Name: Regeneración epitelial intestinal en respuesta a la irradiación ionizante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprende a estudiar la regeneración del epitelio intestinal tras irradiación gamma en ratones mediante trazado de linaje e histología. Este método permite analizar la activación y migración celular para comprender la recuperación tisular.

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Los autores desean agradecer al Núcleo de Investigación de Histología del Centro de Cáncer de Stony Brook por la asistencia experta con la preparación de muestras de tejido y a la División de Recursos para Animales de Laboratorio de la Universidad de Stony Brook por su asistencia con el cuidado y manejo de animales. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud DK124342 otorgadas a Agnieszka B. Bialkowska y DK052230 al Dr. Vincent W. Yang.

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Este protocolo describe un modelo de lesión por radiación robusto y reproducible. Permite el análisis preciso de los cambios en el epitelio intestinal en el transcurso de 7 días después de la lesión. Es importante destacar que los puntos de tiempo seleccionados reflejan etapas cruciales de la lesión y se caracterizan por distintas alteraciones en el intestino (fases de lesión, apoptosis, regeneración y normalización)60. Este modelo de irradiación ha sido establecido y evaluado cuidadosamente, demo...

El epitelio intestinal humano cubriría aproximadamente la superficie de la mitad de una cancha de bádminton si se colocara completamente plano1. En cambio, esta capa de una sola célula que separa a los humanos del contenido de sus intestinos se compacta en una serie de proyecciones en forma de dedos, vellosidades y hendiduras, criptas que maximizan el área de superficie de los intestinos. Las células del epitelio se diferencian a lo largo de un eje cripta-vellosidad. Las vellosidades consisten principalmente en enterocitos que absorben nutrientes, células caliciformes secretoras de moco y células enteroendocrinas productoras de hormonas, mientras que las criptas consisten principalmente en células de Paneth productoras de defensina, células madre activas y de reserva, y células progenitoras 2,3,4,5. Además, la comunicación bidireccional que estas células tienen con las células estromales e inmunes del compartimiento mesenquimal subyacente y la microbiota de la luz generan una compleja red de interacciones que mantiene la homeostasis intestinal y es crítica para la recuperación después de una lesión 6,7,8.
El epitelio intestinal es el tejido que se auto-renueva más rápidamente en el cuerpo humano, con una tasa de renovación de 2-6 días 9,10,11. Durante la homeostasis, las células madre activas en la base de las criptas intestinales (células columnares de la base de la cripta), marcadas por la expresión del receptor acoplado a proteína G 5 rico en leucina (LGR5), se dividen rápidamente y proporcionan células progenitoras que se diferencian en todos los demás linajes epiteliales intestinales. Sin embargo, debido a su alta tasa mitótica, las células madre activas y sus progenitores inmediatos son particularmente sensibles a la lesión por radiación gamma y sufren apoptosis después de la irradiación 5,12,13,14. Tras su pérdida, las células madre de reserva y las células no madre (subpoblación de progenitores y algunas células terminalmente diferenciadas) dentro de las criptas intestinales se activan y reponen el compartimiento de la cripta basal, que luego puede reconstituir las poblaciones celulares de las vellosidades y, por lo tanto, regenerar el epitelio intestinal15. Utilizando técnicas de rastreo de linaje, múltiples grupos de investigación han demostrado que las células madre de reserva (quiescentes) son capaces de apoyar la regeneración tras la pérdida de células madre activas 13,16,17,18,19,20,21,22. Estas células se caracterizan por la presencia del oncogén de la proteína 1 del complejo polycomb (Bmi1), el gen de la transcriptasa inversa de la telomerasa de ratón (mTert), el homeobox del lúpulo (Hopx) y el gen de la proteína 1 de repetición rica en leucina (Lrig1). Además, se ha demostrado que las células no madre son capaces de reponer las criptas intestinales tras una lesión 23,24,25,26,27,28,29,30,31. En particular, se ha demostrado que los progenitores de células secretoras y enterocitos sufren desdiferenciación tras una lesión, vuelven a células madre y apoyan la regeneración del epitelio intestinal. Estudios recientes han identificado células que expresan múltiples marcadores que poseen la capacidad de adquirir características similares a las de un tallo tras una lesión (como DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Sorprendentemente, Yu et al. demostraron que incluso las células maduras de Paneth (LYZ+) pueden contribuir a la regeneración intestinal37. Además, además de causar apoptosis de las células epiteliales intestinales y alterar la función de barrera epitelial, la irradiación resulta en disbiosis de la flora intestinal, activación de células inmunes y el inicio de una respuesta proinflamatoria, y la activación de células mesenquimales y estromales38,39.
La radiación gamma es una valiosa herramienta terapéutica en el tratamiento del cáncer, especialmente para los tumores colorrectales40. Sin embargo, la irradiación afecta significativamente la homeostasis intestinal al inducir daño a las células, lo que conduce a la apoptosis. La exposición a la radiación causa múltiples perturbaciones que ralentizan la recuperación de un paciente y se caracteriza por lesiones de la mucosa e inflamación en la fase aguda y diarrea, incontinencia, sangrado y dolor abdominal a largo plazo. Esta panoplia de manifestaciones se conoce como toxicidad por radiación gastrointestinal. Además, la progresión inducida por la radiación de la fibrosis transmural y/o la esclerosis vascular sólo puede manifestarse años después del tratamiento38,41. Simultáneamente a la lesión misma, la radiación induce una respuesta de reparación en las células intestinales que activa las vías de señalización responsables de iniciar y orquestar la regeneración42. La enfermedad del intestino delgado inducida por radiación puede originarse a partir de la radioterapia pélvica o abdominal administrada a otros órganos (como cuello uterino, próstata, páncreas, recto)41,43,44,45,46. La lesión por irradiación intestinal es, por lo tanto, un problema clínico importante, y es probable que una mejor comprensión de la fisiopatología resultante avance en el desarrollo de intervenciones para aliviar las complicaciones gastrointestinales asociadas con la radioterapia. Existen otras técnicas que permiten investigar el propósito regenerativo del epitelio intestinal aparte de la radiación. Se han desarrollado modelos murinos transgénicos y químicos para estudiar la inflamación y la regeneración posterior47. El sulfato de sodio de dextrano (DSS) induce inflamación en el intestino y conduce al desarrollo de características similares a las de la enfermedad inflamatoria intestinal48. Una combinación del tratamiento DSS con el compuesto procancerígeno azoximetano (OMA) puede resultar en el desarrollo de cáncer asociado a colitis48,49. La lesión inducida por isquemia por reperfusión es otro método empleado para estudiar el potencial regenerativo del epitelio intestinal. Esta técnica requiere experiencia y conocimientos quirúrgicos50. Además, las técnicas antes mencionadas causan diferentes tipos de lesiones que la radiación y pueden conducir a la participación de diferentes mecanismos de regeneración. Además, estos modelos consumen mucho tiempo, mientras que la técnica de radiación es bastante breve. Recientemente, los métodos in vitro que utilizan enteroides y colonoides generados a partir del intestino y el colon se han utilizado en combinación con lesiones por radiación para estudiar los mecanismos de regeneración intestinal51,52. Sin embargo, estas técnicas no recapitulan completamente el órgano que modelan53,54.
