Name: Fabricación y uso de andamios secos de alginato macroporoso para la transducción viral de células T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Aprende a fabricar andamios secos de alginato macroporoso (Drydux) para transducir células T activadas con eficiencia superior al 85%. Este método simplifica la terapia CAR-T como alternativa económica a RetroNectin.

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Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud a través de los números de subvención R37-CA260223, R21CA246414. Agradecemos al núcleo de citometría de flujo de NCSU por su capacitación y orientación sobre el análisis de citometría de flujo. Los esquemas se crearon con Biorender.com

Todos los procedimientos que involucran células de primacía humana y vectores retrovirales se realizaron de acuerdo con las pautas de Seguridad Biológica de la Universidad Estatal de Carolina del Norte y fueron aprobados por la Oficina de Salud y Seguridad Ambiental. Las células mononucleares de sangre periférica humana se compraron como abrigos leucocitarios de fuentes comerciales. Las células humanas primarias deben aislarse de las fracciones de pelaje leucocitario humano y requieren autorización de nivel 2 de bioseguridad y procedimientos operativos estándar detallados y la aprobación de la institución donde se llevará a cabo el trabajo. Los vectores virales, incluidos los sobrenadantes de vectores retrovirales utilizados para la transducción preparada como se describió anteriormente19, pueden clasificarse como nivel de bioseguridad 1 o nivel de bioseguridad 2 dependiendo de la proteína codificada y requieren la aprobación del comité institucional de bioseguridad pertinente.
1. Fabricación de los andamios de alginato macroporoso
<ol><li>Prepare una solución madre de 0,4% (peso por volumen) de gluconato de calcio D agregando agua desionizada filtrada estéril al gluconato de calcio D en un vaso de precipitados. Revuelva a velocidad media hasta que el gluconato de calcio se haya disuelto (~ 1.5 h), con filtro estéril y guárdelo a temperatura ambiente. NOTA: No es necesario comprobar el pH de la solución.</li>
	<li>Prepare una solución de alginato al 2% (peso por volumen) en un vial de tapón de rosca o vaso de precipitados. Agregue cuidadosamente el alginato ultrapuro al recipiente y agregue agua desionizada filtrada estéril al alginato. Elija la barra de agitación más grande posible que no impida la mezcla y agréguela al recipiente. NOTA: La información sobre el tipo de alginato ultrapuro utilizado para este protocolo se puede encontrar en la Tabla de materiales y en el sitio web de Novamatrix20. No se exploraron diferentes alginatos para estos andamios, ya que pueden conducir a cambios no deseados en la porosidad y biocompatibilidad de los andamios 9,10,11.</li>
	<li>Revuelva la solución a alta velocidad hasta que el alginato se disuelva (~ 1 h). Si hay grupos grandes en los lados del recipiente, incline el recipiente para desalojarlos. Pequeñas cantidades de alginato en los lados se disolverán mientras se agita y no son motivo de preocupación. NOTA: No es necesario comprobar el pH de la solución.</li>
	<li>Cuando el alginato se disuelva, reduzca la velocidad de agitación, agregue lentamente un volumen igual de gluconato D de calcio al 0,4% a la solución de alginato para evitar que se formen grupos de reticulación y revuelva vigorosamente durante 15 minutos.</li>
	<li>Incline el vaso de precipitados o el vial hacia los lados para eliminar cualquier grumo que se haya formado. NOTA: Se recomienda utilizar un homogeneizador. La solución final debe ser ópticamente clara.</li>
	<li>Pipetear el volumen deseado de la solución en cada pocillo de una placa de 48 pocillos o placa de 24 pocillos. Use 300 μL/pocillo para una placa de 48 pocillos y 1 ml/pocillo para una placa de 24 pocillos. Lanzar lentamente y cambiar las puntas con frecuencia, ya que la solución será viscosa y se pegará a la punta.</li>
	<li>Cubrir las placas con tapas y congelar durante la noche a -20 °C.</li>
	<li>Prepare la placa para el liofilizador quitando la tapa y asegurando la parte superior con toallitas y bandas elásticas. Colocar las placas en matraces de liofilizador de 750 ml a 2.000 ml y colocar en el liofilizador durante 72 h.</li>
	<li>Después de 72 h, retire la placa del liofilizador y vuelva a colocar la tapa. Sellar la placa y conservar a 4 °C. Para el almacenamiento a largo plazo, selle al vacío la placa antes de guardarla a 4 °C. Mantener seco hasta que sea necesario. NOTA: Haga una solución adicional de alginato de calcio debido a un error de volumen (algunos se adhieren a las paredes del vial, puntas de pipeta). Por ejemplo, para hacer cuatro andamios en una placa de 24 pocillos, se requieren 4 ml de solución combinada (2 ml de alginato + 2 ml de gluconato de calcio D), pero se recomienda preparar 2,5 ml de solución de alginato al 2% y 2,5 ml de solución de gluconato de calcio D al 0,4%.</li>
</ol>2. Transducción
<ol><li>Concentración de sobrenadante viral utilizando filtros de 100 kDa<ol><li>Hidratar el filtro centrífugo durante 2 min con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Deseche el PBS.</li>
		<li>Concentrar la suspensión viral añadiendo 2 ml de suspensión viral (1 × 106 TU/mL) y centrifugarla a través del filtro centrífugo a 1.500 × g durante 10 min en un rotor de cangilón oscilante. NOTA: Se necesitan de uno a doscientos microlitros de virus concentrado por andamio.</li>
