Name: Un nuevo modelo de herida cutánea ovina ex vivo de alto rendimiento para probar antibióticos emergentes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprende a establecer un modelo ex vivo de piel ovina herida infectada con Staphylococcus aureus para evaluar la eficacia antimicrobiana de nuevas formulaciones. Este método reduce el uso de animales y acelera la traducción clínica.

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Los autores desean agradecer a EPSRC (EP/R513313/1) por su financiación. Los autores también desean agradecer a R.B Elliot and Son Abattoir en Calow, Chesterfield, por proporcionar cabezas de cordero y por ser tan complacientes en las primeras etapas del proyecto, Kasia Emery por su apoyo durante el desarrollo de este protocolo, y Fiona Wright del Departamento de Infección, Inmunidad y Enfermedades Cardiovasculares de la Universidad de Sheffield por procesar las muestras histológicas y ser tan increíblemente útil durante este proyecto.

Las cabezas de cordero del matadero R.B Elliott and Son se utilizaron como fuente de muestras de piel en este proyecto. Todos los corderos fueron sacrificados para su consumo como alimento. En lugar de descartar las cabezas, estas fueron reutilizadas para la investigación. No se requirió aprobación ética ya que el tejido se obtuvo de desechos desechados de mataderos.
1. Esterilización
<ol><li>Desinfectar las pinzas antes de recoger los cabezales tomando pinzas limpias y realizando la esterilización por calor seco en un horno a 200 °C durante 1 h. Autoclave toda la cristalería a 121 °C durante 15 min antes de su uso.</li>
	<li>Llevar a cabo todo el trabajo descrito dentro de un gabinete de microbiología clase 2. Prepare todos los reactivos según las instrucciones del fabricante.</li>
</ol>2. Recogida de muestras
<ol><li>En el matadero, los corderos Swaledale eran sacrificados aturdiendo, usando electricidad o una pistola de cerrojo cautivo, y se desangraban. Recoger las cabezas de cordero no más de 4 h después del sacrificio.</li>
</ol>3. Preparación de los cabezales
<ol><li>Desinfecte la sección de la frente del cordero vertiendo aproximadamente 100 ml de solución de dióxido de cloro de 200 ppm en el área de la muestra. Afeite la sección de la frente del cabezal con cortapelos eléctricos y lave el área con 200 ml de solución de dióxido de cloro de 200 ppm.</li>
	<li>Limpie el área con etanol y rollo azul y cubra el área de muestra con crema depilatoria durante 35 minutos. Raspa suavemente la crema depilatoria con una herramienta de raspado y evalúa el área de la muestra. Si queda una cantidad significativa de vello, repita el proceso de depilación.</li>
	<li>Use otros 200 ml de solución de dióxido de cloro para enjuagar el área, y luego enjuague con etanol y limpie con un rollo azul.</li>
	<li>Con un punzón de biopsia estéril de 8 mm, extraiga muestras de piel de 8 mm del área preparada. Retire las muestras con fórceps estériles y un bisturí de 15 hojas, asegurándose de que se elimine toda la grasa cutánea.</li>
	<li>Coloque las muestras en un frasco estéril de 0,5 L lleno de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) y luego transfiéralas a tubos estériles de 50 ml con 50 ml de solución de dióxido de cloro de 200 ppm, invierta dos veces y deje esterilizar durante 30 minutos.</li>
	<li>Retire las muestras de la solución de dióxido de cloro y lávelas colocándolas en un tubo de 50 ml lleno de 40 ml de PBS estéril. Una vez lavada, coloque cada muestra de piel individual en un pocillo separado de una placa de 24 pocillos.</li>
	<li>Añadir 350 μL de medio precalentado manteniendo la muestra en la interfaz aire-líquido. La composición de los medios es la siguiente: medios MK (Medio 199 con sales de Hanks, L-glutamato y 1,75 mg/ml de bicarbonato de sodio) y F12 de Ham en una proporción de 1:1, con FBS añadido (10% v/v), EGF (10 ng/mL), insulina (5 μg/mL), penicilina-estreptomicina (100 U/mL) y anfotericina B (2,5 μg/mL).</li>
	<li>Selle las placas de 24 pocillos con un sello de placa permeable al gas e incube a 37 °C en una incubadora de tejidos humidificada al 5% deCO2 durante un máximo de 24 h.</li>
</ol>4. Mantenimiento de muestras de piel
<ol><li>Después de la incubación, retirar el medio de cultivo y enjuagar las muestras en 500 μL de PBS estéril. Añadir medios libres de antibióticos a cada muestra e incubar a 37 °C en una incubadora de tejido humidificada al 5% deCO2 durante 24 h para eliminar los antibióticos residuales de la muestra.</li>
