Name: Aplicación de espectroscopía Raman anti-Stokes coherente (CARS) para la mielinización de imágenes en cortes cerebrales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 8 s
Description: Aprende a aplicar espectroscopía CARS para visualizar mielina en cortes cerebrales de gerbos y ratones. Esta técnica de microscopía óptica permite combinar imágenes con inmunofluorescencia para estudiar trastornos neurológicos.

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Todos los experimentos cumplieron con todas las leyes aplicables, las pautas de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Colorado Anschutz.
1. Animales
<ol><li>Utilice ratones C57BL / 6J (stock #000664) (Mus musculus) obtenidos del Laboratorio Jackson o jerbos mongoles (Meriones unguiculatus) obtenidos originalmente de Charles River.</li>
</ol>2. Preparación del tejido
<ol><li>Para la perfusión transcárdica, sobredosis de especies de roedores de interés con pentobarbital (120 mg/kg de peso corporal) y transcárdicamente perfundirlas con solución salina tamponada con fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,76 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na2HPO 4) seguido de paraformaldehído (PFA) al4%24.<ol><li>Específicamente, abra el abdomen y la caja torácica con tijeras y mantenga la caja torácica en su lugar con pinzas hemostáticas Kelly para exponer el corazón.</li>
		<li>Inserte una aguja de 23 GA conectada a una bomba de perfusión en el ventrículo izquierdo y corte rápidamente la aurícula derecha con tijeras finas.</li>
		<li>Administre PBS a través de la bomba de perfusión y la aguja en el corazón durante 10 minutos para limpiar el cerebro y el cuerpo de sangre.</li>
		<li>Cambie la bomba de perfusión al 4% de PFA durante 10 minutos y verifique la rigidez de las extremidades y la cola para confirmar el éxito de la perfusión.</li>
	</ol></li>
	<li>Después de la perfusión, decapitar a los animales y extraer su cerebro del cráneo. Mantenga los cerebros durante la noche en 4% de PFA antes de transferirlos a PBS. Incrustar los troncos cerebrales en agarosa al 4% (en PBS) y cortar coronalmente usando un vibratomo a 200 μm de espesor.</li>
</ol>3. Tinción
<ol><li>Secciones flotantes libres de manchas para Nissl, para visualizar cuerpos celulares (1:100), en medios de anticuerpos (medios AB: tampón fosfato 0.1 M (PB: 50 mM KH 2 PO 4, 150 mM Na2HPO4), 150 mM NaCl, 3 mM Triton-X, albúmina sérica bovina al 1% (BSA)) durante 30 min a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio estándar25.<ol><li>Proteja las secciones de la luz con papel de aluminio y/o una cubierta. Las longitudes de onda de 550 nm o menos son compatibles con las imágenes CARS (Figura 1). NOTA: Si bien no esperamos que Triton-X u otros reactivos tengan un impacto en las imágenes CARS de lípidos, es posible que se justifiquen controles adicionales con medios de anticuerpos específicos.</li>
	</ol></li>
	<li>PUNTO DE PAUSA: Almacene secciones flotantes libres (mientras está protegido de la luz) en PBS hasta que se obtengan imágenes. Una vez seccionado, tome una imagen de las secciones cerebrales dentro de 2 semanas.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64013/64013fig01.jpg"> Figura 1: Las imágenes CARS se pueden combinar con imágenes inmunofluorescentes. Los gráficos muestran que las imágenes CARS ocurren en el espectro de señal roja de 660/640 nm26. Esta longitud de onda está lo suficientemente alejada del rango verde, azul o UV, lo que permite la combinación de la señal CARS con inmunofluorescencia en estos rangos. Específicamente, el gráfico también indica la excitación y emisión para Nissl marcado con fluoróforo azul, que se combinó con CARS durante la recopilación de resultados representativos para esta publicación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64013/64013fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
4. Imágenes
NOTA: La configuración láser CARS contiene un láser de fibra que proporciona el reloj de 80 MHz y un láser OPO (oscilador paramétrico óptico) con un rango sintonizable de 770-990 nm con el haz de Stokes fijado a 1031 nm, que son necesarios para recoger la señal CARS. Hay una apertura para ambos haces.
<ol><li>Antes de llevar muestras al microscopio, encienda y caliente el láser CARS durante al menos 1 hora, alinee el láser CARS y Koehler la óptica del condensador y el diafragma del microscopio para obtener imágenes CARS hacia adelante. NOTA: Este paso es crítico para el correcto funcionamiento de la microscopía CARS.<ol><li>Para la alineación espacial de los dos rayos láser (bomba y stokes), acceda a los dos PSD internos (detectores sensibles a la posición) a través de la GUI láser CARS.</li>
		<li>Logre la alineación temporal utilizando la función de retardo en la GUI láser CARS, que puede ayudar a superponer los pulsos de los dos láseres (bomba y stokes) que tienen diferentes dispersiones debido a sus diferentes longitudes de onda. Por lo tanto, tanto la superposición temporal como espacial de la bomba y los haces de stokes se realizan con la entrada del usuario a través de la GUI.</li>
