In vitro Reconstitución del citoesqueleto de actina dentro de vesículas unilamelares gigantes

Esta medida construye un modelo mínimo de la célula desprovisto de regulaciones bioquímicas complejas. La técnica utilizada puede generar un alto rendimiento de liposomas y tener altas eficiencias de encapsulación para las proteínas del citoesqueleto. Esta medida se puede aplicar a la encapsulación de una variedad de proteínas y objetos grandes como micropartículas y micro nadadores autopreparados.

Un individuo está luchando para aumentar el rendimiento del liposoma durante los primeros intentos. Se recomienda discutir regularmente la sección del manuscrito para obtener más detalles para aumentar el rendimiento. Para comenzar, prepare el tampón acuoso interno no polimerizado en un volumen total de cinco mililitros mezclando 0.1 milimolar CACL dos, 10 milimolares HEPES, un DTT milimolar, 0.5 milimolar DAPCO, 320 milimolar sacarosa y 0.2 milimolar ATP.

Prepare la mezcla de proteínas agregando proteínas al tampón interno de no polimerización a cuatro grados centígrados. Para formar una capa de actina, agregue 100 nanomolares de gelcalina, cuatro micromolares de tosalina y 2.2 micromolares VCA HEZ a la mezcla de proteínas. Como experimento de control, reemplace la mezcla de proteínas con 100 microgramos por mililitro de tinte fluorescente.

Prepare el tampón de polimerización interna acuosa en un volumen total de cinco mililitros mezclando cloruro de potasio 100 milimolar. Cuatro cloruro de magnesio milimolar, 10 HEPES, un DTT milimolar, DABCO 0,5 milimolar, ATP 10 milimolar y sacarosa 80 milimolar. Prepare el tampón final mezclando tampón interno de no polimerización y tampón de polimerización interno en una proporción de volumen de uno a uno, para producir la solución acuosa interna en un volumen total de 30 microlitros que se encapsulará dentro del liposoma.

Prepare el tampón exterior acuoso en un volumen total de 150 microlitros mezclando 10 HEPES milimolares, cloruro de potasio 50 milimolar, cloruro de magnesio dos milimolares, cloruro de calcio milimolar 0.2, ATP milimolar, un DTT milimolar, DAPCO 0.5 milimolar, 212 milimolar de glucosa y 0.1 miligramos por millolitro de tripa beta. Para preparar la mezcla de aceite lipídico, comience agregando 100 microlitros de 25 miligramos por mililitros EGGPC en un vial de vidrio. Evaporar el cloroformo con gas argón dejando una película lipídica sólida seca en el fondo del vial.

Para formar una capa de actina, agregue níquel lípido en una proporción de 10 a uno de EGGPC a níquel lípido y mezcla, antes de la evaporación del cloroformo. Añadir dos mililitros de aceite mineral. Evaporar el cloroformo y sonicar la mezcla de aceite lipídico a temperatura ambiente en un baño durante una hora, para resuspender los lípidos.

Preparar un tampón final en emulsión oleosa para preparar gotas lipídicas monocapa que contengan la proteína de interés. Comience tomando 100 microlitros de la mezcla de aceite lipídico en un tubo de plástico y agregue 10 microlitros de tampón final a la mezcla de aceite lipídico. Asegúrese de que el búfer final esté en una gota.

Usando una jeringa de vidrio, extraiga primero una pequeña cantidad de mezcla de aceite lipídico y luego la gota tampón final colocando la punta de la jeringa en la periferia de la gota para dividirla en pequeñas gotas. Aspire suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces hasta que se forme una emulsión turbia. Coloque 30 microlitros de tampón exterior en un tubo de plástico separado.

Coloque 30 microlitros de la mezcla de aceite lipídico sobre el tampón exterior y déjelo reposar durante aproximadamente 10 minutos para desarrollar una monocapa lipídica en la interfaz. Para preparar liposomas, agregue cuidadosamente 50 microlitros de la emulsión de aceite tampón final a la fase superior de aceite del tubo. Centrifugar el tubo de plástico a 100 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.