	<li>Si se desarrolla turbidez o infección fúngica en los medios libres de antibióticos después de 24 h, deseche la muestra.</li>
</ol>5. Preparación del inóculo
<ol><li>Prepare un tubo de 50 ml con 10 ml de caldo de soja tríptico estéril. Tome una placa de agar fresco de S. aureus y use un hisopo para transferir varias colonias al caldo. Incubar durante 18 h a 37 °C a 150 rpm.</li>
	<li>Centrifugadora a 4.000 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 10 ml de PBS estéril. Repita dos veces para asegurar un lavado adecuado de las celdas.</li>
	<li>Ajustar el inóculo a 0,6 OD600 en PBS estéril. Confirme la carga de inóculo realizando un recuento manual viable de placas.</li>
</ol>6. Infección de muestras de piel
<ol><li>Prepare una placa fresca de 24 pocillos con 400 μL de medios libres de antibióticos precalentados y agregue los insertos de 24 pocillos utilizando pinzas estériles.</li>
	<li>Retire el medio de las muestras de piel, lave con 500 μL de PBS estéril y retire el lavado. Use fórceps estériles para sostener suavemente la muestra en el fondo del pozo.</li>
	<li>Use una biopsia por punción de 4 mm para hacer un colgajo central de la herida, perforando hasta una profundidad aproximada de 1-2 mm. Luego, use un bisturí de 15 hojas y pinzas de tejido allis dentadas estériles para eliminar la capa superior del colgajo de la herida. La variabilidad en las dimensiones de la herida puede afectar el resultado de la infección y las unidades formadoras de colonias de punto final (UFC).</li>
	<li>Una vez que todas las muestras hayan sido heridas, transfiéralas a los insertos de 24 pocillos utilizando fórceps estériles. Pipetear 15 μL del inóculo bacteriano en el lecho de la herida. A continuación, incubar durante 24 h a 37 °C en una incubadora de tejidos humidificada al 5% deCO2 .</li>
	<li>Si son necesarios períodos de incubación más largos, retire el medio y reemplácelo con medios nuevos cada 24 h e incube en las mismas condiciones.</li>
</ol>7. Determinación de la carga bacteriana
<ol><li>Retire los medios del fondo de los pozos. Con pinzas estériles, transfiera cada muestra a un tubo separado de 50 ml lleno de 1 ml de PBS estéril.</li>
	<li>Utilice un homogeneizador de punta fina para homogeneizar la superficie de la muestra. Tenga cuidado de asegurarse de que el lecho de la herida esté en contacto directo con la punta del homogeneizador.</li>
	<li>Homogeneizar cada muestra durante 35 s a medio/alto. El homogeneizador separa las bacterias de la superficie del lecho de la herida para permitir la enumeración de la carga bacteriana.</li>
	<li>Una vez procesadas todas las muestras, vortex cada muestra, a su vez, antes del pipeteo. Esto es para asegurar que el homogeneizado bacteriano se mezcle.</li>
	<li>Pipetear 20 μL de homogeneizado de vórtice en el pocillo correspondiente de una placa de 96 pocillos que contenga 180 μL de PBS estéril.</li>
	<li>Diluir en serie cada homogeneizado de muestra a 1 x 10−7 y pipetear 10 μL del homogeneizado diluido en una placa tríptica de agar de soja por triplicado.</li>
	<li>Incubar la placa de agar durante 18 h a 37 °C. Luego, cuente el número de colonias para determinar la UFC para cada muestra.</li>
</ol>

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<li>Olkowska, E., Gržinić, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+models+for+dermal+exposure+assessment+of+phthalates%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Skin models for dermal exposure assessment of phthalates.</a> Chemosphere. 295, 133909(2022).</li>
<li>Couto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantitative+proteomics+and+substrate-based+mass+spectrometry+imaging+of+xenobiotic+metabolizing+enzymes+in+ex+vivo+human+skin+and+a+human+living+skin+equivalent+model%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%22%5BJournal%5D)">Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model.</a> Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

El desarrollo de antimicrobianos es una empresa importante pero costosa que se estima que costará alrededor de $ 1 mil millones y tardará alrededor de 15 años en completarse. Más del 90% del descubrimiento de fármacos antimicrobianos y los estudios preclínicos de eficacia de fármacos antimicrobianos son llevados a cabo por investigadores académicos y pequeñas y medianas empresas con menos de 50 empleados22. Estos equipos están muy limitados financieramente, lo que hace que el fracaso de las molécu...