		<li>Ajuste el periscopio externo (los dos últimos espejos de la configuración) para centrar los dos láseres superpuestos espacialmente en los espejos de la cabeza de escaneo del microscopio.</li>
		<li>Para una mejor detección directa de CARS no desescaneados, asegúrese de que el condensador sea Koehler (lo que significa que el condensador está centrado y enfocado en el diafragma para lograr una iluminación uniforme)</li>
	</ol></li>
	<li>Para imágenes confocales de inmunofluorescencia e imágenes CARS, ajuste el láser CARS, con detectores no escaneados (NDD) CARS directos y epi, incorporando un microscopio confocal equipado con láseres visibles para imágenes de fluorescencia (Figura 2).</li>
	<li>Coloque las secciones en una placa de cultivo con cubreobjetos (para microscopía invertida), PBS para evitar que el tejido se seque y un peso de vidrio para mantener el tejido cerca del cubreobjetos.</li>
	<li>Tome pilas z o imágenes individuales con un objetivo de agua corregido por infrarrojos de 60X, 1.2 NA, que sirve para la recolección de la señal CARS en la dirección epi y a través de un condensador de 0.55 NA en la dirección hacia adelante para obtener imágenes de áreas cerebrales como el núcleo medial del cuerpo trapezoide (MNTB).<ol><li>Tome las imágenes de CARS a aproximadamente 600 mW de bomba/sonda y 300 mW de Stokes, utilizando la GUI láser de CARS. Estos valores de potencia láser son medidos internamente por el sistema. Las potencias de ambos láseres en la ubicación de la muestra son inferiores a 25 mW y seguras para la muestra de tejido.</li>
		<li>Superponga la bomba y las vigas de Stokes espacial y temporalmente. Sintoniza el OPO a 797,2 nm. Esto produce una longitud de onda CARS de 650 nm. Debido al mayor nivel de energía, el retorno resultante al estado fundamental es anti-Stokes (azul desplazado) a la excitación.</li>
		<li>Capture la señal CARS en detectores epi o reenvíen detectores no escaneados utilizando filtros de paso de banda (640-680 nm) seguidos de la detección secuencial de la etiqueta de inmunofluorescencia (en este caso Nissl marcado con fluorescencia). NOTA: El marcador soma neuronal de Nissl no está atrapado en el filtro de paso de banda CARS 640-680 nm, lo que permite la combinación de fluorescencia e imágenes CARS en las imágenes que se presentan a continuación.</li>
		<li>El CARS y la fluorescencia no comparten PMT. Utilice estos ajustes para obtener una señal lipídica óptima para obtener imágenes selectivas de la mielinización en el área del cerebro. PRECAUCIÓN: Proteger al usuario del rayo láser</li>
	</ol></li>
	<li>Guarde las imágenes como archivos .oib, que se pueden importar a un programa de análisis de imágenes para su posterior cuantificación (Figura 3).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64013/64013fig02.jpg"> Figura 2: Diagrama del instrumento CARS que muestra los láseres CARS (flechas rojas) y la detección epi y frontal no escaneada (NDD) incorporada en un confocal de escaneo láser. En NDD hacia adelante adquirimos CARS para enlaces C-H (flechas rojas oscuras) y SHG (segunda generatioína armónica) a 515 nm (flecha naranja). En epi NDD, adquirimos CARS para enlaces C-H (flechas rojas oscuras) y autofluorescencia 2PE (emisión de dos fotones) (flecha azul claro). Secuencialmente, se pueden adquirir imágenes confocales de fluorescencia (flechas verdes para láser visible, flechas azules para detección confocal). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64013/64013fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64013/64013fig03v2.jpg"> Figura 3: CARS puede iluminar la mielina (magenta) en el tejido cerebral (tronco encefálico) al mismo tiempo que obtiene imágenes de Nissl (cian) o marcadores fluorescentes. Los dos paneles muestran resultados representativos de un cerebro de jerbo mongol (imagen única M. unguiculatus, Figura 3A, C, E) y ratón (proyección máxima de la pila z M. musculus, Figura 2B, D, F), lo que indica que esta técnica se puede usar en todas las especies. La figura 3A, B muestra Nissl en cian, C, D muestra la señal CARS en magenta, E, F combina las señales Nissl y CARS con cada panel para jerbo o mouse, respectivamente. Ambos conjuntos de imágenes muestran una sección del núcleo medial del cuerpo trapezoide (MNTB) en el tronco encefálico. Las neuronas en el MNTB reciben entradas de axones fuertemente mielinizados, que terminan en el cáliz de Held, un tipo de sinapsis gigante27. La barra de escala es de 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64013/64013fig03largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Un creciente cuerpo de literatura enfatiza el papel de la mielina en la función cerebral 13,16,21,28. Además, sabemos que el grosor de la mielinización y el patrón de mielinización pueden cambiar en varias afecciones neurológicas como la esclerosis múltiple (revisada en29), el envejecimiento (revisado en 30), el autismo20,31 y muchas otras.<sup cl...