El protocolo presentado incluye la descripción de un modelo murino de lesión por radiación gamma en combinación con un modelo genético que, después del tratamiento con tamoxifeno, permite rastrear linajes originados en la población de células madre de reserva (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Este modelo utiliza una irradiación corporal total de 12 Gy, que induce una lesión intestinal lo suficientemente significativa como para activar las células madre de reserva, al tiempo que permite la investigación posterior de la capacidad regenerativa intestinal dentro de los 7 días posteriores a la lesión55.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de 1 mL</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>309659-16G Agujas reutilizables para la alimentación de animales pequeños: Recta</td><td>VWR</td><td>20068-630-27G</td><td></td></tr> <tr><td>x aguja de 1/2"</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>305109-28G x 1/2" Monoject Jeringa de insulina de 1 ml</td><td>Covidien</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1188128012-5-Ethynyl-2&prime;-deoxyuridine (EdU)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc284628A</td><td>10 mg/mL en DMSO:agua estéril (1:4 v/v), alícuota y almacenar en -20&deg; C</td></tr><tr><td>Azer Scientific&nbsp; 10% Formalina tamponada neutra</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-213-B6.129X1-GT</td><td></td></tr><tr><td>(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td><td>La cepa de laboratorio Jackson</td><td>#:006148</td><td></td></tr><tr><td>B6; 129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Strain #:010531</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina Fracción V, choque térmico</td><td>Millipore-Sigma</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>Pollo anti-GFP</td><td>Aves</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 kit de imagen, Invitrogen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10638-Aceite</td> <td>de</td></tr> <tr><td>maíz</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C8267-Cámara</td> <td>de</td></tr> <tr><td>desobstrucción</td><td>Biocare Medical</td><td>DC2012-Dimetilsulfóxido</td><td></td></tr> <tr><td>(DMSO)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>proteinasa K sin DNasa</td> sensible a la luz <td>Invitrogen</td><td></td><td>C10618H diluido 25 veces en DPBS</td></tr><tr><td>Burro anti-pollo AF647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-605-155</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-031-CV-Eosin</td><td></td></tr> Microscopio de fluorescencia <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>S176</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse 90i Luz brillante y fluoerescente, con objetivos: 10X, 20X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Medio de montaje acuoso</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Gamma Cell 40 Exactor</td><td>Best Theratronics Ltd.</td><td>-</td><td>0,759 Gy min-1</td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo AF488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-545-144</td><td></td></tr><tr><td>Solución de hematoxilina, branquia n.º 3</td><td>Millipore-Sigma</td><td>GHS332</td><td></td></tr><tr><td>HM 325 Microtomo rotativo de Thermo Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-900-668</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258, pentahidratado (bis-benzimida)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Dilución H3569</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Solución de peróxido de hidrógeno, ACS, 29-32%, Spectrum Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-603-252-Kit</td> <td>de</td></tr> <tr><td>detección de muerte celular in situ, fluoresceína (Roche)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>11684795910</td><td></td></tr><tr><td>bloqueador líquido Super PAP PEN, Mini</td><td>Fisher Scientific</td><td>DAI-PAP-S-M</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de litio (polvo/ACS certificado), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>L119-500</td><td>0,5 g/1 L dH2O</td></tr><tr><td>Jeringa Luer-Lok estéril, de un solo uso, 10 mL</td><td>VWR</td><td>89215-218-Metanol</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Productos Pharmco&nbsp; Alcohol etílico, 200 PRUEBA</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NC1675398-Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Ácido Acético ACS Grado</td><td>Capitol Scientific</td><td>AAP-281000ACSCSLT-Rabbit</td><td></td></tr> <tr><td>anti-Ki67</td><td>BioCare Medical</td><td>CRM325</td><td></td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Medio de montaje</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-262</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora-Genie de Scientific Industries para hornear portaobjetos a 65 grados</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-728-103</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio dihidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Kit de disección de acero inoxidable</td><td>VWR</td><td>25640-002</td><td></td></tr><tr><td>Microportaobjetos Superfrost Plus [tamaño: 25 x 75 x 1 mm]</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifeno</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T5648</td><td>30 mg/mL en aceite de maíz estéril, preferiblemente fresco o a corto plazo en -20°C; C, sensible a la luz</td></tr><tr><td>Tissue-Tek 24 soportes deslizantes con mango desmontable</td><td>Sakura</td><td>4465</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek&nbsp; Accu-Edge&nbsp; Cuchillas de perfil bajo</td><td>Sakura</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek&nbsp; Juego de tinción manual para portaobjetos</td><td>Sakura</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Plato de tinción, verde con tapa</td><td>Sakura</td><td>4456</td><td></td></tr><tr><td>Plato de tinción Tissue-Tek, blanco con tapa</td><td>Sakura</td><td>4457</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Casetes de procesamiento Unisette</td><td>VWR</td><td>87002-292-VWR</td><td></td></tr> <tr><td>Micro Cubreobjetos</td><td>VWR</td><td>48393-081</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher Scientific</td><td>X5P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

