Microtrasplante de membranas sinápticas para reactivar los receptores sinápticos humanos para estudios funcionales

Los trastornos neurodegenerativos y de salud mental son el resultado de cambios en la comunicación sináptica. Los eventos multifactoriales cambian los receptores sinápticos de maneras que no entendemos completamente. El microtrasplante de membranas sinápticas proporciona información sobre estas alteraciones.

La principal ventaja de esta técnica es la posibilidad de registrar la actividad de los receptores cerebrales nativos que trabajan en el cerebro humano y, por lo tanto, representar las enfermedades que estamos estudiando. Los receptores sinápticos son objetivos importantes para la medicina que regula la actividad eléctrica del cerebro, pero al comprender cómo cambian estos receptores, se pueden desarrollar mejores terapias que restauren su funcionalidad. Este método se ha aplicado con éxito a diferentes especies, desde insectos, peces, mamíferos, pero también se puede aplicar a receptores de membrana fuera del cerebro, por ejemplo, músculos y tumores.

Las posibilidades son amplias. Recortar las agujas de inyección es complicado. Demasiado pequeño puede prevenir la inyección de proteínas, y dos grandes pueden matar la célula.

Ayuda a usar una medición consistente, como el borde de una cuchilla de afeitar. Comience sonicando las muestras seleccionadas preparadas de la región del cerebro humano de interés tres veces en un baño con hielo húmedo flotante. Use cinco segundos ciclos cada vez y espere un minuto en hielo húmedo entre ciclos.

Coloque un microlitro de la muestra sobre el termoplástico y haga una hendidura en la superficie, si es necesario, antes de la colocación de la muestra para evitar el movimiento de la muestra. Use las perillas del manipulador que sostiene el nanoinyector para colocar la aguja y muévala hacia la muestra que se va a llenar. Una vez que la punta de la aguja esté en la muestra, mantenga presionado el botón de llenado hasta que se tome suficiente muestra.

Se requiere una muestra de aproximadamente 0,5 microlitros para 10 ovocitos. Use las perillas para mover la aguja del nanoinyector de nuevo a la posición más alta. Penetre el ovocito justo debajo de la superficie con una aguja, no más profunda, y use el pedal para inyectar la muestra.

Espere unos dos o tres segundos. Después de una inyección exitosa, la célula se expandirá. Use las perillas del manipulador para salir de la celda.

Mueva la placa de Petri para que el siguiente ovocito esté alineado con la aguja. Repita el proceso hasta que se haya inyectado el número deseado de ovocitos en el plato, luego retraiga el nanoinyector a su posición original y retire la aguja. Asegúrese de que un pocillo de ovocitos se deje sin inyectar para ser utilizado como control.

Encienda todo el equipo utilizado para el registro de corrientes de iones, luego encienda la computadora de escritorio e inicie sesión en WinEDR versión 3.9.1. Asegúrese de que el programa se está ejecutando y que el registro está establecido en Disco. Después de eso, establezca la duración de la grabación y borre la opción Simulador.

Para la sección del electrodo de voltaje, apague la compensación de capacidad negativa. Ajuste el interruptor selector de ganancia a 10 para la sección del electrodo de baño, luego ajuste el interruptor de palanca de tres posiciones, que selecciona el multiplicador de ganancia, en x1. Las luces LED indicarán la selección del multiplicador de ganancia.

Apague el selector de modo de abrazadera, coloque el control de ganancia de CC en y configure el control de ganancia en alrededor de la mitad del bucle abierto de ancho de banda completo. Establezca los comandos en 40 milivoltios, los controles de retención en negativo y el multiplicador de escala en x2. Para el electrodo de corriente, utilice el desplazamiento VE para establecer una referencia cero, antes de empalar el ovocito.

A continuación, abra el software WinEDR versión 3.9.1, vaya al menú superior y seleccione Archivo, seguido de Nuevo. Cree su propia carpeta y guarde el archivo. En el menú principal, seleccione Grabar, seguido de Grabar en disco.

Coloque los puentes de agar en los respectivos orificios circulares detrás de la cámara de grabación, conectando los pozos para los electrodos utilizados como referencia de tierra en la cámara de grabación. Agregue 1x Solución de trabajo de Ringer a la válvula de perfusión correspondiente. Abra la válvula hasta que la cámara de grabación se llene con la solución de Ringer.

Usando los manipuladores derecho e izquierdo que sostienen los electrodos, guíe las agujas de los electrodos hacia la cámara de grabación que está llena con la solución de Ringer. Compruebe la resistencia de cada electrodo poniendo a cero las perillas de desplazamiento VM y VE y, a continuación, presionando los botones de prueba del electrodo. La resistencia debe estar entre 0,5 y tres megaohmios.