Los potenciales de acción son la unidad básica de información en el cerebro, y la propagación del potencial de acción a través de los axones forma un pilar del procesamiento de la información 1,2,3. Las neuronas típicamente reciben entradas aferentes de múltiples otras neuronas e integran estas entradas dentro de una ventana de tiempo estrecha dada 4,5. Por lo tanto, los mecanismos de propagación potencial de los mecanismos de acción en los axones han recibido una cantidad significativa de atención por parte de los investigadores.
Cuando se propaga a través de un axón, un potencial de acción se regenera repetidamente a lo largo del axón para garantizar una propagación confiable6. En la mayoría de las neuronas de los vertebrados con mandíbula (gnatóstomos) los axones están rodeados por una vaina de mielina, que es una sustancia rica en lípidos producida por oligodendrocitos cercanos o células de Schwann, que son tipos de células gliales (revisado en 7,8). Esta vaina de mielina aísla eléctricamente el axón, reduciendo su capacitancia y permitiendo la propagación del potencial de acción de manera eficiente, rápida y con menor consumo de energía. La mielina no cubre el axón de manera uniforme, pero envuelve el axón en segmentos que tienen espacios cortos entre ellos, llamados ganglios de Ranvier (revisado en 9,10). Tanto el espesor de mielinización, que controla el nivel de aislamiento eléctrico de un axón, como el espaciamiento de los nodos de Ranvier, que controlan la frecuencia con la que se regeneran los potenciales de acción a lo largo de un axón, influyen en la velocidad de propagación del potencial de acción (revisado en11).
Existe una gran cantidad de literatura que sugiere que el espesor de la mielinización afecta la velocidad de propagación del potencial de acción en los axones12,13,14. Además, las alteraciones en la mielinización axónica pueden dar lugar a una serie de déficits del SNC 15,16,17,18,19,20,21. Por lo tanto, no es sorprendente que el enfoque de muchos esfuerzos de investigación implique la medición y caracterización de la mielinización axónica. Las mediciones del grosor de la mielina se han realizado más comúnmente con microscopía electrónica, una técnica que requiere una cantidad significativa de preparación de tejido y es difícil de usar en combinación con inmunohistoquímica. Sin embargo, también existe una técnica más rápida y sencilla para medir la mielinización axónica que se basa en la espectroscopia Raman Coherente Anti-Stokes (CARS). Un láser CARS puede ser sintonizado a varias frecuencias y cuando se sintoniza a frecuencias que son adecuadas para excitar lípidos, la mielina puede ser fotografiada sin necesidad de etiquetas adicionales22. La imagen lipídica puede combinarse con inmunohistoquímica estándar, de modo que los lípidos pueden ser fotografiados junto con varios canales fluorescentes23. La mielinización por imágenes con CARS es significativamente más rápida que la microscopía electrónica y tiene una resolución que es, aunque más baja que EM, suficiente para detectar incluso pequeñas diferencias en la mielinización en el mismo tipo de axones.