regeneración epitelial intestinal en respuesta a la irradiación ionizante

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

El epitelio intestinal consiste en una sola capa de células, pero contiene múltiples tipos de células terminalmente diferenciadas, que se generan por la proliferación activa de células madre intestinales ubicadas en la parte inferior de las criptas intestinales. Sin embargo, durante los eventos de lesión intestinal aguda, estas células madre intestinales activas experimentan la muerte celular. La irradiación gamma es un tratamiento contra el cáncer colorrectal ampliamente utilizado que, aunque terapéuticamente eficaz, tiene el efecto secundario de agotar el conjunto activo de células madre. De hecho, los pacientes con frecuencia experimentan síndrome de radiación gastrointestinal mientras se someten a radioterapia, en parte debido al agotamiento activo de las células madre. La pérdida de células madre intestinales activas en criptas intestinales activa un conjunto de células madre intestinales de reserva típicamente quiescentes e induce la desdiferenciación de las células secretoras y precursoras de enterocitos. Si no fuera por estas células, el epitelio intestinal carecería de la capacidad de recuperarse de la radioterapia y otros insultos tisulares importantes. Los nuevos avances en las tecnologías de rastreo de linaje permiten el seguimiento de la activación, diferenciación y migración de las células durante la regeneración y se han empleado con éxito para estudiar esto en el intestino. Este estudio tiene como objetivo representar un método para el análisis de las células dentro del epitelio intestinal del ratón después de una lesión por radiación.

