Caracterización de proteínas transmembrana de vesícula extracelular única mediante citometría de nanoflujo

La caracterización en profundidad de los vehículos eléctricos puede ser un desafío, ya que requiere múltiples instrumentos para describir parámetros individuales. La medición de estos criterios clave en una sola técnica como la citometría de nanoflujo describe múltiples subpoblaciones de EV simultáneamente. Por lo tanto, cada EV se mide individualmente identificando partículas de más de 14 nanómetros de diámetro sin etiquetas antes de determinar su fluorescencia.

Esto crea un conjunto de datos sólido al eliminar los falsos positivos. La citometría de nanoflujo se puede aplicar a EV de una variedad de fuentes, incluidas las enriquecidas con plasma, LCR y medio de cultivo. Esta técnica también se utiliza para el análisis de virus, nanopartículas lipídicas y nanomateriales.

Es importante optimizar el protocolo de etiquetado. Esto maximiza cualquier fluorescencia asociada con una partícula en comparación con cualquier fluorescencia residual que quede en el tampón. Para comenzar, encienda el instrumento, cargue Nano-Flow Profession y seleccione Start Up en el menú desplegable Sheath Flow, cargue agua en el muelle de carga y seleccione Boosting en el menú desplegable Sheath Flow.

Diluir las perlas de control de calidad de una a 100 en agua destilada en un tubo de 0,6 microlitros, y colocarlas en el muelle de carga para introducir la muestra en el sistema. Luego aumente la muestra durante 45 segundos como se demostró anteriormente para reemplazar completamente la muestra, el agua o la solución de limpieza anteriores. Mientras aumenta, ajuste la potencia del láser a la plantilla preestablecida para perlas de control de calidad a 250 nanómetros FL QC estándar.

Más tarde, para reducir la presión del sistema, seleccione la presión de muestreo en el mismo menú desplegable y establezca la presión de muestreo automático en un kilo pascal para mantener una presión constante. A continuación, inicie el análisis de un minuto seleccionando Tiempo de grabación en los controles de adquisición. Los datos se trazarán en el diagrama de puntos que muestra una escala logarítmica para la intensidad de dispersión lateral y una intensidad de fluorescencia seleccionada.

Antes de guardar el archivo, inserte el nombre del archivo y la dilución de la muestra. A continuación, seleccione descargar para retirar el tubo del muelle de carga. Reemplace las perlas de control de calidad con 150 microlitros de solución de limpieza y limpie durante más de 30 segundos seleccionando Boosting.

Usando un tubo que contenga 150 microlitros de agua, retire cualquier exceso de solución de limpieza de la punta capilar sumergiendo la punta en agua. Luego diluya las perlas de tamaño estándar de una a 100 en agua y cargue 100 microlitros en el muelle de carga. Ahora, ajuste la potencia del láser a la plantilla preestablecida, S16 EXO 68 a 155 nanómetros.

Esta configuración es tanto para el tamaño estándar como para muestras que contienen EV de menos de 200 nanómetros. Seleccione el muestreo y proceda a registrar la muestra durante un minuto. Realice la tercera medición con una muestra de agua o PBS para crear un devaluador de medición en blanco, identificando falsos positivos para su eliminación por parte del software.

Diluir las muestras de EV no marcadas en PBS a un rango de concentración de partículas adecuado de una vez de 10 a la octava a cinco veces 10 a la octava partículas por mililitro para el análisis de nFCM. Y cargue de 10 a 100 microlitros de la muestra diluida en el muelle de carga. Si se desconoce la concentración de partículas, comience con una dilución de uno a 100 de la muestra EV.

La concentración de la muestra se puede aproximar rápidamente por el tamaño del punto láser en la cámara CCD durante el impulso, o por la observación de la traza de ráfaga de eventos durante el muestreo. Una vez que la muestra cargada se haya potenciado durante 45 segundos, grabe durante un minuto y guarde el archivo como se demostró anteriormente. Después de grabar, comience a analizar estos datos, cambie de la pestaña Adquisición a la pestaña Análisis y abra los archivos NFA guardados.

Para una medición precisa de la muestra, utilice las dos mediciones estándar tomadas antes de la medición del muestreo para establecer valores para la comparación de muestras, así como el espacio en blanco. Cree la curva estándar de tamaño para la conversión de dispersión lateral a diámetro seleccionando el archivo estándar de tamaño y utilizando la herramienta definir umbral. El umbral, visible en el seguimiento de ráfaga de eventos, identifica la intensidad de señal mínima requerida para que un evento se considere significativo.