<table><tbody><tr><td><fuerte>anestésico:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL jeringa desechable con aguja 27 GA x 0.5 "</td><td>Exel int</td><td>260040</td><td></td></tr><tr><td>Fatal +</td><td>Vortech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgery:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spring Tijeras - 8mm Cutting Edge Fine</td><td>Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas estándar</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Perfusión:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehído</td><td>Fisher Chemical</td><td>SF994 (CS)</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-11</td><td></td></tr><tr><td>Kelly hemostáticos</td><td>Fine Science Tools</td><td>13019-14</td><td></td></tr><tr><td>Millipore H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Punta de aguja, <td>deslizamiento de precisión</td> de<td>23 GA x 1"</td> <td>305193</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Bomba monobase de fosfato de potasio</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>con caudal variable o equivalente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Chemical</td><td>s271-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Disección:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL vial con 4% de PFA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bochem Cuchara química Bochem 180mm</td><td>Bochem</td><td>230331000</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14063-11</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Noyes</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>15011-12</td><td></td></tr><tr><td>Par de pinzas finas (Graefe) Herramientas de</td><td>ciencia fina</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de vidrio o plástico poco profunda, aproximadamente 10" x 10"</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pinzas estándar Herramientas</td> de <td>ciencia fina</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas - Blunt</td><td>Fine Science Herramientas</td><td>14000-20</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Corte:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar, planta</td><td>RPI</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000s</td><td></td></tr><tr><td>placa de pocillo</td><td>Alkali Sci.</td><td>TPN1048-NT</td><td></td></tr><<tr><td>fuerte>Tinción:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AB Medios:</td><td></td><td></td><td>1n 1.000 mL de Millipore H2O</td></tr><tr><td>Fosfato tamponado (PB):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobase</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Fasoato de sodio Dibasic</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Albúmina sérica bovina)</td><td>Sigma ciencias de la vida</td><td>A2153-100g</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Chemical</td><td>s271-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>x100-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Nissl 435/455</td><td>Invitrogen</td><td>N21479</td><td></td></tr><tr><td>CARS:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>APE&nbsp; láser picoesmeralda</td><td>Angewandte Physik & Elektronik&nbsp; </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda GmbH (420-520 nm)</td><td>Chroma Technology</td> Filtro de paso de banda <td>HQ470/100m-2P</td><td></td></tr><tr><td>(500-530 nm)</td>Filtros de paso de banda <td>Chroma Technology</td><td>HQ515/30m-2P</td><td></td></tr><tr><td>(640-680 nm)</td><td>Chroma Technology</td><td>HQ660/40m-2P</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia de corte</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>paso largo dicroico 565 nm</td><td>Tecnología Chroma</td><td>565dcxr</td><td></td></tr><tr><td>paso largo dicroico 585 nm</td><td>Tecnología Chroma</td><td>585dcxr</td><td></td></tr> paso <tr><td>corto dicroico 750 nm</td><td>Tecnología Chroma</td><td>T750spxrxt</td><td></td></tr> plato <tr>de<td>cultivo con fondo de vidrio</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>peso del vidrio (varilla boro de 10 mm x 10 mm)</td><td>Allen Scientific Filtro</td> de emisión de paso corto multifotónico Glass Inc <td></td><td></td></tr><tr><td>680 nm</td><td>Chroma Technology</td><td>ET680sp-2p8</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aplicación de espectroscopía raman anti-stokes coherente (cars) para la mielinización de imágenes en cortes cerebrales