El uso de irradiación corporal total (LCT) de 12 Gy en combinación con el rastreo del linaje genético murino permite un análisis exhaustivo de las consecuencias de la lesión por radiación en el intestino. Para empezar, Bmi1-CreER; Los ratonesRosa26 eYFP recibieron una sola inyección de tamoxifeno, que induce la expresión mejorada de proteína fluorescente amarilla (EYFP) dentro de una población de células madre de reserva Bmi1 + . Dos días después de la inyección de tamoxifeno, lo...

El tracto gastrointestinal es uno de los órganos más sensibles a las lesiones en los tratamientos radioterapéuticos contra el cáncer. Es simultáneamente un sistema de órganos con una de las capacidades regenerativas más altas después de tales insultos. El protocolo presentado describe un método eficiente para estudiar la capacidad regenerativa del epitelio intestinal.

Regeneración epitelial intestinal en respuesta a la irradiación ionizante

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

La irradiación gamma es un tratamiento ampliamente utilizado para el cáncer colorrectal. Y aunque es terapéuticamente eficaz, tiene efectos negativos en el tracto gastrointestinal. El protocolo presentado describe un método eficiente para estudiar la activación, diferenciación y migración de células durante la regeneración después de una lesión por radiación.Este protocolo describe un modelo de lesión por radiación robusto y reproducible. Es importante destacar que este modelo permite rastrear el destino de las células intestinales después de una lesión y, por lo tanto, proporciona una mejor comprensión de la capacidad regenerativa de una subpoblación celular específica. Esta técnica puede emplear distintos modelos animales de rastreo de linaje para estudiar el comportamiento en tiempo real y la interacción de varias subpoblaciones de células después de la lesión.Las modificaciones menores a este protocolo deberían permitir la investigación de las relaciones entre la microbiota y diferentes poblaciones de células epiteliales, estromales e inmunes tras una lesión por radiación. Para comenzar, resuspenda el polvo de tamoxifeno en aceite de maíz estéril a una concentración de 30 microgramos por microlitro. Sonicate durante tres minutos en ciclos de encendido y apagado de 30 segundos con una amplitud del 60%.Mezclar por rotación en la oscuridad durante una hora a temperatura ambiente. Luego, prepare EdU agregando DMSO estéril al polvo de EdU. Agregue 1/5 del volumen total y agregue lentamente el volumen restante de agua ultrapura estéril.Cuando esté completamente disuelto, alícuota y almacenar a 20 grados centígrados. Prepare reactivos para la recolección y fijación de tejidos, como etanol al 70% en agua, DPBS enfriado a cuatro grados centígrados, tampón fijador de Bouin y formalina tamponada al 10%. A continuación, prepare el equipo necesario, como un kit de disección de ratones, placas de Petri, una aguja de sonda de calibre 16 conectada a una jeringa de 10 mililitros y casetes histológicos.Dos días antes de la exposición a la irradiación gamma, prepare a los animales de experimentación para la inyección de tamoxifeno. Pese cada animal y calcule la dosis requerida. Desinfectar la zona abdominal con etanol al 70%.Luego, administre una dosis única de tamoxifeno por vía intraperitoneal usando una aguja de calibre 27 conectada a una jeringa de un mililitro para inducir la recombinación mediada por Cre. Observe a los animales durante las próximas 48 horas para excluir la posible toxicidad del tamoxifeno. Después de 48 horas, transfiera a los animales a la sala de irradiación.Desinfecte la cámara de muestras en el irradiador gamma con solución de etanol al 70%. Coloque la estera absorbente y los animales dentro de la cámara de muestra. Coloque la tapa y cierre la cámara.Programe el irradiador gamma para exponer a los animales a 12 irradiación corporal total gris. Luego, gire la tecla a la posición inicial y presione inicio para iniciar la exposición. Salga de la habitación para el tiempo de exposición activa.Después de que haya transcurrido el tiempo preestablecido, la máquina se detendrá automáticamente y comenzará a emitir pitidos. Apague la máquina girando la llave en la posición de parada. Abra la cámara de muestras y retire la tapa.Transfiera los animales a la jaula y desinfecte la cámara de