		<li>Girar durante unos minutos adicionales si el volumen concentrado de suspensión del virus es superior a 200 μL.</li>
		<li>Repita los pasos 2.1.1-2.1.3 para cada andamio. NOTA: También es aceptable concentrar una gran cantidad de virus y tomar alícuotas de 100-200 μL de la cepa concentrada.</li>
	</ol></li>
	<li>Semillas de células activadas y virus juntos.<ol><li>Para cada andamio, preparar una alícuota suspendiendo 1 × 106 células mononucleares de sangre periférica activadas (PBMC) en 50 μL de medios de cultivo celular completos (250 ml de medios de Click's Media + 250 mL RPMI 1640 media + 50 mL de suero fetal bovino + 5 mL de sustituto de glutamina + 5 mL de penicilina/estreptomicina). NOTA: Consulte el archivo complementario 1 para obtener un protocolo sobre cómo activar PBMC.</li>
		<li>Agregue el sobrenadante viral concentrado (~ 2 × 106 TU, MOI 2) a la suspensión celular. El volumen total de la suspensión de virus celular no debe exceder los 200 μL para un andamio de 48 pocillos o los 350 μL para un andamio de 24 pocillos.</li>
		<li>Agregue la mezcla de células y virus gota a gota a la parte superior del andamio seco. Para experimentos de control negativo, utilice medios de cultivo celular completos en lugar del virus concentrado. Agregue la suspensión celular a la parte superior del andamio seco.</li>
		<li>Repita los pasos 2.2.1-2.2.3 para cada andamio.</li>
		<li>Incubar los andamios en una incubadora de cultivo celular a 37 °C durante 45-60 min. Retire los andamios de la incubadora; Los andamios absorberán completamente la solución durante este tiempo.</li>
		<li>Para inducir la proliferación, agregue medios de cultivo celular completos suplementados con IL-15 (5 ng / ml) e IL-7 (10 ng / ml) a cada pocillo; También se puede utilizar IL-2. Agregue 500 μL a cada andamio de 48 pocillos o 1 ml a cada andamio de 24 pocillos.</li>
		<li>Incubar los andamios a 37 °C durante 72 h. A medida que las células proliferan, los medios se volverán naranjas.</li>
	</ol></li>
	<li>Aísle las células de los andamios para su análisis.<ol><li>Diluir 0,5 M EDTA a 0,25 M EDTA en 1x PBS.</li>
		<li>Retire el exceso de medio de cada pocillo y recoja en tubos de centrífuga separados de 15 ml.</li>
		<li>Para aislar las celdas del andamio, agregue 0,25 M EDTA a cada andamio. Agregue 300 μL a andamios de 48 pocillos o 1 ml a andamios de 24 pocillos. Deje que el plato repose o agite suavemente durante 3-4 minutos.</li>
		<li>Una vez que el andamio esté casi disuelto, pipetear hacia adentro y hacia afuera suavemente dentro del pozo. Es posible que se necesiten algunos pasos de pipeteo de entrada y salida para disolver completamente el andamio. Si no se disuelve en 10 min, añadir otros 200 μL de 0,25 M EDTA.</li>
		<li>Una vez que el andamio se disuelva completamente, transfiera la solución a un tubo de centrífuga de 15 ml.</li>
		<li>Repita los pasos 2.3.4 y 2.3.5 para cada andamio.</li>
		<li>Lave las células dos veces agregando 12 ml de PBS a cada tubo de centrífuga y centrifugando a 400 × g durante 5 min. Se formará una bolita celular en el fondo de cada tubo. Aspirar el sobrenadante y repetir el lavado. Tenga cuidado de aspirar completamente el sobrenadante con cada lavado, ya que es crucial eliminar todo el EDTA.</li>
		<li>Después del segundo lavado con PBS, el pellet de celda ahora está listo para su análisis. Siga el protocolo apropiado requerido para el análisis.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+therapy+for+glioblastoma%3A+ready+for+the+next+round+of+clinical+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Anticancer+Therapy%22%5BJournal%5D)">T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing.</a> Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).</li>
<li>Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy+for+glioblastoma%3A+recent+clinical+advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy for glioblastoma: recent clinical advances and future challenges.</a> Neuro-oncology. 20 (11), 1429-1438 (2018).</li>
<li>Nair, R., Westin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">CAR T cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1342, 297-317 (2021).</li>
<li>Jackson, H. J., Rafiq, S., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Driving+CAR+T-cells+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Driving CAR T-cells forward.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 13 (6), 370-383 (2016).</li>
<li>Sterner, R. C., Sterner, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+therapy%3A+current+limitations+and+potential+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+Journal%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies.</a> Blood Cancer Journal. 11 (4), 69(2021).</li>
<li>Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy%3A+A+new+era+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy: A new era in cancer immunotherapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).</li>
<li>Lee, H. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retronectin+enhances+lentivirus-mediated+gene+delivery+into+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%3A+Journal+of+the+International+Association+of+Biological+Standardization%22%5BJournal%5D)">Retronectin enhances lentivirus-mediated gene delivery into hematopoietic progenitor cells.</a> Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 37 (4), 203-209 (2009).</li>