Con el umbral establecido, compruebe los parámetros del diagrama de puntos, SS-H o SS-A en el eje X y FITC-A en el eje Y. Abra la herramienta Generación de curvas estándar y seleccione S16 EXO de 68 a 155 nanómetros como plantilla de tamaño. Haga clic en Buscar picos para identificar las intensidades de dispersión del lado del pico como partículas de 68, 91, 113 o 155 nanómetros de diámetro.

Antes de cerrar la ventana, compruebe si se ha generado la curva de diámetro del lado dispersado con un valor R cercano a uno. Establezca el estándar de concentración. Seleccione el archivo guardado, haga clic en contar estándar e ingrese la concentración de partículas del estándar.

Establezca la información estándar. Seleccione el archivo de muestra EV y establezca el umbral. Seleccione el archivo en blanco y haga clic en establecer en blanco para identificar el número de falsos positivos para su eliminación del recuento de muestras.

Una vez abierta la herramienta de generación de PDF, compruebe el tamaño, la concentración y las diluciones de la muestra. Luego muestra la concentración de la muestra y la distribución del tamaño de las partículas. Después de etiquetar las muestras EV como se describe en el manuscrito, tome un microlitro de la muestra etiquetada y diluya de una a 50 en PBS en un tubo de 0.6 mililitros.

Cargue la muestra en el muelle de carga y aplique presión de refuerzo durante 45 segundos. Además, asegúrese de que los ajustes correctos del láser y que se carguen las lentes adecuadas. Ahora, cambie a la presión de muestreo y seleccione el tiempo para grabar.

Después de la adquisición de un minuto, asigne un nombre al archivo de datos y guárdelo. Descargue la muestra, reemplácela con una solución de limpieza y aumente la solución de limpieza durante más de 30 segundos antes de cargar la siguiente muestra etiquetada como se demostró anteriormente. Para la generación de PDF, aplique los mismos estándares que se demostraron anteriormente.

Solo la medida en blanco se establecerá de manera diferente. Seleccione el archivo de ejemplo y establezca el umbral. Seleccione la herramienta de acceso y use el clic izquierdo para dibujar una línea que separe la población positiva de fluorescencia.

Establezca los nombres y colores para la representación. Establezca el archivo en blanco y haga clic en establecer en blanco para identificar el número de falsos positivos para la eliminación de cada población diferente. Abra la herramienta de generación de PDF e identifique la distribución de tamaño, la concentración y el porcentaje de la subpoblación positiva de fluorescencia.

En el diagrama de puntos, cambie el eje Y para mostrar las mediciones de fluorescencia del canal verde o rojo. Establezca el espacio en blanco y genere el PDF como se demostró anteriormente. En el diagrama de puntos, establezca el eje X en FITC y el eje Y en APC.

Utilice la herramienta de cuadrante para identificar poblaciones positivas fluorescentes dobles. Establezca nombres y colores para que sean representativos, luego abra el archivo PDF y seleccione las subpoblaciones fluorescentes. Los EV derivados de C2C12 mostraron aproximadamente 50% CD9, 30% CD63 presentación y 70% de la población presentó al menos uno de los tres marcadores EV.

Los perfiles de tamaño para subpoblaciones de EV marcadas con tetraspanina mostraron un tamaño medio más grande de aproximadamente 75 a 85 nanómetros y menos de 65 nanómetros EV en comparación con la población total de partículas. Los EV derivados de SW620 mostraron aproximadamente 40% de CD9, 7% de presentación de CD63 y 42% de partículas con al menos uno de los tres marcadores. Los EV marcados con tetraspanina derivados de SW620 mostraron una distribución más normal y un diámetro mediano más grande entre 90 y 110 nanómetros con distribuciones similares entre subpoblaciones individuales positivas para tetraspanina.

El etiquetado de membrana mostró repetidamente una positividad del 80% de EV derivados de C2C12 y SW620. La intensidad de dispersión lateral se correlacionó con la intensidad de FITC en los diagramas de puntos de C2C12 y SW620. Los porcentajes positivos dobles son muy similares a los porcentajes positivos de tetraspanina.

Y el etiquetado de CD63 parece mostrar la correlación más débil con el etiquetado de membrana. Las mediciones de positividad porcentual fueron similares entre el etiquetado de anticuerpos con y sin etiquetado de membrana adicional. La intensidad media de fluorescencia para las poblaciones fluorescentes de EV derivadas de C2C12 sugirió una presentación más baja de CD63 y CD81 en comparación con los EV CD9, mientras que SW620 mostró que el uso de los tres anticuerpos proporciona una señal de fluorescencia mayor que cualquier etiqueta de anticuerpos individual En este protocolo, los marcadores comunes de EV se han marcado con fluorescencia, pero muchos de los objetivos de anticuerpos se pueden elegir para mostrar el origen de EV, la función EV, o el estado de la enfermedad.