Las infecciones de la piel son un problema global importante, con grandes costos económicos para los proveedores de atención médica de todo el mundo. El desarrollo de resistencia a múltiples fármacos y la formación de biopelículas por patógenos juega un papel clave en la prevalencia de heridas que no cicatrizan 1,2,3,4. Como resultado de esto, las infecciones de la piel y los tejidos blandos son una de las razones más comunes para la hospitalización prolongada y el posterior reingreso5. Los retrasos en la cicatrización de heridas son costosos tanto para el paciente como para los proveedores de atención médica, y algunas estimaciones sugieren que alrededor de 6.5 millones de pacientes se ven afectados anualmente en los Estados Unidos. En el Reino Unido, las infecciones de la piel y las complicaciones asociadas resultan en aproximadamente 75,000 muertes anuales 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) es un formidable patógeno de heridas frecuentemente aislado de heridas de pacientes 2,7. La tasa de aparición de resistencia a múltiples fármacos aumentó drásticamente en la década de 2000. Durante este tiempo, alrededor del 60% de las infecciones bacterianas agudas de la piel y la estructura de la piel fueron positivas para S. aureus resistente a la meticilina 1. El creciente número de cepas resistentes a múltiples fármacos entre Staphylococci, y de hecho otros patógenos, en las últimas 2 décadas indica una necesidad urgente para el rápido desarrollo de antibióticos con nuevos modos de acción que puedan superar la resistencia.
Sin embargo, desde principios de la década de 2000, los programas de descubrimiento de antibióticos han estado dominados por tiempos de desarrollo más largos y bajas tasas de éxito, con solo el 17% de los nuevos antibióticos ingresando a ensayos clínicos en los Estados Unidos logrando la aprobación del mercado8. Esto sugiere una disparidad entre los resultados de las pruebas in vitro de antibióticos emergentes y sus resultados clínicos. Se puede afirmar que esta disparidad se debe en gran medida a las diferencias en la fisiología bacteriana durante las infecciones in vivo y durante los métodos microbiológicos convencionales al probar la eficacia de los antibióticos en las etapas preclínicas in vitro . Por lo tanto, se necesitan nuevos métodos de laboratorio que sean más representativos de la fisiología bacteriana durante la infección para mejorar las tasas de éxito en los programas de descubrimiento de antibióticos.
Los métodos actuales para estudiar infecciones de la piel incluyen estudios en animales vivos (por ejemplo, ratones), modelos de piel ex vivo (por ejemplo, porcinos) y modelos de piel de ingeniería tisular 3D (por ejemplo, humanos)9,10,11,12. Los estudios en animales vivos están estrictamente regulados y tienen un rendimiento relativamente bajo. En modelos animales, las heridas y la infección causan angustia significativa a los animales y plantean preocupaciones éticas. Los modelos de piel humana, ex vivo o diseñados con tejidos, requieren aprobación ética, cumplimiento de la legislación local y mundial (la Ley de Tejidos Humanos, la Declaración de Helsinki), y hay dificultades para adquirir tejidos, con algunas solicitudes que tardan años en cumplirse13,14. Ambos tipos de modelos requieren mucha mano de obra y una experiencia significativa para garantizar el éxito experimental. Algunos modelos actuales de infección cutánea ex vivo requieren discos preinoculados y aditivos para el lecho de la herida para permitir la infección; Aunque estos modelos son increíblemente útiles, existen limitaciones en el proceso de infección ya que los aditivos limitan la utilización del lecho de la herida como fuente de nutrientes10,15,16,17. El modelo descrito en este estudio no utiliza aditivos para el lecho de la herida, lo que garantiza que la patología de la infección y los recuentos celulares viables sean el resultado de la utilización directa del lecho de la herida como única fuente de nutrientes.
Dada la necesidad de nuevos métodos de laboratorio, se ha desarrollado un nuevo modelo ovino ex vivo de alto rendimiento de infecciones de la piel para su uso en la evaluación de la eficacia de los antibióticos emergentes. Los estudios de infección de la piel enfrentan muchos desafíos: altos costos, preocupaciones éticas y modelos que no muestran una imagen completa20,21. Los modelos ex vivo y los modelos de explante 3D permiten una mejor visualización del proceso de la enfermedad y el impacto que los tratamientos pueden tener a partir de un modelo clínicamente más relevante. Aquí, se describe la configuración de un nuevo modelo de piel ovina, que es simple, reproducible y clínicamente relevante y tiene un alto rendimiento. La piel ovina fue elegida ya que las ovejas son uno de los grandes mamíferos comúnmente utilizados para modelar las respuestas a las infecciones in vivo. Además, están fácilmente disponibles en los mataderos, lo que garantiza un suministro constante de piel para la investigación, y sus canales no se escaldan, lo que garantiza una buena calidad del tejido. Este estudio utilizó S. aureus como patógeno ejemplar; Sin embargo, el modelo funciona bien con otros microorganismos.