<li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+in+human+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57(2021).</li>
<li>Sun, J., Tan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate-based+biomaterials+for+regenerative+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Alginate-based biomaterials for regenerative medicine applications.</a> Materials. 6 (4), 1285-1309 (2013).</li>
<li>Nayak, A. K., Mohanta, B. C., Hasnain, M. S., Hoda, M. N., Tripathi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+14+-+Alginate-based+scaffolds+for+drug+delivery+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Alginates+in+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Chapter 14 - Alginate-based scaffolds for drug delivery in tissue engineering.</a> Alginates in Drug Delivery. , 359-386 (2020).</li>
<li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate%3A+properties+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Alginate: properties and biomedical applications.</a> Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).</li>
<li>Kuo, C. K., Ma, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionically+crosslinked+alginate+hydrogels+as+scaffolds+for+tissue+engineering%3A+part+1.+Structure%2C+gelation+rate+and+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties.</a> Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).</li>
<li>Soccol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+nondairy+beverages%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Plant-Based+Fermented+Food+and+Beverage+Technology%2C+Second+Edition%22%5BJournal%5D)">Probiotic nondairy beverages.</a> Handbook of Plant-Based Fermented Food and Beverage Technology, Second Edition. , 707-728 (2012).</li>
<li>Moody, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+carboxylates+on+highly+modified+alginates+improves+gelation%2C+tissue+retention+and+systemic+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Restoring carboxylates on highly modified alginates improves gelation, tissue retention and systemic capture.</a> Acta Biomaterialia. 138, 208-217 (2022).</li>
<li>Brudno, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replenishable+drug+depot+to+combat+post-resection+cancer+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Replenishable drug depot to combat post-resection cancer recurrence.</a> Biomaterials. 178, 373-382 (2018).</li>
<li>Moody, C. T., Palvai, S., Brudno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+cross-linking+improves+retention+and+targeting+of+refillable+alginate+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Click cross-linking improves retention and targeting of refillable alginate depots.</a> Acta Biomaterialia. 112, 112-121 (2020).</li>
<li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-mediated+static+transduction+of+T+Cells+for+CAR-T+Cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Scaffold-mediated static transduction of T Cells for CAR-T Cell therapy.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (14), 2000275(2020).</li>
<li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinstructive+implantable+scaffolds+for+rapid+in+vivo+manufacture+and+release+of+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioinstructive implantable scaffolds for rapid in vivo manufacture and release of CAR-T cells.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1250-1258 (2022).</li>
<li>Vera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocytes+redirected+against+the+kappa+light+chain+of+human+immunoglobulin+efficiently+kill+mature+B+lymphocyte-derived+malignant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">T lymphocytes redirected against the kappa light chain of human immunoglobulin efficiently kill mature B lymphocyte-derived malignant cells.</a> Blood. 108 (12), 3890-3897 (2006).</li>
<li>PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/">https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/</a> (2022).</li>
<li>Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+for+effector+T+cell+functions+and+activity+of+immunomodulatory+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies.</a> Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).</li>
<li>Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+assessment+of+human+T+cell+activation+by+real-time+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for the assessment of human T cell activation by real-time metabolic flux analysis.</a> STAR Protocols. 3 (1), 101084(2022).</li>
<li>Bio-Rad cell activation protocols. Bio-Rad. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24. ecommerce2&evCntryLang=US-en&cntry= US&thirdPartyCookieEnabled=true">https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24. ecommerce2&evCntryLang=US-en&cntry= US&thirdPartyCookieEnabled=true</a> (2022).</li>
<li>Lin, H. -R., Yeh, Y. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+alginate%2Fhydroxyapatite+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering%3A+Preparation%2C+characterization%2C+andin+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).</li>
<li>Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+poly%28ethylene+glycol%29+aligned+porous+cryogels+using+a+unidirectional+freezing+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique.</a> Soft Matter. 8 (13), 3620(2012).</li>
</ol>

