Name: Seccionamiento del hueso temporal humano de alta velocidad para la evaluación de la patología del oído medio asociada a COVID-19 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 42 s
Description: Aprende el seccionamiento de hueso temporal humano de alta velocidad para otopatología usando microsierra con cuchillas de diamante gemelas. Este método reduce el tiempo de procesamiento de meses a días, facilitando estudios urgentes de COVID-19 en oído medio.

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Agradecemos a Mohamed Lehar por su ayuda con este proyecto. Este trabajo fue parcialmente apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (T32DC000027, NSA).

Este protocolo fue desarrollado con la aprobación del IRB (IRB00250002) y de acuerdo con las políticas institucionales para el uso de tejidos humanos y material infeccioso. Cada donante de hueso temporal proporcionó su consentimiento por escrito antes de la muerte, o el consentimiento se obtuvo póstumamente de la familia del donante. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, equipos y software utilizados en este protocolo.
1. Cosecha temporal de huesos
<ol><li>Obtener la aprobación de la junta de revisión institucional local (IRB), revisar las políticas institucionales para el uso de material humano e infeccioso, y obtener el consentimiento para la donación de tejidos antes de utilizar este protocolo.</li>
	<li>Póngase el equipo de protección personal (EPP) adecuado antes de trabajar con tejido de donantes de hueso temporal positivos para COVID-19. Asegúrese de que el EPP consista en un respirador N-95 y un protector facial (o alternativamente un sistema de purificación de aire a presión positiva), bata y dos pares de guantes. Revise las técnicas para ponerse y quitarse correctamente el EPP antes de comenzar este protocolo10.</li>
	<li>Recolecte tejido óseo temporal dentro de las 12-24 h posteriores a la muerte del donante. Si el cuerpo no está refrigerado, asegúrese de que la cosecha ocurra dentro de las 8 h posteriores a la muerte.<ol>
<li>Recolecte huesos temporales durante la autopsia utilizando el método de bloqueo de cuatro incisiones mediante osteotomo7.<ol>
<li>Después de la craneotomía, retire el cerebro y divida los nervios craneales en el canal auditivo interno bruscamente.</li>
			<li>Haga la primera incisión ósea con el osteotomo paralelo y solo medial a la porción escamosa del hueso temporal.</li>
			<li>Realice la segunda incisión ósea paralela a la primera en el borde medial del hueso temporal.</li>
			<li>Luego, haga la tercera incisión 3-4 cm anterior y paralela a la cresta petrosa.</li>
			<li>Haga la cuarta incisión aproximadamente paralela a la tercera, 2 cm posterior a la cresta petrosa. NOTA: Asegúrese de que todas las incisiones se extiendan a través de la base del cráneo.</li>
			<li>Luego, retire el hueso temporal usando una disección aguda para liberar la unión de tejido blando a lo largo del borde inferior de la muestra. Si el embalsamamiento se va a realizar después de la cosecha temporal del hueso, ate el muñón de la arteria carótida.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fijación, descalcificación y seccionamiento de tejidos
<ol><li>Coloque inmediatamente el tejido en 200-300 ml de formalina tamponada al 10% (formaldehído) para que el tejido esté completamente sumergido. Dejar el tejido en formaldehído durante un mínimo de 72 h a temperatura ambiente, cambiando las soluciones diariamente. Guarde el pañuelo en un recipiente hermético y realice cambios de solución debajo de una campana de humos mientras usa el EPP adecuado para evitar la propagación del virus. NOTA: Después del período de fijación de 72 h, los especímenes ya no necesitan ser considerados infecciosos.</li>
	<li>Use una microsierra de precisión con cuchillas de diamante gemelas para cortar cada muestra en tres secciones "gruesas" para permitir una descalcificación de tejidos más rápida. Ajuste las cuchillas de diamante gemelas a una distancia de 5 mm, de modo que la sección central del hueso temporal tenga un grosor de 5 mm. Asegúrese de que las secciones de tejido en cada extremo tengan un grosor de 3-5 mm.</li>
	<li>Coloque las secciones gruesas en 200-300 ml de solución descalcificante de ácido fórmico al 23% p/p durante 7-10 días a temperatura ambiente, hasta que el tejido esté lo suficientemente blando como para incrustar parafina. Cambie las soluciones diariamente. Verifique la descalcificación adecuada del tejido palpando la muestra, que debe sentirse suave. NOTA: La descalcificación también se puede verificar mediante rayos X.</li>
	<li>Enjuague las muestras en agua corriente del grifo durante 24 horas colocándolas en un vaso de precipitados grande debajo de un grifo corriente.</li>
	<li>Deshidratar el tejido en una serie de alcoholes de concentración creciente7. Sumergir el tejido en 100-200 ml de etanol al 70% durante 1,5 h, seguido de tres lavados en 95% y 100% etanol durante 1,5 h cada uno, respectivamente. A continuación, lavar el pañuelo 3 x 1,5 h en xileno.</li>
	<li>Incrustar las secciones gruesas en parafina, con cuatro tratamientos de 45 min cada uno.</li>
	<li>Use un criotoma para cortar secciones delgadas (10 μm). Coloque el tejido de manera que el tejido se corte en el plano axial. Corte secciones más gruesas (20 μm) si lo desea.</li>
</ol>3. Inmunohistoquímica e imágenes
<ol><li>Si se desea la tinción tradicional de hematoxilina y eosina (no descrita aquí), realice la tinción antes de montar las secciones en portaobjetosde vidrio 7.</li>
	<li>Monte las secciones en diapositivas de vidrio cargadas positivamente.</li>
	<li>Hornea los portaobjetos en una placa caliente a 60 °C durante 20 min.</li>
	<li>Coloque los portaobjetos en un soporte y sumérjalos en una solución comercial de pretratamiento que contenga un disolvente orgánico (dietanolamina en este caso) y etanol para desparafinar, rehidratar y desenmascarar el tejido. NOTA: Este paso es necesario para lograr resultados satisfactorios con inmunohistoquímica para tejido fijado en formalina e incrustado en parafina.</li>
	<li>Calentar los portaobjetos en una olla a presión a alta presión durante 20 min.</li>
	<li>Coloque los portaobjetos en una cámara humidificada y bloquee el tejido con una solución de bloqueo comercial.</li>
	<li>Sondee las secciones de tejido con el anticuerpo primario contra la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2; 1:50), la serina 2 de la proteasa transmembrana (TMPRSS2, 1:1.000) y la proteasa furina (1:250). NOTA: Los anticuerpos ACE2, TMPRSS2 y Furin se utilizan porque se cree que estas proteínas desempeñan un papel en la infectividad del SARS-CoV-211,12, y este protocolo buscó investigar los posibles mecanismos por los cuales el SARS-CoV-2 puede infectar el oído medio13.</li>
	<li>Tratar con anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con HRP (ACE2, Furin; dilución 1:100) o anticuerpo secundario anti-cabra (TMPRSS2, dilución 1:100).</li>
	<li>Contramante los portaobjetos con 70% de hematoxilina en agua.</li>
	<li>Adquiera imágenes en un microscopio de luz con una cámara digital montada. Obtenga imágenes de la mucosa del oído medio y la trompa de Eustaquio a un aumento de 20x y 10x, respectivamente.</li>
</ol>