<table><tbody><tr><td>Placa complementaria de 24 pozos</td><td>SLS&nbsp;</td><td></td><td></td>353504</tr><tr><td>Punzón de biopsia de 4 mm</td><td>Williams Medical</td><td>D7484</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 ml</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10788561</tr><tr><td>Punzón de biopsia de 8 mm</td><td>Williams Medical</td><td>D7488</td><td></td></tr><tr><td>Solución de anfotericina B, estéril</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Colour Pro Style Cortapelos inalámbrico</td><td>Wahl</td><td>9639-2117X</td><td>Cortapelos</td></tr><tr><td>Incubadora de doble horno</td><td>SLS</td><td>OVe1020</td><td>Horno de esterilización</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico&nbsp;</td><td>SLS</td><td>E5036-200UG</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Honeywell</td><td>458600-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>F12 HAM</td><td>Sigma</td><td>N4888</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino&nbsp;</td><td>Pinzas Labtech International</td><td>CA-115/500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>15307805</td><td></td></tr><tr><td>Crema Depilatoria</td><td>Veet</td><td>No aplicable</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i</td><td>Thermo Scientific</td><td>15373212&nbsp;</td><td>Incubadora de cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R</td><td>VWR</td><td>521-2242</td> Homogeneizador de <td>centrífuga</td></tr><tr><td>220,</td> Homogeneizador de <td>15575809</td><td></td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>de mano 220, conos de mezcla de plástico</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15585819</tr><tr><td>Inserto Individual 24 pocillos Membrana de 0,4 um</td><td>VWR International</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Insulina, recombinante Humano</td><td>SLS</td><td>91077C-1G</td><td></td></tr><tr><td>Medio 199 (medios MK)</td><td>Sigma</td><td>M0393</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca, cultivo celular Costar 96 pocillo</td><td>Fisher Scientific</td><td>10687551</td><td></td></tr><tr><td>Multitron</td><td>Infors</td><td>No aplicable</td><td>Incubadora bacteriana</td></tr><tr><td>Tabletas PBS</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>SLS&nbsp;</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Sellos de placa</td><td>Fisher Scientific</td><td>ESI-B-100</td><td></td></tr><tr><td>Safe 2020</td><td>Fisher Scientific</td><td>1284804</td><td>Cabina de seguridad de microbiología de clase II</td></tr><tr><td>Hoja de bisturí número 15</td><td>Fisher Scientific</td><td>O305</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí Swann Morton</td><td>Fisher Scientific</td><td>11849002</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5761-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de tejido Allis dentada</td><td>Rocialle</td><td>RSPU500-322</td><td></td></tr><tr><td>Agar de soja tríptico</td><td>Merck Life Science UK Limited</td><td>14432-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de soja tríptico</td><td>Merck Life Science UK Limited</td><td>41298-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Vimoba Tabletas</td><td>Quip Labs</td><td>VMTAB75BX</td><td></td></tr></tbody></table>

un nuevo modelo de herida cutánea ovina ex vivo de alto rendimiento para probar antibióticos emergentes