P.A. y Y.B. son inventores de patentes relacionadas con el uso de biomateriales para la generación de terapias de células CAR-T. Y.B. recibe una beca de investigación patrocinada por la industria relacionada con la tecnología terapéutica de células CAR-T (no relacionada con este trabajo). Todos los demás autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

La terapia de células CAR-T continúa ganando interés tanto para la investigación como para las aplicaciones comerciales. A pesar del éxito que la terapia de células CAR-T ha tenido en el tratamiento de cánceres de sangre, el alto costo del procedimiento limita su uso. El protocolo presentado aquí introduce un nuevo método para la transferencia de genes virales de células T sin la necesidad de espinoculación de placas recubiertas de retronectina. La producción de andamios secos de alginato macroporoso para mediar la trans...

La inmunoterapia se ha convertido en un paradigma revolucionario de tratamiento del cáncer debido a su capacidad para atacar específicamente los tumores, limitar la citotoxicidad fuera del objetivo y prevenir la recaída. En particular, la terapia celular con receptor de antígeno quimérico T (CAR-T) ha ganado popularidad debido a su éxito en el tratamiento de linfomas y leucemias. La FDA aprobó la primera terapia de células CAR-T en 2017 y, desde entonces, ha aprobado cuatro terapias más de células CAR-T 1,2,3,4,5. Los CAR tienen un dominio de reconocimiento de antígenos que generalmente consiste en un fragmento variable de cadena única de un anticuerpo monoclonal que es específico para un antígeno asociado al tumor 3,4. Cuando un CAR interactúa con su antígeno asociado al tumor, las células CAR-T se activan, lo que lleva a una respuesta antitumoral que implica la liberación de citoquinas, la desgranulación citolítica, la expresión del factor de transcripción y la proliferación de células T. Para producir células CAR-T, se recoge sangre del paciente para obtener sus células T. Los CAR se agregan genéticamente a las células T del paciente utilizando un virus. Las células CAR-T se cultivan in vitro y se infunden de nuevo en el paciente 2,3,4,6. La generación exitosa de células CAR-T está determinada por la eficiencia de transducción, que describe el número de células T que se modifican genéticamente en células CAR-T.
Actualmente, el estándar de oro para la generación de células CAR-T es la espinoculación de células T activadas y virus en placas recubiertas de retronectina 7,8. La transducción comienza cuando las partículas virales se involucran con la superficie de las células T. La retronectina promueve la colocalización de virus y células aumentando la eficiencia de unión entre las partículas virales y las células, mejorando la transducción 7,8. La retronectina no funciona bien por sí sola y necesita ir acompañada de espinoculación, lo que mejora la transferencia de genes al concentrar las partículas virales y aumentar la permeabilidad superficial de la célula T, lo que permite una infección viral más fácil8. A pesar del éxito de la espinoculación en placas recubiertas de retronectina, es un proceso complejo que requiere múltiples ciclos de centrifugado y reactivos costosos. Por lo tanto, los métodos alternativos para la transferencia de genes virales que son más rápidos y más baratos son altamente deseables.
El alginato es un polisacárido aniónico natural ampliamente utilizado en la industria biomédica debido a su bajo costo, buen perfil de seguridad y capacidad para formar hidrogeles al mezclarse con cationes divalentes 9,10,11,12. El alginato es un polímero que cumple con GMP y generalmente es reconocido como seguro (GRAS) por la FDA13. La reticulación del alginato con cationes crea hidrogeles estables que a menudo se usan en la cicatrización de heridas, la administración de pequeños fármacos químicos y proteínas, y el transporte celular 9,10,11,12,14,15,16. Debido a sus excelentes propiedades gelificantes, el alginato es el material preferido para crear andamios porosos por liofilización10,17. Estas características del alginato lo convierten en un candidato atractivo para producir un andamio que puede mediar la transferencia de genes virales de las células activadas.
Aquí se describe un protocolo para hacer andamios secos de alginato macroporoso, conocidos como andamios Drydux, que transducen estáticamente células T por transferencia de genes virales17,18. El proceso para hacer estos andamios se muestra en la Figura 1. Estos andamios eliminan la necesidad de espinoculación de las placas recubiertas de retronectina. Los andamios de alginato macroporoso estimulan la interacción de partículas virales y células T para permitir la transferencia eficiente de genes en un solo paso sin afectar la funcionalidad y viabilidad de las células T diseñadas17. Cuando se siguen correctamente, estos andamios de alginato macroporoso tienen una eficiencia de transducción de al menos el 80%, simplificando y acortando el proceso de transducción viral.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64036/64036fig01v2.jpg"> Figura 1: Esquema y cronología del protocolo . (A) Cronología para la fabricación de los andamios secos de alginato macroporoso. El alginato se reticula con el D-gluconato de calcio y se congela durante la noche. Los andamios congelados se liofilizan durante 72 h para crear los andamios Drydux. (B) Cronología para la transducción viral de células activadas. Las células activadas y el virus (MOI 2) se siembran en la parte superior del andamio y se incuban en medios completos suplementados con IL-7 e IL-15. Los andamios absorben la mezcla y promueven la transferencia de genes virales. El EDTA se utiliza para disolver los andamios y aislar las células transducidas. Después de lavar dos veces con PBS, el pellet celular se puede utilizar para el análisis. Abreviaturas: PBS = solución salina tamponada con fosfato; PBMCs = células mononucleares de sangre periférica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64036/64036fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>UltraPure, pH 8.0</td></tr><tr><td>1x DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Sin cloruro de calcio o cloruro de magnesio</td></tr><tr><td>Ácido acético al 3% con azul de metileno</td><td>Stemcell Technologies Inc</td><td>07060</td><td></td></tr><tr><td>Células mononucleares de sangre perifreal activadas</td><td>:</td><td></td> <td>frescas o congeladas</td></tr><tr><td>Gluconato de calcio-D-gluconato</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11649</td><td></td></tr><tr><td>CD28.2 Anticuerpo</td><td>BD</td><td>555725</td><td>1 mg/mL</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD3</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-387</td><td>100 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Click's Media</td><td>FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS</td><td>9195</td><td></td></tr><tr><td>DI Agua</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS</td><td>Cytvia</td><td>SH3039603</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 Media</td><td>Cytvia</td><td>SH3009601</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (P/S)</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Células mononucleares de sangre periférica</td><td>:</td><td></td> <td>frescas o congeladas</td></tr><tr><td>PRONOVA UP MVG</td><td>NovaMatrix</td><td>4200101</td><td>Alginato de sodio</td></tr><tr><td>IL-15 humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>200-15</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>IL-7 humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>200-07</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>Retrovirus</td><td>-</td><td>-</td><td>1 x 106 TU/ Ml</td></tr></tbody></table>

fabricación y uso de andamios secos de alginato macroporoso para la transducción viral de células t

