Evaluación no destructiva de la densidad celular regional dentro de los agregados tumorales después del tratamiento farmacológico

Este protocolo proporciona información sobre la progresión del modelo tumoral de una manera no destructiva. También da indicaciones de respuesta terapéutica a través de regímenes farmacológicos completos dentro de agregados singulares en lugar de depender de muestras de coincidencia de edad. Los métodos convencionales para obtener densidad celular y viabilidad dentro de los agregados requieren fijación y seccionamiento de muestras, mientras que el nuestro proporciona datos de manera no destructiva.

Por lo tanto, los cambios se pueden rastrear dentro de un solo agregado a lo largo del tiempo. Se espera que esta técnica mejore nuestra comprensión de la respuesta a los medicamentos dentro de regiones discretas de modelos agregados, con implicaciones sobre qué tan bien estos modelos reflejan las respuestas in vivo y las aplicaciones de detección de drogas. Para comenzar, prepare cultivos celulares de confluencia del 70 al 90% de las líneas celulares deseadas en condiciones estándar.

Separe las monocapas celulares de sus matraces de cultivo siguiendo el método estándar de tripsinización y agregue la suspensión celular en un tubo de centrífuga. Agregue 10 microlitros de la suspensión celular a un hemocitómetro y cuente mediante microscopía para determinar el número de células en la suspensión. Células de pellets a través de centrifugación y células de resuspensión en medios a la concentración deseada de 2,5 veces 10 a la quinta célula por mililitro.

Para las suspensiones preparadas con la matriz de membrana basal, retire el vial de la matriz del almacenamiento de menos 20 grados Centígrados y colóquelo en el refrigerador para descongelarlo durante la noche. Prepare un recipiente con medios de crecimiento y refrigere durante 10 minutos para enfriar. Usando una punta de pipeta congelada, agregue la matriz a los medios refrigerados de tal manera que la concentración final de esta solución sea del 5%Agregue 50 microlitros de este medio a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo y no adherente, de modo que la concentración final de la matriz en estos pozos sea del 2.5% después de la adición de la suspensión celular.

Para suspensiones preparadas sin matriz, agregue 50 microlitros de medios de crecimiento lisos a cada pozo. Dispense 50 microlitros de suspensión celular en cada pozo. Centrifugar las placas a 123 G durante 10 minutos a temperatura ambiente inmediatamente después de la siembra para asegurar la recolección de un pellet celular en el fondo de cada pozo.

Utilice un sistema OCT para imágenes estructurales. Establezca la velocidad de escaneo A en 5,5 kilohercios para la recopilación de imágenes de alta resolución. Establezca el índice de refracción en 1,33 para muestras en un medio líquido.

En la ventana de parámetros de imagen en el lado derecho de la pantalla, establezca el campo de visión introduciendo valores X, Y y Z de modo que la muestra se incluya dentro de esta región de interés. Haga clic en Modo de adquisición 3D y luego haga clic en Grabar para recopilar el escaneo de volumen 3D de la muestra. Para crear una reconstrucción de volumen, abra Imaris y navegue hasta el archivo TIF convertido dentro de su arena.

Vaya a editar, luego haga clic en Propiedades de la imagen e ingrese el tamaño del vóxel de la imagen octostatal en los cuadros XYZ correspondientes. A continuación, haga clic en Aceptar. Haga clic en Agregar nuevas superficies encima del árbol de objetos. En el menú debajo del árbol, haga clic en Omitir creación automática y edite manualmente.

Dentro de la ventana de ajuste de la pantalla, deslice manualmente las flechas rojas y negras para mejorar el contraste entre la muestra y el fondo y mejorar la visualización de la muestra. Ajuste la posición de la rebanada a la rebanada en un borde de la muestra. Utilice la tecla de escape para cambiar el ratón del modo de navegación al modo de selección y, a continuación, haga clic en Dibujar.

Trazar manualmente el contorno de la región que muestra la señal. Avance la posición del segmento introduciendo la siguiente posición en el cuadro de entrada. Esta siguiente posición debe ser menor o igual a 100 rebanadas más en la muestra que la anterior.

Rastree manualmente la región que muestra la señal. Repita este paso a través del grosor de la muestra hasta que se alcance el borde opuesto de la muestra. Luego haga clic en Crear superficie y en el menú izquierdo para unir estas rebanadas.

Finalmente, haga clic en Editar, luego haga clic en Selección de máscara, luego haga clic en Aceptar para completar la reconstrucción del volumen. Para obtener la densidad celular total de la muestra, seleccione Agregar nuevos puntos. En el menú de configuración del algoritmo, anule la selección de todos los cuadros.

Haga clic en la flecha azul para pasar a la pantalla del canal de origen. En el menú desplegable que aparece, seleccione el Canal enmascarado. Introduzca el diámetro medio de la celda de la muestra en el cuadro diámetro XY.