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

La espectroscopia Raman anti-Stokes coherente (CARS) es una técnica empleada clásicamente por químicos y físicos para producir una señal coherente de vibraciones de firma de moléculas. Sin embargo, estas firmas vibratorias también son características de las moléculas dentro del tejido anatómico como el cerebro, lo que lo hace cada vez más útil y aplicable para aplicaciones de neurociencia. Por ejemplo, CARS puede medir los lípidos mediante enlaces químicos específicamente excitantes dentro de estas moléculas, lo que permite la cuantificación de diferentes aspectos del tejido, como la mielina involucrada en la neurotransmisión. Además, en comparación con otras técnicas típicamente utilizadas para cuantificar la mielina, CARS también se puede configurar para ser compatible con técnicas inmunofluorescentes, lo que permite el etiquetado conjunto con otros marcadores como canales de sodio u otros componentes de la transmisión sináptica. Los cambios en la mielinización son un mecanismo inherentemente importante en enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple u otras afecciones neurológicas como el síndrome X frágil o los trastornos del espectro autista es un área emergente de investigación. En conclusión, CARS se puede utilizar de manera innovadora para responder preguntas apremiantes en neurociencia y proporcionar evidencia de mecanismos subyacentes relacionados con muchas afecciones neurológicas diferentes.

Una de las mayores ventajas de la microscopía CARS sobre otras técnicas es la compatibilidad con imágenes fluorescentes23. La Figura 1 muestra los espectros CARS en comparación con Nissl marcados con marcador inmunofluorescente que muestra poca o ninguna superposición en los espectros. La Figura 2 ilustra la configuración láser para CARS en combinación con microscopía confocal. La Figura 3 muestra dos imágene...

Visualizar la mielinización es un objetivo importante para muchos investigadores que estudian el sistema nervioso. CARS es una técnica que es compatible con la inmunofluorescencia que puede obtener imágenes nativas de lípidos dentro de tejidos como el cerebro que iluminan estructuras especializadas como la mielina.

Aplicación de espectroscopía Raman anti-Stokes coherente (CARS) para la mielinización de imágenes en cortes cerebrales

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

Esta técnica puede obtener imágenes de mielina en secciones de tejido cerebral. La mielinización juega un papel importante en la conducción de los potenciales de acción y la comprensión de la mielina nos ayudará a comprender la función cerebral. La principal ventaja de la técnica CARS sobre, por ejemplo, la microscopía electrónica es que CARS es una técnica de microscopía óptica, y puede combinarse fácilmente con otras imágenes de fluorescencia, como las utilizadas en inmunohistoquímica.Varias condiciones médicas se deben a alteraciones en la mielinización, por ejemplo, esclerosis múltiple, envejecimiento y autismo. Comprender estas alteraciones nos ayudará a comprender las condiciones médicas subyacentes. En este caso, el láser CARS está sintonizado para obtener imágenes de lípidos o, específicamente, enlaces CH2.En el cerebro, la mayor fuente de lípidos es la mielina. Por lo tanto, esta es una técnica para obtener imágenes de la mielina en el tejido cerebral. Debería ser posible utilizar el mismo método para otros tipos de tejido cuando las imágenes de lípidos son de interés.Ajustar y alinear el láser CARS requiere una experiencia significativa, y es mejor realizarlo un experto e

coherent-anti-stokes-raman-spectroscopy-cars-application-for-imaging

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Una combinación de tres única longitud de onda de pulso corto láser se utiliza para generar coherente de lucha contra la dispersión Raman Stokes (CARS) y el CARS doblemente resonante (DR-CARS). La diferencia entre estas señales proporciona una mayor sensibilidad de otro modo difíciles de detectar señales de Raman coherente, lo que permite imágenes de la debilidad de dispersores Raman.

Diferencial de imágenes de las estructuras biológicas con doblemente resonante coherente anti-Stokes Raman Scattering (CARS)

Fuente: Espinoza, R., et al. Imágenes de dispersión Raman estimuladas en dos colores en tiempo real del cerebro de ratón para el diagnóstico de tejidos. J. Vis. Exp. (2022).  El video muestra imágenes de dispersión Raman estimulada (SRS) de dos colores de secciones de tejido cerebral de ratón. Dos rayos láser sincronizados se dirigen a la sección del tejido para excitar vibraciones moleculares, lo que resulta en un cambio de intensidad relativa en los haces. Los lípidos y las proteínas en el...

