciático, que inerva los músculos tibiales anteriores. Para reducir la estimulación eléctrica imprecisa, ajuste la posición del electrodo y la amplitud de la estimulación hasta que un dinamómetro registre el par máximo de contracción.Para comenzar, proporcione soporte térmico al mouse utilizando una almohadilla térmica de gel isotérmico y coloque una lámpara de calor 1 metro por encima del mouse. Para preparar la piel para DART o ISOM, retire el pelaje de la extremidad posterior izquierda aplicando una crema depilatoria. Después de 2 minutos, limpie la pierna con toallitas empapadas en agua destilada para eliminar el pelaje y toda la crema residual de la piel.Desinfecte la piel con una solución de lavado de povidona yodada y etanol al 70%, luego use un hisopo de algodón limpio para aplicar un protector sobre los ojos y la piel depilada para evitar que se seque. A continuación, aplique crema de lidocaína al 5% sobre la tibia para adormecer el área. Pase una aguja hipodérmica estéril de calibre 26 de 1/2 pulgada a través de la parte más ancha de la porción proximal del hueso tibial.Una vez que el pasador estabilizador esté asegurado, sostenga la aguja con un hemostático estéril y doble la parte de plástico hasta que se rompa, luego coloque el mouse en posición supina. Asegúrese de que el ratón todavía esté conectado de forma segura al cono de la nariz para mantener la anestesia. Con un par de pinzas de punta estéril, alimente el pasador tibial en un clip de cocodrilo de metal, de modo que el extremo del pasador tibial sea sostenido por la pinza de cocodrilo.Mueva el brazo ajustable de la abrazadera de cocodrilo para asegurarse de que el pie del ratón esté colocado en la placa del dispositivo DART. Sujete el pie del ratón a la placa del dispositivo DART con cinta adhesiva de laboratorio. Asegúrese de que el pie se coloca en un ángulo de 90 grados en relación con el eje largo del hueso tibial del ratón.Coloque una aguja hipodérmica de calibre 18 de 1.5 = pulgada de largo a través de los orificios previamente perforados en el transportador del dispositivo DART para crear un tope de flexión de la planta, luego apoye la placa del pie en el tope de flexión de la planta. Para optimizar la colocación del electrodo, coloque un electrodo bipolar, transcutáneo y NMES en el aspecto inferolateral de la articulación de la rodilla del ratón. Use un estimulador eléctrico de laboratorio para aplicar pulsos individuales de 1 hertz para estimular la rama fibular del nervio ciático.Observe el tibial anterior, o el músculo abdominal y el tendón TA, en busca de evidencia de contracciones de contracción provocadas eléctricamente. Ahora, sujete la sutura a la placa del piso del dinamómetro, luego optimice la amplitud de la salida de voltaje del estimulador NMES para que NMES se limite al nervio fibular común y al músculo TA. Para configurar el estimulador para producir trenes de pulsos repetidos, ajuste los diales para la frecuencia de pulso a 125 hercios, la duración del tren a 500 milisegundos y los trenes por segundo a 1.Encienda el interruptor de palanca para repetir trenes de pulsos. Configure el estimulador para producir trenes de pulsos de 500 milisegundos de duración intercalados con 500 milisegundos de descanso entre trenes de pulsos. Mueva el tope de flexión plantar al orificio en el transportador que corresponde a 160 grados en el eje largo de la tibia.En DART, para que el músculo TA trabaje concéntricamente, aplique resistencia colgando un peso adecuado, como 5 gramos, con una sutura de seda no elástica atada a la placa del dispositivo DART. Ajusta la resistencia aplicando el 50% de peso del máximo de 1 repetición. Asegúrese de que el pie tire a través de al menos la mitad del rango activo disponible de dorsiflexión.Realice una sola sesión de entrenamiento DART que implique 1 serie de 10 repeticiones de contracciones concéntricas y 2 minutos de descanso entre las series. Para el entrenamiento ISOM, coloque el pie del ratón a 160 grados con respecto al eje largo de la tibia. Mantenga la posición estática pegando la sutura de seda a la placa del dinamómetro robótico.Realice una sola sesión de entrenamiento ISOM que involucre 4 series de 10 repeticiones a contracciones isométricas y 2 minutos de descanso entre series. Como cuidado posterior al procedimiento para ratones, tome precauciones para mantener la higiene de la extremidad posterior ejercitada y reducir el dolor en el sitio de la aguja. Los cambios histológicos en el músculo TA se estudiaron después de 3 días de entrenamiento DART o ISOM.La tinción con hematoxilina y eosina indicó que la extensión del daño muscular fue baja en los grupos DART e ISOM, pero el daño muscular fue ligeramente más obvio en el grupo ISOM. Es importante estimular específicamente las contracciones en los músculos tibiales anteriores y ajustar con precisión la resistencia contra la que estos músculos tienen que trabajar durante el entrenamiento de resistencia ajustado a la dosis. Después de este procedimiento, los investigadores podrán evaluar la tolerancia al ejercicio en forma de susceptibilidad a la fatiga y las lesiones por contracciones musculares repetidas contra la resistencia.Esta técnica se puede incorporar en una amplia variedad de aplicaciones de investigación básica y preclínica, como estudios en modelos de ratón, de enfermedades neuromusculares como distrofias musculares y modelos de ratón de lesiones deportivas.

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

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