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

El desarrollo de antimicrobianos es un proceso costoso con tasas de éxito cada vez más bajas, lo que hace que una mayor inversión en la investigación de descubrimiento de antimicrobianos sea menos atractiva. El descubrimiento de fármacos antimicrobianos y su posterior comercialización pueden ser más lucrativos si se puede implementar un enfoque de fallar rápido y fallar barato dentro de las etapas de optimización de plomo donde los investigadores tienen un mayor control sobre el diseño y la formulación de medicamentos. En este artículo, se describe la configuración de un modelo de piel herida ovina ex vivo infectado con Staphylococcus aureus, que es simple, rentable, de alto rendimiento y reproducible. La fisiología bacteriana en el modelo imita que durante la infección la proliferación bacteriana depende de la capacidad del patógeno para dañar el tejido. El establecimiento de la infección de la herida se verifica mediante un aumento en los recuentos bacterianos viables en comparación con el inóculo. Este modelo se puede utilizar como plataforma para probar la eficacia de los antimicrobianos emergentes en la etapa de optimización de plomo. Se puede afirmar que la disponibilidad de este modelo proporcionará a los investigadores que desarrollan antimicrobianos un modelo de falla rápida y barata de falla, lo que ayudará a aumentar las tasas de éxito en ensayos posteriores con animales. El modelo también facilitará la reducción y el refinamiento del uso de animales para la investigación y, en última instancia, permitirá una traducción más rápida y rentable de nuevos antimicrobianos para infecciones de piel y tejidos blandos a la clínica.

La identificación de una ruta para esterilizar la piel antes de establecer el modelo de infección de la herida fue un desafío. El desafío consistía en esterilizar la piel sin dañar las diferentes capas de la piel, lo que puede tener consecuencias no deseadas en el resultado de la infección. Para identificar un régimen de esterilización apropiado, se probaron diferentes tratamientos durante diferentes períodos de tiempo, como se describe en la Tabla 1. La contaminación se registró como el desarrollo de tu...

El protocolo describe un método paso a paso para establecer un modelo de piel herida ovina ex vivo infectado con Staphylococcus aureus. Este modelo de alto rendimiento simula mejor las infecciones in vivo en comparación con las técnicas microbiológicas convencionales y presenta a los investigadores una plataforma fisiológicamente relevante para probar la eficacia de los antimicrobianos emergentes.

Un nuevo modelo de herida cutánea ovina ex vivo de alto rendimiento para probar antibióticos emergentes

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...