Si la resistencia está fuera del rango, reemplácela usando nuevos microelectrodos. A continuación, llene la cámara de grabación con la solución de Ringer fresca. Use una pipeta de vidrio para colocar un ovocito no inyectado o microtrasplantado en el centro de la cámara de grabación.

Asegúrese de que el ovocito sea claramente visible bajo el microscopio con el lado del animal hacia arriba. Guíe el electrodo hacia la solución de Ringer hasta que toquen la membrana del ovocito. Perfore suavemente la membrana de ovocitos en el lado del animal con ambos electrodos y registre el potencial de membrana en reposo.

Active el flujo de la solución de Ringer. Usando el amplificador de abrazadera de ovocito, cambie el modo a abrazadera de voltaje lenta y ajuste el voltaje de retención a 80 milivoltios. La corriente en el monitor debe ser negativa, generalmente entre 0 y 0.4 microamperios.

Vaya a Archivo, Nuevo y, a continuación, guarde la grabación en el software para crear un nuevo archivo y guarde la grabación. Presione Grabar seguido de Grabar en disco para iniciar la grabación. Agregue información relevante al archivo mediante el cuadro de diálogo Marcar gráfico.

Aplique agonistas para la estimulación química abriendo las válvulas y perfundiéndolas en la cámara de grabación durante 15 segundos. Una vez completada la grabación, gire la abrazadera de voltaje a la posición de apagado y apague la válvula de solución de Ringer. Retire el ovocito y descarte siguiendo la política institucional para muestras de cerebro humano, luego detenga la grabación y guarde el archivo.

Guarde una copia de las grabaciones en una unidad USB. Desde allí, abra el archivo deseado para ser analizado. Para medir la respuesta máxima de AMPA y la respuesta máxima de GABA A, primero, establezca un nivel 0 o línea de base encontrando la línea roja, luego arrástrela a la corriente generada por la aplicación de Ringer o línea de base.

Una vez establecido el nivel 0, determine las medidas de respuesta arrastrando el cursor de lectura vertical verde a la parte deseada del trazador de gráficos. Se registraron corrientes iónicas de los ovocitos inyectados con las membranas de los receptores sinápticos humanos. Los receptores AMPA se activaron con 100 kainato micromolar, y los receptores GABA A con un GABA milimolar.

La coinyección de las membranas filtradas del órgano eléctrico del torpedo, rico en receptores de acetilcolina, y el CDNA que codifica para el receptor de la fila uno de GABA en el polo animal produjeron principalmente dos grupos de ovocitos, en función de sus respuestas. Un grupo de ovocitos tuvo grandes respuestas a la acetilcolina, pero ninguna respuesta a un GABA micromolar. Los ovocitos en otro grupo tuvieron respuestas nulas o bajas a la acetilcolina, pero respuestas grandes a GABA.

La imagen gráfica muestra la media más menos el error estándar de la media de la corriente máxima en el grupo uno y el grupo dos. Un ovocito en el grupo dos tenía grandes respuestas de GABA y acetilcolina, lo que sugiere la ruptura del núcleo. En consecuencia, la distribución de las respuestas se sesgó a valores bajos, como lo demuestra la diferencia entre la media y la mediana de la distribución de la corriente de membrana.

Una de las causas de los ovocitos de baja respuesta es que las membranas están siendo inyectadas y atrapadas en el núcleo del ovocito. Aquí se muestran las respuestas de GABA y kainato de ovocitos inyectados en los polos animales o vegetales con membranas sin filtrar obtenidas de un cerebro sin EA, y un cerebro con EA. Los ovocitos inyectados cerca del polo animal sin dirigirse al núcleo dieron respuestas más grandes que los ovocitos inyectados en el polo vegetal, lo que permitió el estudio de muestras de tejido con un número muy bajo de receptores.

Mientras intentas este procedimiento, monitorea siempre tu nivel de Ringer. Siempre es durante las grabaciones importantes que se te acabará, y luego usará tu resultado, y la muerte del ovocito, y la pérdida de datos muy valiosos. Siguiendo este procedimiento, podemos realizar cargas occidentales para validar la presencia de los receptores sinápticos, o proteínas de interés.

Permite medir las proporciones sinápticas de excitación global a inhibición en diferentes regiones del cerebro y diferentes trastornos cerebrales, lo que permite realizar pruebas directas sobre la predicción teórica sobre las causas de la enfermedad.