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

La ingeniería genética de las células T para la terapia de células CAR-T ha llegado a la vanguardia del tratamiento del cáncer en los últimos años. Las células CAR-T se producen por transferencia de genes virales a células T. El estándar de oro actual de la transferencia de genes virales implica la espinoculación de placas recubiertas de retronectina, que es costosa y requiere mucho tiempo. Existe una necesidad significativa de métodos eficientes y rentables para generar células CAR-T. Aquí se describe un método para fabricar andamios de alginato macroporoso secos y de bajo costo, conocidos como andamios Drydux, que promueven eficientemente la transducción viral de células T activadas. Los andamios están diseñados para ser utilizados en lugar de la espinoculación estándar de oro de placas recubiertas de retronectina sembradas con virus y simplificar el proceso de transducción de células. El alginato se reticula con el D-gluconato de calcio y se congela durante la noche para crear los andamios. Los andamios congelados se liofilizan en un liofilizador durante 72 h para completar la formación de los andamios macroporosos secos. Los andamios median la transferencia de genes virales cuando el virus y las células T activadas se siembran juntas en la parte superior del andamio para producir células modificadas genéticamente. Los andamios producen >85% de transducción primaria de células T, que es comparable a la eficiencia de transducción de la espinoculación en placas recubiertas de retronectina. Estos resultados demuestran que los andamios secos de alginato macroporoso sirven como una alternativa más barata y conveniente al método de transducción convencional.

Estos andamios de alginato macroporoso son fáciles de hacer y deben salir del liofilizador como discos porosos, esponjosos y blancos. Aunque no estudiada en este experimento, la solución de calcio-alginato puede ser moldeada en diferentes moldes para crear andamios de diferentes formas, dependiendo de las necesidades del usuario 9,10. Los andamios son electrostáticos y pueden adherirse a la tapa de la placa del pozo o a un dedo enguantado. La...

Aquí hay un protocolo para crear andamios de alginato macroporoso seco que median la transferencia eficiente de genes virales para su uso en ingeniería genética de células T, incluidas las células T para la terapia de células CAR-T. Se demostró que los andamios transducen células T primarias activadas con una transducción del >85%.

Fabricación y uso de andamios secos de alginato macroporoso para la transducción viral de células T