<ol><li>Nogueira, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+otorhinolaryngology%3A+Otology%2C+laryngology+and+rhinology%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Otorhinolaryngology%22%5BJournal%5D)">A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology.</a> Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).</li>
<li>Pappas, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otology+through+the+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology-Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Otology through the ages.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).</li>
<li>Schuknecht, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otopathology%3A+The+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Auris+Nasus+Larynx%22%5BJournal%5D)">Otopathology: The past, present, and future.</a> Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).</li>
<li>Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otopathology+in+the+United+States%3A+History%2C+current+situation%2C+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives.</a> Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).</li>
<li>Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+pathology+of+high-tone+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nervous+and+Mental+Disease%22%5BJournal%5D)">Observations on the pathology of high-tone deafness.</a> Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480(1934).</li>
<li>Andresen, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+presbycusis+from+the+first+temporal+bone+laboratory+within+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States.</a> Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).</li>
<li>Schuknecht, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchuknecht%2C+H+%22Pathology+of+the+Ear%22">Pathology of the Ear</a>. , Lea and Febiger. Philadelphia, PA. (1993).</li>
<li>Chole, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labs+in+crisis%3A+Protecting+the+science--and+art--of+otopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">Labs in crisis: Protecting the science--and art--of otopathology.</a> Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).</li>
<li>Nager, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNager%2C+GT+%22Pathology+of+the+Ear+and+Temporal+Bone%22">Pathology of the Ear and Temporal Bone</a>. , Williams and Wilkins. Baltimore, MD. (1993).</li>
<li>COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE). , Available from: 
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<li>Essalmani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+roles+of+Furin+and+TMPRSS2+in+SARS-CoV-2+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity.</a> Journal of Virology. 96 (8), 0012822(2022).</li>
<li>Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACE2%2C+TMPRSS2%2C+and+Furin+expression+in+the+nose+and+olfactory+bulb+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Rhinology%22%5BJournal%5D)">ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans.</a> Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).</li>
<li>Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+virus+isolated+from+the+mastoid+and+middle+ear%3A+Implications+for+COVID-19+precautions+during+ear+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Otolaryngology+-+Head+%26+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery.</a> JAMA Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).</li>
<li>Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+decalcification+of+human+temporal+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Microwave decalcification of human temporal bones.</a> Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).</li>
<li>Stephenson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+location+of+Na%2B%2C+K%2B-ATPase+%CE%B11+subunit+in+the+human+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear.</a> Hearing Research. 400, 108113(2021).</li>
<li>McCall, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extralabyrinthine+manifestations+of+DFNA9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Extralabyrinthine manifestations of DFNA9.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).</li>
<li>Wu, P. Z., O'Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+hearing+loss+is+dominated+by+damage+to+inner+ear+sensory+cells%2C+not+the+cellular+battery+that+powers+them%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).</li>
<li>Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+26+immunohistochemistry+in+temporal+bones+with+cochlear+otosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+%26+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis.</a> Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).</li>
<li>Lopez, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+techniques+for+the+human+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical techniques for the human inner ear.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