Este modelo permitirá a los investigadores en las etapas preclínicas críticas determinar con mayor precisión la eficacia antimicrobiana de las nuevas formulaciones, y les da a los investigadores un mayor control sobre el diseño y la formulación de medicamentos. Este modelo permite resultados reproducibles rápidos en un entorno de herida representativo. Reduce la necesidad de animales criados especialmente y facilita la traducción más rápida de antimicrobianos tópicos para infecciones de heridas a la clínica.Los principales desafíos son la contaminación y la destreza. Una técnica aséptica estricta y la paciencia con el procesamiento de tejidos son esenciales; se necesita una eliminación precisa y decidida del colgajo para el éxito de este método. Comience con la desinfección de los fórceps exponiéndolos a la esterilización por calor seco a 200 grados centígrados durante una hora.Autoclave toda la cristalería a 121 grados centígrados durante 15 minutos antes de su uso. Desinfecte la sección frontal de la lámpara vertiendo aproximadamente 100 mililitros de solución de dióxido de cloro de 200 PPM en el área de la muestra. Afeite la sección de la frente con cortapelos eléctricos, seguido de un lavado con 200 mililitros de solución de dióxido de cloro de 200 PPM.Limpie el área con etanol y un rollo azul, y cubra el área de muestra con crema depilatoria. Después de 35 minutos, raspe suavemente la crema depilatoria con una herramienta de raspado y evalúe el área de la muestra. Repita el proceso de depilación si queda una cantidad significativa de vello.Enjuague el área de muestra limpia con 200 mililitros de solución de dióxido de cloro seguido de etanol y un rollo azul. Use un punzón de biopsia estéril de ocho milímetros para cortar una muestra de piel de ocho milímetros del área preparada. A continuación, retire la muestra con fórceps estériles y bisturí de cuchilla número 15, asegurándose de que se elimine toda la grasa cutánea.Coloque las muestras en un frasco estéril de 0,5 litros lleno de PBS estéril. Luego transfiéralos a tubos estériles de 50 mililitros llenos con 50 mililitros de solución de dióxido de cloro de 200 PPM. Invierta el tubo dos veces y déjelo esterilizar durante 30 minutos.Transfiera las muestras a un tubo de 50 mililitros lleno de 40 mililitros de PBS estéril. Después del lavado de PBS, coloque cada muestra de piel en un pocillo separado de una placa de 24 pocillos. Agregue 350 microlitros del medio precalentado en un pozo, mientras mantiene la muestra en la interfaz aire-líquido.Selle las placas de 24 pocillos con un sello de placa permeable al gas antes de colocar la placa para incubación en una incubadora de tejido humidificado al 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados durante 24 horas. Después de la incubación, retire el medio de cultivo y enjuague las muestras en 500 microlitros de PBS estéril. Retire los antibióticos residuales de la muestra tratándolos con medios libres de antibióticos al 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados durante 24 horas.Si se desarrolla turbidez o infección fúngica en los medios libres de antibióticos, deseche la muestra. A continuación, prepare un tubo de 50 mililitros con 10 mililitros de caldo de soja tríptico estéril. Luego transfiera varias colonias de Staphylococcus aureus de una placa de agar fresco de S.aureus al caldo, e incube el tubo a 37 grados centígrados y 150 RPM durante 18 horas.Después de centrifugar los tubos a 4, 000 G durante tres minutos, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 10 mililitros de PBS estéril. Repita el lavado de PBS dos veces antes de ajustar el inóculo a una densidad óptica de 0,6 a longitudes de onda de 600 nanómetros utilizando PBS estéril. Confirme la carga de inóculo mediante un recuento manual de placas viables.Para infectar la muestra de piel, prepare una placa fresca de 24 pocillos con 400 microlitros de medios libres de antibióticos precalentados y agregue los insertos de 24 pocillos con pinzas estériles. Retire el medio de las muestras de piel. Lavarlos con 500 microlitros de PBS estéril y retirar el lavado.Use fórceps estériles para sostener suavemente la muestra en el fondo del pozo. Use una biopsia por punción de cuatro milímetros para perforar la muestra de piel a una profundidad aproximada de uno a dos milímetros y hacer un colgajo central de la herida. Luego use un bisturí de hoja número 15 y pinzas de tejido Allis de dientes estériles para eliminar la capa superior del colgajo de la herida.Una vez que todas las muestras hayan sido heridas, transfiéralas a los insertos de 24 pocillos utilizando fórceps estériles. Pipetear 15 microlitros del inóculo bacteriano en el lecho de la herida antes de incubar durante 24 horas a 37 grados centígrados en una incubadora de tejido humidificada. Para períodos de incubación más largos, retire el medio, reemplácelo con medios frescos cada 24 horas e incube las placas en las mismas condiciones.Para determinar la carga bacteriana, retire los medios del fondo de los pocillos. Y usando pinzas estériles, transfiera cada muestra a un tubo separado de 50 mililitros lleno de un mililitro de PBS estéril. Luego separe las bacterias de la superficie del lecho de la herida homogeneizando la superficie de la muestra con un homogeneizador de punta fina.Asegúrese de que el lecho de la herida esté en contacto directo con la punta del homogeneizador. Una vez que se procesan todas las muestras, haga un vórtice de cada muestra antes de transferir 20 microlitros de homogeneizado al pocillo correspondiente de una placa de 96 pocillos que contenga 180 microlitros de PBS estéril. Diluir en serie cada homogeneizado de muestra de 1 veces 10 a 7 negativo, y pipetear 10 microlitros del homogeneizado diluido en una placa de agar de soja tríptico por triplicado.Incubar la placa de agar de soja tríptica a 37 grados centígrados, y después de 18 horas, contar el número de colonias para determinar las unidades formadoras de colonias o UFC para cada muestra. Se identificó un régimen apropiado de esterilización de la piel utilizando diferentes tratamientos durante diferentes períodos de tiempo. La integridad del tejido se monitorizó mediante histología, seguida de tinción con hematoxilina y eosina inmediatamente después del tratamiento.Un tratamiento de 30 minutos con dióxido de cloro fue el tratamiento más efectivo, con esterilización reproducible del tejido de la piel mientras se preserva la integridad del tejido. Una película blanca en el lecho de la herida era evidente en el tejido 48 horas después de la infección. Aunque el modelo de rasguño albergaba un mayor número promedio de UFC después de 24 horas, la técnica de eliminación de heridas con colgajo produjo resultados más consistentes.Después de 48 horas, se recuperaron aproximadamente 100 veces más UFC bacterianas del tejido herido en comparación con el inóculo, lo que indica una infección exitosa. Las secciones histológicas teñidas de Gram del tejido infectado indicaron la presencia de células de S.aureus en el lecho de la herida, que estaba ausente en las secciones de tejido no infectado. Después de este procedimiento, se puede realizar inmunohistoquímica para estudiar la respuesta tisular, tinción de Gram modificada para visualizar la localización bacteriana y recuentos de placas viables después de la exposición a antimicrobianos para probar la eficacia antimicrobiana.Para los investigadores que desarrollan nuevos antimicrobianos, este modelo proporcionará un mayor control de la optimización del plomo, reducirá la dependencia de ensayos en animales costosos y estrictamente regulados, y permitirá la rápida traducción de los antimicrobianos a la clínica.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: de Vries, C. R., et.al. Un modelo de inoculación retardada de la infección crónica de la herida por Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demuestra la inoculación tardía de Pseudomonas aeruginosa luminiscente en un ratón con dos heridas dorsales cutáneas de grosor completo cubiertas por un apósito transparente. Esto facilita la formación de biofilm y el establecimiento de infecciones crónicas. El monitoreo regular de bioluminiscencia permite cuantificar la carga...