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

En este video se describe un protocolo para crear y usar andamios de alginato macroporoso seco conocidos como Drydux que promueven eficientemente la transducción de células T activadas. Drydux está diseñado para ser utilizado en lugar de la espinoculación estándar de oro de placas recubiertas con RetroNectin sembradas con virus y simplifica el proceso de transducción de células. Drydux tiene una eficiencia de transducción comparable a la espinoculación en placas recubiertas de RetroNectin, y sirve como una alternativa más barata y conveniente al método de transducción convencional.Primero, prepare una solución al 0,4% de D-gluconato de calcio. Agregue agua DI filtrada estéril al D-gluconato de calcio en un vaso de precipitados. Revuelva a velocidad media hasta que el D-gluconato de calcio se haya disuelto, lo que toma aproximadamente 1 1/2 horas.Una vez disuelto, filtre estéril la solución de calcio-D-gluconato. Esta solución se puede almacenar a temperatura ambiente. A continuación, prepare una solución de alginato al 2%.Esto se puede lograr usando un vial de tapa de rosca o un vaso de precipitados. Ambos se mostrarán aquí. Agregue cuidadosamente el alginato ultrapuro al recipiente.Agregue la cantidad adecuada de agua DI al alginato. Elija la barra de agitación más grande posible que no impida la mezcla y agréguela al recipiente. Revuelva la solución a fuego alto hasta que el alginato se disuelva, lo que toma aproximadamente una hora.Si hay grupos grandes de alginato en el costado del recipiente, incline el recipiente hacia los lados para desalojarlos. Los pequeños grupos se disolverán durante la hora y no son motivo de preocupación. Una vez que la solución de alginato al 2% se disuelve, reduzca la velocidad de agitación.Agregue lentamente un volumen igual de la solución de calcio-D-gluconato a la solución de alginato. Agregarlo lentamente ayudará a evitar que se formen grupos de reticulación. Cuando se haya agregado la solución de gluconato de calcio, aumente la velocidad de agitación y revuelva vigorosamente durante 15 minutos.Incline el vaso hacia los lados para eliminar cualquier grumo que pueda haberse formado. Después de remover vigorosamente durante 15 minutos, asegúrese de que no haya grumos en la solución. Pipeta la solución en una placa de 48 o 24 pocillos.Para una placa de 48 pocillos, pipetear 300 microlitros en cada pocillo. Asegúrese de fundir lentamente y cambie las puntas con frecuencia, ya que la solución será viscosa y puede adherirse a la punta. Para una placa de 24 pocillos, pipetear un mililitro en cada pocillo.Una vez más, colar lentamente y cambiar las puntas de la pipeta con frecuencia. Cubra las placas del pozo con una tapa y congele a 20 grados centígrados negativos durante la noche. Prepare las placas para el liofilizador quitando las tapas y asegurando la parte superior con toallitas y bandas de goma.Coloque las placas en el tubo liofilizador y colóquelas durante 72 horas. Después de 72 horas, retire la placa del liofilizador. Los andamios ya están listos para ser utilizados para la transducción.Si no utiliza los andamios inmediatamente, selle la placa con Parafilm y guárdela a cuatro grados centígrados hasta que sea necesario. Para el almacenamiento a largo plazo, se recomienda sellar al vacío la placa además de sellar con Parafilm. Concentrar sobrenadante viral centrifugando dos mililitros de solución viral a través de un filtro centrífugo a 1, 500 g durante 10 minutos.Se necesitan de 100 a 200 microlitros de virus concentrado por andamio. Girar durante unos minutos adicionales si el volumen de la solución de