muestras con etanol al 70%. Transfiera a los animales de regreso a la sala de alojamiento convencional y observe su condición después del tratamiento. Controle el peso de los animales todos los días.Tres horas antes de la eutanasia planificada, desinfecte el área abdominal e inyecte a los ratones por vía intraperitoneal con 100 microlitros de solución madre de EdU con una jeringa de insulina de calibre 28. Después de la eutanasia del animal, recoja los intestinos proximales en diferentes puntos de tiempo después de la irradiación. Diseccionar la parte proximal del intestino delgado y eliminar los tejidos adheridos.Enjuague el tejido con DPBS frío con una aguja de alimentación recta de calibre 16 conectada a una jeringa de 10 mililitros y fije el tejido con el tampón fijador de Bouin. Corte los intestinos abiertos longitudinalmente y enrolle los intestinos proximales utilizando la técnica de rollo suizo. Coloque los tejidos en un casete histológico en un recipiente con formalina tamponada al 10% e incube durante 24 a 48 horas a temperatura ambiente.Después de la incubación, transfiera los casetes histológicos al etanol al 70% e incruste el tejido en parafina. Después de la incrustación, coloque los casetes histológicos en hielo durante al menos una hora. Luego, corte secciones horizontales de cinco micras de espesor con un micrótomo.Transfiera las secciones de tejido a un baño de agua calentado hasta 45 grados centígrados y coloque las secciones en portaobjetos cargados. Deje que los portaobjetos se sequen en una rejilla durante la noche a temperatura ambiente. Las imágenes de hematoxilina y eosina de muestras del intestino delgado mostraron un epitelio intestinal homeostático en hora cero, seguido de la pérdida de células dentro de los compartimentos de la cripta durante la fase apoptótica.Esto fue seguido por la fase regenerativa en la que las células altamente proliferativas poblaron las criptas, lo que llevó a la fase de normalización en el día siete. El rastreo de linaje por EYFP mostró que durante la homeostasis, las células que se originan a partir de células madre de reserva positivas Bmi1 se restringieron a las posiciones más cuatro a más seis dentro de las criptas. La tinción de EdU y Ki-67 mostró homeostasis intestinal normal en ratones irradiados simuladamente, que se extiende desde las células madre activas a través de la zona de amplificación del tránsito.Durante la fase apoptótica, el número de células positivas para EYFP disminuyó, acompañado de una pérdida de células proliferativas causada por el daño por radiación. En la fase regenerativa, se observó la activación de células madre de reserva y la rápida proliferación de células positivas para Bmi1. Una mayor proliferación y migración restauró la integridad del epitelio intestinal.La tinción TUNEL mostró que las células apoptóticas están ausentes durante la homeostasis. Se observó un aumento en la tinción de TUNEL al final de la fase apoptótica. Durante la fase regenerativa, la tinción TUNEL disminuyó constantemente dentro de las criptas regeneradoras y estuvo casi ausente cuando las criptas se normalizaron.Esta técnica se puede combinar con la secuenciación de ARN, la secuenciación de ARN unicelular, la clasificación celular activada por fluorescencia o el análisis proteómico para obtener un conocimiento más profundo sobre el papel de linajes celulares específicos durante la regeneración intestinal después de una lesión. Los investigadores pueden investigar las interacciones entre la microbiota y las poblaciones de células epiteliales, estromales e inmunes en la regeneración intestinal para ampliar la comprensión de la capacidad regenerativa del epitelio intestinal.

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Investigación

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Biology

Biología

La lesión renal aguda (IRA) en los seres humanos es un problema clínico común causada por el daño a las células epiteliales que forman nefronas del riñón, y la lesión renal aguda se asocia con altas tasas de mortalidad del 50-70% 1. Tras la destrucción de las células epiteliales, las nefronas tienen una capacidad limitada de regeneración, aunque los mecanismos y las limitaciones que rigen este fenómeno se conoce bien. En este artículo de vídeo, describimos nuestra técnica de ablación láser...