La investigación del hueso temporal humano es fundamental para estudiar la patología del oído interno y medio, pero sigue siendo un esfuerzo que requiere mucho tiempo y recursos. Este artículo describe una técnica que utiliza una microsierra de diamante para generar secciones gruesas de hueso temporal que se pueden descalcificar rápidamente antes de seccionar más, de modo que el tiempo desde la cosecha de tejido hasta el estudio se puede reducir de 9-10 meses a 10-14 días. Esta técnica puede reducir los recursos necesari...

La investigación del hueso temporal humano proporciona un recurso invaluable para estudiar la patología y la fisiopatología del oído interno y medio. Antes del siglo 19, poco se sabía con respecto a la enfermedad otológica 1,2,3. Para comprender mejor la enfermedad otológica y "rescatar la cirugía auditiva de las manos de los charlatanes", Joseph Toynbee (1815-1866) desarrolló métodos para estudiar secciones histológicas del hueso temporal humano3. Este trabajo fue promovido por Adam Politzer (1835-1920) en Viena y otros en toda Europa durante el resto del siglo XIX, quien utilizó secciones de hueso temporal para describir la histopatología de muchas afecciones comunes que afectan el oído 2,3,4.
El primer laboratorio de hueso temporal humano en los Estados Unidos se abrió en 1927 en el Hospital Johns Hopkins, donde Stacy Guild (1890-1966) desarrolló métodos para la seccionamiento del hueso temporal 5,6. Los métodos desarrollados por Guild consistieron en un proceso de 9-10 meses que incluyó la cosecha postmortem, fijación, descalcificación en ácido nítrico, deshidratación en etanol, incrustación de celoidina, seccionamiento, tinción y montaje. Las modificaciones a esta técnica fueron hechas más tarde por Harold Schuknecht (1917-1996)7; sin embargo, los componentes básicos de este proceso permanecen esencialmente sin cambios.
Los importantes recursos necesarios para mantener un laboratorio de huesos temporales han presentado un desafío para la investigación de huesos temporales y probablemente han contribuido a su disminución de popularidad en los últimos 30 años 4,8. Una parte significativa de los recursos de laboratorio de hueso temporal debe dedicarse al proceso de 9-10 meses de preparación del hueso temporal. Uno de los pasos más lentos en la preparación es la descalcificación del hueso temporal, que es el hueso más denso del cuerpo humano. La descalcificación se realiza típicamente en ácido nítrico o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y toma semanas o meses mientras requiere el cambio frecuente de soluciones 7,9. Además, los estudios sensibles al tiempo del oído humano, como los relacionados con la pandemia de COVID-19, pueden verse obstaculizados por este lento proceso de preparación. Este artículo describe una técnica para la seccionamiento óseo temporal de alta velocidad que utiliza una microsierra de diamante para generar secciones gruesas que permiten una rápida descalcificación y análisis de tejidos dentro de los 10-14 días posteriores a la cosecha temporal de huesos.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpo anti-ACE-2 (dilución aplicada 1:50)</td><td>Novus Biologicals</td><td>SN0754</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-furina (dilución 1:250)</td><td>Abcam</td><td>EPR 14674</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-TMPRSS2 (dilución 1:1.000)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-20984</td><td></td></tr><tr><td>BX43 Microscopio de sistema manual</td><td>Olympus Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solutions Oblea híbrida CBN/Diamond Blade</td><td>Pace Technologies</td><td>WB-007GP</td><td></td></tr><tr><td>Collin Mallet - 8'</td><td>'Surgical Mart</td><td>SM1517</td><td></td></tr><tr><td>DS-Fi3 Cámara de microscopio Nikon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual Endogenous Enzyme Block (solución de bloqueo comercial)</td><td>Dako</td><td>S2003</td><td></td></tr><tr><td>Eaosin Stain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>548-24-3</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formalina, neutro 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Formical-4 Descalcificador (solución descalcificante de ácido fórmico)</td><td>StatLab</td><td>1214-1 GAL</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina Tinción</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9627</td><td></td></tr><tr><td>HRP-Anticuerpo secundario anti-conejo conjugado (dilución 1:100)</td><td>Leica Biosystems</td><td>PV6119</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS HRP Kit de detección de igG anticabra para caballos, peroxidasa (1:100 dilución)</td><td>Vector Laboratories</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>Lambotte Osteotomo</td><td>Surgical Mart</td><td>SM1553</td><td></td></tr><tr><td>Sierra de precisión metalográfica PICO 155P</td> Microsierra <td>Pace Technologies</td><td>PICO 155P</td><td>Microsierra</td></tr><tr><td>NIS Elements Software versión 4.6</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3683</td><td>parafina</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio con carga positiva con extremo esmerilado blanco Walter</td><td>Products</td><td>1140B15</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome</td><td>New Life Scientific Inc.</td><td>A78900104</td><td>criotomo</td></tr><tr><td>Triology Solución de pretratamiento (solución de pretratamiento comercial)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>920P-05</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>920P-05</td><td></td></tr></tbody></table>