Imágenes de dispersión Raman estimulada a dos colores del tejido cerebral de ratón

Fuente: McCullagh, E. A., et al. Aplicación coherente de espectroscopia Raman anti-Stokes (CARS) para obtener imágenes de mielinización en cortes cerebrales. J. Vis. Exp. (2022)El video demuestra imágenes de fluorescencia y espectroscopia Raman anti-Stokes coherente (CARS) para visualizar la arquitectura neuronal en el tejido cerebral de los roedores. La tinción de Nissl marca los cuerpos celulares uniéndose al ARN ribosómico, mientras que las imágenes de CARS se dirigen a la mielina rica en...

Espectroscopia Raman anti-Stokes coherente para visualizar neuronas mielinizadas en tejido cerebral de ratón

Coherente dispersión anti-Stokes Raman (CARS) microscopía basada en la vibración inherente de la molécula se adhiere permite imágenes de células vivas químicamente selectivo libre de etiquetas. Este trabajo presenta la aplicación de una técnica de microscopía complementaria en un microscopio de barrido láser estándar multifotónica basado en un femtosegundo Ti: zafiro láser y un láser de OPO.

Implementación de un sistema coherente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) en un Ti: Zafiro y OPO láser basado en Laser Standard Microscopio de Barrido

Aquí presentamos un método para preparar organotypic culturas rebanada de cerebelo de ratón y la vaina de mielina de tinción por inmunohistoquímica adecuado para investigar mecanismos de myelination y remielinización en el sistema nervioso central.

Preparación y el Immunostaining de Myelinating Organotypic rebanada cerebelosa culturas

La microscopia estimulada de la dispersión de Raman (SRS) permite la proyección de imagen selectiva, etiqueta-libre de mitades químicas específicas y se ha empleado con eficacia para las moléculas del lípido de la imagen in vivo. Aquí, proporcionamos una breve introducción al principio de la microscopía SRS y describimos métodos para su uso en el almacenamiento de lípidos por imágenes en Caenorhabditis elegans.

Imágenes Libres De Etiquetas De La Dinámica De Almacenamiento De Lípidos En Caenorhabditis elegans Usando Microscopía De Dispersión Raman Estimulada

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) es una técnica de imagen potente, no destructiva y sin etiquetas. Una aplicación emergente es la histología Raman estimulada, donde las imágenes SRS de dos colores en las transiciones Raman de proteínas y lípidos se utilizan para generar imágenes de pseudo-hematoxilina y eosina. Aquí, demostramos un protocolo para imágenes SRS de dos colores en tiempo real para el diagnóstico de tejidos.

Imágenes de dispersión Raman estimuladas en dos colores en tiempo real del cerebro del ratón para el diagnóstico de tejidos

Este artículo compara directamente la resolución, la sensibilidad y los contrastes de imagen de la dispersión Raman estimulada (SRS) y la dispersión Raman anti-Stokes coherente (CARS) integradas en la misma plataforma de microscopio. Los resultados muestran que CARS tiene una mejor resolución espacial, SRS da mejores contrastes y resolución espectral, y ambos métodos tienen una sensibilidad similar.

Comparación directa de la dispersión Raman estimulada hiperespectral y la microscopía de dispersión Raman antiespecial coherente para imágenes químicas

Presentamos un protocolo para adquirir imágenes químicas con microscopía de dispersión Raman estimulada por banda ancha (SRS). Basado en un microscopio SRS que opera con detección diferencial de bloqueo multicanal, el protocolo describe la preparación de la muestra, el ajuste del aparato SRS y la quimiometría para desenredar diferentes constituyentes de muestras químicamente heterogéneas.

Imágenes químicas multiplex basadas en microscopía de dispersión Raman estimulada por banda ancha

Utilizando una plataforma multimodal que combina modalidades de imágenes ópticas sin etiquetas, hemos desarrollado un protocolo para visualizar y cuantificar la dinámica y el metabolismo celular. A través de imágenes a través de fluorescencia multifotónica, generación de segundos armónicos y microscopía de dispersión Raman estimulada, podemos generar una visión holística del entorno celular y molecular.

Plataforma de imagen óptica multimodal para el estudio del metabolismo celular

Aprende a aplicar espectroscopía CARS para visualizar mielina en cortes cerebrales de gerbos y ratones. Esta técnica de microscopía óptica permite combinar imágenes con inmunofluorescencia para estudiar trastornos neurológicos.

Aplicación de espectroscopía Raman anti-Stokes coherente (CARS) para la mielinización de imágenes en cortes cerebrales

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