virus concentrada es superior a 200 microlitros. Para cada andamio, hacer una alícuota de 1 millón de células T activadas suspendidas en 50 microlitros de medios de cultivo celular completos.Agregue el virus concentrado a la suspensión celular. El volumen total de la suspensión del virus celular no debe exceder los 200 microlitros para un andamio de 48 pocillos, o 350 microlitros para un andamio de 24 pocillos. Agregue la mezcla de virus celular gota a gota a la parte superior del andamio seco.Para experimentos de control negativo, utilice medios de cultivo celular completos en lugar de virus concentrados. Agregue esta suspensión celular a la parte superior del andamio seco. Incubar los andamios en la incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados durante 45 a 60 minutos.Retire los andamios de la incubadora. Los andamios deben absorber completamente la solución durante este tiempo. Para inducir la proliferación, agregue medios de cultivo celular completos suplementados con IL-7 e IL-15 a cada pocillo.También se puede utilizar IL-2. Para un andamio de 24 pocillos, agregue un mililitro. Para un andamio de 48 pocillos, agregue 500 microlitros.Incubar a 37 grados centígrados durante 72 horas. Las células proliferarán durante las 72 horas, lo que puede hacer que los medios se vuelvan naranjas. Retire el exceso de medios de cada pocillo.Para aislar las células del andamio, agregue 0,25 molares de solución EDTA a cada andamio. Agregue un mililitro para andamios de 24 pocillos o 300 microlitros para andamios de 48 pocillos. Deje que el plato se asiente o agite suavemente durante tres o cuatro minutos.Una vez que se disuelva en su mayoría, pipetear hacia adentro y hacia afuera suavemente dentro del pozo. Es posible que se necesiten algunos pasos de pipeteo de entrada y salida para disolver completamente el andamio. Transfiera la solución a un tubo de centrífuga de 15 mililitros.Lave las células dos veces con PBS. Agregue 12 mililitros de PBS a cada tubo de centrífuga. Centrifugar a 400 g durante cinco minutos.Se formará un pellet celular en el fondo del tubo. Aspire la solución sobrenadante y repita el lavado. Tenga cuidado de eliminar completamente el sobrenadante con cada lavado, ya que es crucial deshacerse de todo el EDTA.Después de lavar con PBS por segunda vez, el pellet celular está listo para su análisis. Se utilizó citometría de flujo para determinar la eficiencia de transducción de cada grupo. Las células no transducidas se utilizaron como control negativo y no mostraron transducción.Las células sembradas en andamios sin retrovirus GFP tampoco mostraron transducción. El grupo Drydux, que tenía células activadas sembradas en los andamios secos de alginato macroporoso, mostró una transducción del 85%, justo más baja que el grupo RetroNectin. Estos resultados demuestran que los andamios Drydux transducen eficazmente las células mediante la transferencia de genes retrovirales sin la necesidad de espinoculación de placas recubiertas con RetroNectin.Los andamios Drydux exhiben una alta eficiencia de transducción comparable a RetroNectin, proporcionando un método alternativo para transducir células T. Debido al bajo costo de fabricación de los andamios Drydux, este proceso tiene el potencial de reducir significativamente el costo de las terapias de células T con CAR.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este video muestra el procedimiento de fabricación de microportadores derivados de matriz extracelular por electroaspersión. Estos microportadores simulan el microambiente específico del tejido nativo y son estables en modelos de cultivo celular in vitro en 3D a largo plazo.