seccionamiento del hueso temporal humano de alta velocidad para la evaluación de la patología del oído medio asociada a covid-19

High-Speed Human Temporal Bone Sectioning for the Assessment of COVID-19-Associated Middle Ear Pathology

El análisis histopatológico de las secciones del hueso temporal humano es una técnica fundamental para el estudio de la patología del oído interno y medio. Las secciones de hueso temporal se preparan mediante la extracción de hueso temporal postmortem, fijación, descalcificación, incrustación y tinción. Debido a la densidad del hueso temporal, la descalcificación es un proceso lento y que requiere muchos recursos; La preparación completa del tejido puede tomar de 9 a 10 meses en promedio. Esto ralentiza la investigación de la otopatología y dificulta los estudios sensibles al tiempo, como los relevantes para la pandemia de COVID-19. Este artículo describe una técnica para la preparación rápida y la descalcificación de las secciones del hueso temporal para acelerar el procesamiento de los tejidos.
Los huesos temporales se cosecharon post mortem utilizando técnicas estándar y se fijaron en formalina al 10%. Se utilizó una microsierra de precisión con cuchillas de diamante gemelas para cortar cada sección en tres secciones gruesas. Las secciones gruesas del hueso temporal se descalcificaron en solución descalcificante durante 7-10 días antes de incrustarse en parafina, se seccionaron en secciones delgadas (10 μm) con un criotoma y se montaron en portaobjetos sin carga. Las muestras de tejido se desparafinaron y rehidrataron para la tinción de anticuerpos (ACE2, TMPRSS2, Furin) y se tomaron imágenes. Esta técnica redujo el tiempo desde la cosecha hasta el análisis de tejidos de 9-10 meses a 10-14 días. La seccionamiento del hueso temporal de alta velocidad puede aumentar la velocidad de la investigación de la otopatología y reducir los recursos necesarios para la preparación de tejidos, al tiempo que facilita estudios sensibles al tiempo como los relacionados con COVID-19.

La tinción de hematoxilina y eosina de la mucosa del oído medio y la trompa de Eustaquio mostró la preservación de la mucosa del oído medio y el tejido submucoso del oído medio después del procesamiento (Figura 1). Las imágenes inmunohistoquímicas mostraron la expresión de las proteínas ACE2, TMPRSS2 y Furina dentro de la mucosa del oído medio y la trompa de Eustaquio (Figura 1). La presencia de estas proteínas dentro del oído medio proporciona una posible ruta ...