La ablación con láser de la pronefros pez cebra para el Estudio de la regeneración epitelial renal

Un método eficaz para el injerto tejido de tamaño definido y constante entre planaria se describe. También se incluye una descripción de cómo la técnica de inmovilización utilizado para el trasplante se puede adaptar, en conjunción con los escudos de plomo, para la irradiación parcial de animales vivos.

La inmovilización de las planarias, irradiación parcial, y el trasplante de tejido

Presentamos un protocolo para investigar la diafonía entre Caco-2 irradiadas por rayos X y las células mononucleares de sangre periférica (PBMC). El protocolo comienza con la irradiación de Caco-2 y puesta en marcha de la cultura junto con PBMC; Posteriormente, trans epitelial resistencia eléctrica se mide regularmente durante 48 h y occidental la mancha blanca /negra en Caco-2 y PBMC.

Un método de cultura cooperación para investigar la interferencia entre rayos x irradia PBMC y células Caco-2

Aquí, presentamos un protocolo para establecer puntos finales importantes y marcadores proliferativos de pequeña lesión intestinal e hiperproliferación compensatoria utilizando un modelo de mucositis inducida por quimioterapia. Demostramos la detección de células que proliferan utilizando un marcador específico de ciclo celular y utilizando el peso intestinal pequeño, la profundidad de la cripta y la altura de las vellosidades como puntos finales.

Puntos finales importantes y marcadores proliferativos para evaluar lesiones intestinales pequeñas y adaptación utilizando un modelo de ratón de mucositis inducida por quimioterapia

Los organoides desarrollados a partir de glándulas mamarias de ratones fueron irradiados y caracterizados para evaluar rasgos epiteliales e interacciones con las células inmunitarias. Los organoides irradiados se pueden utilizar para evaluar mejor las interacciones de células celulares que pueden conducir al reclutamiento de células tumorales en tejido normal irradiado.

Crecimiento y caracterización de organoides irradiados de glándulas mamarias

El uso de cultivos organotípica tridimensionales para visualizar la morfología y los marcadores funcionales de las glándulas salivales puede proporcionar ideas novedosas sobre los mecanismos de daño tisular después de la radiación. Aquí se describe un protocolo de sección, cultura, irradiar, mancha, y la imagen de 50 – 90 μm grueso secciones de la glándula salival antes y después de la exposición a la radiación ionizante.

Tratamiento de radiación de cultivos organotípico de glándulas salivales submandibulares y parótidas modelos clave en vivo características

No se ha establecido completamente la respuesta de daño del ADN inducida por radiación activada por el haz mixto de neutrones utilizado en la terapia de captura de neutrones de boro (BNCT). Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para detectar focos inducidos por radiación (RIF) de proteínas de reparación mediante tinción de inmunofluorescencia en líneas celulares de cáncer de colon humano después de la irradiación con el haz mezclado con neutrones.

Imágenes de inmunofluorescencia de daños en el ADN y dosis de focos en células de cáncer de colon humano

Aquí, presentamos un método para obtener imágenes del intestino tras heridas inducidas por láser. Al exponer el intestino del ratón a un láser multifotónico, la pérdida de una o varias criptas se induce localmente. Al obtener imágenes repetidas del área dañada durante meses, se captura la dinámica en tiempo real de la recuperación intestinal.

Ablación láser y microscopía intravital para estudiar la remodelación intestinal

Describimos un protocolo que detalla el aislamiento de criptas colónicas murinas para el desarrollo de colonoides tridimensionales. Los colonoides establecidos se pueden diferenciar terminalmente para reflejar la composición celular del epitelio del huésped antes de recibir un desafío inflamatorio o ser dirigidos a establecer una monocapa epitelial.

Estudio de los efectos epiteliales de la inflamación intestinal in vitro en colonoides murinos establecidos

Las imágenes inmunofluorescentes están limitadas por la capacidad de observar procesos biológicos complejos y dependientes del tiempo en una sola instantánea en el tiempo. Este estudio describe un enfoque de imágenes en vivo realizado en cortes de glándula submandibular de ratón cortados con precisión. Este enfoque permite la observación en tiempo real de las interacciones célula-célula durante la homeostasis y los procesos de regeneración y reparación.

Interrogación de las interacciones célula-célula en la glándula salival a través de imágenes de células vivas ex vivo

Aprende a estudiar la regeneración del epitelio intestinal tras irradiación gamma en ratones mediante trazado de linaje e histología. Este método permite analizar la activación y migración celular para comprender la recuperación tisular.

Regeneración epitelial intestinal en respuesta a la irradiación ionizante

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