Fabricación de bioandamios por electropulverización: una técnica para generar andamios de microportadores derivados de la matriz extracelular de tejido descelularizado

El objetivo de este protocolo es fabricar células T de grado clínico específicas para patógenos utilizando un dispositivo de enriquecimiento celular de segunda generación, automatizado y de sobremesa que incorpora un sistema cerrado de captura de citocinas y no requiere personal dedicado ni el uso de una instalación GMP. Las células T específicas del citomegalovirus pp65 generadas pueden administrarse directamente a los pacientes.

Enriquecimiento de la célula automatizada de citomegalovirus células T específicas para aplicaciones clínicas utilizando el Sistema de citoquinas de captura

Un andamio de la ingeniería de tejidos inyectable compuesto de poli (N-isopropilacrilamida) sulfato de condroitina-injertado (PNIPAAm-g-CS) que contienen micropartículas de alginato se preparó. La fuerza adhesiva, propiedades de hinchamiento y en la biocompatibilidad in vitro se analizaron en este estudio. Las técnicas de caracterización desarrolladas aquí pueden ser aplicables a otros sistemas de termogelificación.

Síntesis de termogelificante poli (N-isopropilacrilamida) compuestos de sulfato de condroitina-injertado con alginato micropartículas de Ingeniería de Tejidos

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar la formación de vasos sanguíneos en vivo y en tiempo real en 3D andamios por microscopía multifotón. Angiogénesis en andamios modificados genéticamente fue estudiada en un modelo de defecto murino hueso calvarial de crítica. Más nuevos vasos sanguíneos fueron detectados en el grupo de tratamiento que en los controles.

Visualización de angiogénesis por microscopía multifotón En Vivo en modificados genéticamente 3D-PLGA/nHAp andamio para Calvarial críticos de la reparación del defecto óseo

La matriz extracelular específica del tejido (ECM) es un mediador clave de la función celular. Este artículo describe métodos para la síntesis de espumas y microportadores que son estables en cultivo sin la necesidad de reticulación química para aplicaciones en 3D avanzados en modelos de cultivo celular in vitro o como matrices biodegradables pro-regenerativas puros ECM-derivado.

La fabricación de espumas y microportadores derivados de la matriz extracelular como específica de tejido de cultivo celular y las plataformas de entrega

Este protocolo describe la fabricación de microcryogels elástico macroporoso 3D integrando microfabricación con tecnología cryogelation. A cargar con las células, se generan microtissues 3D, que puede ser fácilmente inyectados en vivo para facilitar la terapia regenerativa o montado en arreglos de discos para en vitro screening de drogas de alto rendimiento.

Microtissues 3D para la terapia regenerativa inyectable y drogas de alto rendimiento

Este protocolo describe una plataforma para la fabricación de anillos de tejido automático montado en tamaños variables utilizando un molde de plástico modificado para requisitos particulares impresa en 3D. Negativos PDMS se curan en el molde impreso en 3D; agarosa se echa entonces en los negativos PDMS curados. Las células se siembran en los pozos de agarosa resultante donde agregan en anillos de tejido.

Fabricación de pozos de agarosa personalizado para la siembra de células y tejido anillo autoensamblaje con moldes impresa en 3D

Aquí, presentamos un protocolo de forma rápida y reproducible generar biológicamente inspirado, biodegradable articifical antígeno que presenta las células (aAPC) con tamaño ajustable, forma y presentación de proteína de la superficie de la célula de T expansión ex vivo o en vivo .

Fabricación de Anisotropic antígeno Artificial polimérico que presenta las células para la activación de células T CD8 +

Aquí se presenta una configuración de bioimpresión tridimensional, núcleo/cáscara, fácil de usar, para la fabricación en un solo paso de andamios huecos, adecuado para la ingeniería de tejidos de estructuras vasculares y otras estructuras tubulares.

Andamios de impresión de núcleo/concha para la ingeniería de tejidos de estructuras tubulares

Las varillas de microgel con grupos reactivos complementarios se producen a través de microfluídica con la capacidad de interconectarse en solución acuosa. Los microgeles anisómetros se atascan y se entrelazan en construcciones estables con poros más grandes en comparación con los sistemas de base esférica. Los microgeles modificados con GRGDS-PC forman construcciones 3D macroporosas que se pueden utilizar para el cultivo celular.

Andamios 3D macroporosos interconectados de varillas de microgel

Aprende a fabricar andamios secos de alginato macroporoso (Drydux) para transducir células T activadas con eficiencia superior al 85%. Este método simplifica la terapia CAR-T como alternativa económica a RetroNectin.

Fabricación y uso de andamios secos de alginato macroporoso para la transducción viral de células T

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