Asegúrese de que la resta de fondo esté marcada. Haga clic en la flecha azul para desplazarse a la pantalla del punto de clasificación. En el gráfico de la parte inferior del menú, haga clic y arrastre el borde izquierdo del umbral amarillo hasta el borde izquierdo del gráfico, de modo que todos los objetos se incluyan en el umbral sombreado amarillo.

Luego haga clic en la flecha verde para completar la creación del spot. Obtenga el número de objetos identificados haciendo clic en Estadísticas. A continuación, haga clic en General y, por último, haga clic en Número total de puntos.

Haga clic en la superficie creada y navegue hasta la pestaña Calidad de estilo de superficies. Cambie la selección a Punto central y cambie el ancho de píxel a menos de igual a 20 para obtener la mejor visibilidad. Vaya a Estadísticas.

A continuación, haga clic en Detallado, seguido de Posición y registre la ubicación en el punto central. Seleccione Agregar nuevo marco de referencia en el menú situado encima del árbol de objetos. Marque las casillas visibles y fijas junto a la X, Y en el menú.

Haga clic y arrastre el centro del icono del marco de referencia de modo que esté en línea con el punto central. Anule la selección de los cuadros XY visible y fix y selecciónelos para XZ. Una vez más, haga clic y arrastre el centro del icono del marco de referencia de modo que esté en línea con el punto central. Por último, repita esto para el plano YZ, alternando entre estos tres planos fijos hasta que el marco de referencia se alinee perfectamente con el punto central.

Haga doble clic en el marco de referencia en el árbol de objetos y cámbiele el nombre al centro o similar. Haga clic en los lugares creados y navegue hasta Estadísticas. A continuación, haga clic en Detallado, seguido de Marco de referencia de posición.

Haga clic en el marco de referencia de la posición X hasta que se ordene de mayor a menor valor. Registre el valor más alto para obtener el radio de los agregados. Realice cálculos manuales para determinar ubicaciones adicionales de interés.

Para ello, agregue 100 micrómetros al valor del centro X y, a continuación, utilice los valores Y y Z del punto central para definir la primera ubicación a lo largo del eje central. Selecciona Añadir nuevos puntos. A continuación, seleccione Omitir edición de creación automática manualmente.

Mantenga presionado el botón mayús en el teclado y haga clic en cualquier lugar de la pantalla para colocar un nuevo lugar. Introduzca los valores de posición XYZ para la primera ubicación de interés. A continuación, seleccione Agregar nuevo marco de referencia y alinearlo sobre el punto.

Agregue 100 micrómetros a cada ubicación secuencial X. Coloque el último marco de referencia a menos de 50 micrómetros de distancia del radio exterior de la muestra. Haga clic en los lugares creados y navegue hasta Estadísticas.

En la esquina inferior derecha del menú, haga clic en Exportar todas las estadísticas a archivo y guarde los datos en una hoja de cálculo. Abre la hoja de cálculo. Desplácese hasta la ficha Distancia desde el marco de referencia de origen.

Utilice la función mod para asignar numéricamente cada distancia a su marco de referencia correspondiente. Filtre los valores de esta columna para trabajar con las distancias de cada marco de referencia. Para cada uno de los marcos de referencia, calcule el número de objetos dentro de los 50 micrómetros del marco utilizando la función COUNTIF.

El valor resultante corresponde al número de celdas en ese enchufe regional. Divida este valor por el volumen del tapón de 100 micrómetros para obtener la densidad celular. Las pruebas T de Student revelaron una densidad celular significativamente mayor en el núcleo esferoide que en las capas de transición y externas para los modelos esferoides MDA-MB-231.

El resultado indica compactación en este núcleo esferoide después de cuatro días. Dentro de los modelos agregados AU565 y MDA-MB-231, la adición de la matriz no parece afectar el volumen o el recuento de células y, por lo tanto, parece tener una influencia insignificante en la proliferación celular. Más bien, la adición de matrices parece redistribuir la densidad celular promoviendo una compactación significativa del núcleo y disminuyendo la densidad celular en las capas externas.

Estos hallazgos proporcionan información valiosa sobre los mecanismos físicos por los cuales la matriz permite la agregación celular en diferentes líneas celulares de cáncer de mama. Mirando a continuación a los tumores AU565 esferoides preparados con matriz, los agregados maduros se trataron con trastuzumab y la densidad celular regional se evaluó a través de un régimen farmacológico de cinco días. Los tapones se colocaron cada 100 micrómetros en todo el grosor de los agregados.

Se observaron fluctuaciones menores en la densidad celular a lo largo del tiempo dentro de los 500 micrómetros internos de cada agregado, lo que indica una muerte celular mínima. La visualización de la muerte celular como respuesta indicativa al fármaco principalmente en las capas externas de los esferoides tumorales es consistente con los problemas de penetración del fármaco de trastuzumab. Ahora podemos medir de forma no destructiva la viabilidad celular en agregados sin sacrificar la estructura.

Esto permite evaluar la respuesta longitudinal al fármaco en agregados tumorales singulares para identificar las cualidades temporales y de penetración de los fármacos candidatos contra el cáncer.