Varíe el tiempo y la velocidad de centrifugación, para optimizar la formación de liposomas. Retire con cuidado la fase oleosa con aspiración de pipeta de volumen adicional si es necesario. Asegúrese de no colocar la punta de la pipeta en el lado del tubo para evitar crear un menisco de aceite en la parte superior de la fase liposómica.

Con una pipeta nueva, corte la punta de la pipeta. Inserte lentamente la pipeta en la fase inferior restante y aspire el volumen acuoso para recoger los liposomas. Vierta 100 microlitros de tampón exterior en el pozo de una cámara de incubación.

Deposite suavemente los liposomas recolectados en el tampón exterior y luego coloque otro resbalón de cobertura en la parte superior de la cámara. Observe los liposomas con un microscopio confocal utilizando un objetivo de inmersión en aceite 63 x. Utilice líneas láser de 488, 647 y 561 nanómetros.

Observar lípidos marcados con fluorescencia, colorante fluorescente encapsulado y actina encapsulada marcada con fluorescencia respectivamente. Captura los marcos de interés y guarda las imágenes en formato TIF. Procese y analice imágenes en la imagen J.Comience abriendo el archivo TIF, utilizando el software Image J.

Ve a la imagen y, a continuación, haz clic en ajustar. Seguido del contraste de brillo, ajuste el brillo y el contraste de la imagen a la escala deseada ajustando la configuración mínima y máxima y los controles deslizantes de brillo y contraste. Haga clic en la herramienta de selección de rectángulos en la barra de herramientas y seleccione la región de interés.

Vaya a la imagen y, a continuación, haga clic en recortar para recortar el ROI. Vaya a analizar y, a continuación, haga clic en Establecer escala. En la ventana emergente, introduzca 1,0 en el campo de relación de aspecto de píxeles y establezca micrómetro como unidad de longitud.

En el campo distancia en píxeles, introduzca el ancho de la imagen en píxeles. En el campo de distancia conocida, introduzca el ancho real de la imagen en micras. Para medir el tamaño del liposoma, usando la herramienta de selección ovalada en la barra de herramientas, dibuje un círculo a lo largo del borde del liposoma.

Vaya a analizar, luego haga clic en medir, para medir el área del círculo, a partir de la cual se puede calcular el diámetro del liposoma. La generación exitosa de liposomas se verifica a través de la visualización del anillo circular delgado que es la bicapa lipídica fluorescente verde. Bajo un láser de 488 nanómetros utilizando microscopía confocal para confirmar la encapsulación del tinte fluorescente.

El ambiente interno de los liposomas debe ser uniformemente fluorescente bajo un láser de 647 nanómetros. La formación de liposomas podría ser visualizada por los delgados anillos circulares verdes. El efecto reconstituido en redes dentro de los liposomas es heterogéneo, manifestándose como estructuras de red ramificadas de filamentos de actina.

La arquitectura de la rama fue activada por la introducción del complejo ARP dos tres, que controla simultáneamente la nucleación y ramificación de los filamentos de actina, junto con VCA HEZ. Se crea una capa de actina delgada, pero densamente ramificada en la valva interna de la bicapa de liposomas que se puede visualizar como una capa fluorescente. La mezcla tampón final de audio lipídico generalmente debe bombearse hacia adelante y hacia atrás a través de una jeringa de vidrio, para evitar la introducción de burbujas de aire.

La mezcla debe ser blanquecina después del proceso. Esta técnica allanó el camino para construir un modelo mínimo de la célula, desprovisto de complejas regulaciones bioquímicas. Con este sistema de imitación celular, los investigadores pueden explorar las propiedades mecánicas y dinámicas de las proteínas del citoesqueleto, el nucleador y el motor molecular.