Este artículo describe una técnica para la seccionamiento rápido del hueso temporal humano que utiliza una microsierra con cuchillas de diamante gemelas para generar rodajas delgadas para la descalcificación rápida y el análisis de la inmunohistoquímica del hueso temporal.

Seccionamiento del hueso temporal humano de alta velocidad para la evaluación de la patología del oído medio asociada a COVID-19

Histopathologic analysis of human temporal bone sections is a fundamental technique for studying inner and middle ear pathology. Temporal bone sections ...

Este protocolo reduce el tiempo para el procesamiento del hueso temporal de 9 a 10 meses a 10 a 14 días. La principal ventaja de esta técnica es que permite la evaluación rápida de la otopatología, que en nuestro caso es relevante para la evaluación de la patología del oído medio asociada a COVID-19. Esta técnica puede ser particularmente útil para estudios sensibles al tiempo del hueso temporal.En el futuro, puede optimizarse aún más para su uso en el estudio de la patología del oído interno. Comience la cosecha durante la autopsia y divida los nervios craneales bruscamente en el canal auditivo interno. Haga la primera incisión ósea con el osteotomo paralelo y solo medial a la porción escamosa del hueso temporal.Luego, realice la segunda incisión ósea paralela a la primera en el borde medial del hueso temporal. Haga la tercera incisión a tres o cuatro centímetros anterior y paralela a la cresta petrosa. A continuación, haga la cuarta incisión aproximadamente paralela a la tercera a dos centímetros posterior a la cresta petrosa.Use una disección aguda para liberar el tejido blando unido a lo largo del borde inferior de la muestra y extraer el hueso temporal. Después de la cosecha, sumerja inmediatamente el tejido en 200 a 300 mililitros de formalina tamponada al 10%. Luego, coloque una microsierra de precisión con cuchillas de diamante gemelas a una distancia de cinco milímetros.Para una rápida descalcificación del tejido, corte cada muestra en tres secciones de modo que la sección central del hueso temporal tenga cinco milímetros de grosor y las de cada extremo tengan de tres a cinco milímetros de grosor. Coloque las secciones en 200 a 300 mililitros de EDTA 0.37 molar durante siete a 10 días a temperatura ambiente para ablandar. La tinción de hematoxilina y eosina de la mucosa del oído medio y la trompa de Eustaquio mostró que el tejido se conserva después del procesamiento utilizando este protocolo.Los análisis inmunohistoquímicos mostraron la presencia de ACE2, proteína serina transmembrana y proteínas furina dentro de estos tejidos, proporcionando una posible raíz para la infección por SARS-CoV2 en el epitelio respiratorio del oído medio. Es importante colocar adecuadamente el tejido óseo temporal dentro de la sierra de diamante. Las técnicas alternativas que se pueden combinar con este método incluyen inmunohistoquímica para diferentes proteínas, diferentes tinciones de tejido y transcriptómica.Esta técnica nos permitió evaluar rápidamente la presencia de las proteínas implicadas en la infección por SARS-CoV2 dentro del oído medio durante la pandemia de COVID-19.

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Investigación

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Immunology and Infection

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Extracción de la cóclea de un hueso temporal humano: un protocolo cadavérico

En este artículo, presentamos un protocolo detallado para aislar y cultivar células ciliadas cocleares primarias de ratones. Inicialmente, el órgano de Corti se diseccionó de cócleas murinas neonatales (de 3 a 5 días de edad) bajo un microscopio. Posteriormente, las células se digierieron enzimáticamente en una suspensión unicelular y se identificaron mediante inmunofluorescencia después de varios días en cultivo.

Aislamiento y cultivo de células ciliadas cocleares primarias de ratones neonatos

En este trabajo describimos una técnica para la extracción de órganos terminales vestibulares humanos en condiciones fisiológicas durante la laberintectomía y su análisis mediante inmunotinción.

Extracción de órganos terminales vestibulares en condiciones fisiológicas durante la laberintectomía

Aprende el seccionamiento de hueso temporal humano de alta velocidad para otopatología usando microsierra con cuchillas de diamante gemelas. Este método reduce el tiempo de procesamiento de meses a días, facilitando estudios urgentes de COVID-19 en oído medio.

Seccionamiento del hueso temporal humano de alta velocidad para la evaluación de la patología del oído medio asociada a COVID-19 (Video) | JoVE Journal

Seccionamiento del hueso temporal humano de alta velocidad para la evaluación de la patología del oído medio asociada a COVID-19

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