Desarrollo de un modelo murino de infección cutánea crónica por Pseudomonas aeruginosa 

Este video describe un protocolo para configurar un modelo ex vivo para la queratitis bacteriana utilizando un botón corneoescleral diseccionado del ojo porcino. Las bacterias inoculadas atraviesan las incisiones epiteliales de la córnea para invadir el estroma subyacente y establecer una infección dentro de los tejidos corneales que imita la infección in vivo.

Modelo de Córnea Porcina Ex vivo de Queratitis Bacteriana: Una Técnica para Establecer la Infección Bacteriana en las Células Epiteliales de la Córnea

Este video muestra una técnica para generar un modelo murino de infección de heridas en la piel. Al infectar ratones, modificados genéticamente para expresar una proteína fluorescente en neutrófilos, con un Staphylococcus aureus bioluminiscente modificado genéticamente, una bacteria patógena. La carga bacteriana en el sitio de la infección y la dinámica de reclutamiento de neutrófilos se pueden estudiar utilizando imágenes de animales enteros.

Un modelo de infección de heridas cutáneas murinas para estudiar la respuesta inmunitaria frente a un patógeno bacteriano

El video muestra la generación de un modelo de piel ovina ex vivo infectado con Staphylococcus aureus. Esto implica tratar una sección de biopsia de piel de frente de cordero con antibióticos, establecer un lecho de herida, colocarlo en una membrana permeable en una placa de pocillos múltiples con medio libre de antibióticos y establecer una infección bacteriana en la herida de la piel.

Generación de un modelo de piel herida ovina ex vivo infectada con un patógeno bacteriano

Aquí describimos un nuevo modelo murino diabético utilizando ratones sin pelo en tiempo real, no invasivo, vigilancia de infecciones de la herida del biofilm de bioluminiscente Pseudomonas aeruginosa. Este método puede adaptarse para evaluar infección de otras especies de bacterias y microorganismos modificados genéticamente, como los biofilms multiespecies y comprobar la eficacia de estrategias antibiofilm.

Llegado al lado de la luz: Vivo en monitoreo de Pseudomonas aeruginosa Biofilm infecciones en las heridas crónicas en un diabético sin pelo modelo murino

Un protocolo para un ex vivo modelo de cultura órgano córneo es útil para estudios de cicatrización se describe. Este sistema modelo puede utilizarse para evaluar los efectos de agentes para promover la curación regenerativa o toxicidad de la droga en un ambiente organizado de multicelular 3D.

Ex Vivo modelo de cultura órgano córneo para la curación de heridas estudios

Aquí, se describen dos modelos de cicatrización de heridas murinas, uno diseñado para evaluar las respuestas de cicatrización de heridas celulares y citoquinas y el otro para cuantificar la tasa de cierre de heridas. Estos métodos se pueden utilizar con modelos de enfermedades complejas como la diabetes para determinar los mecanismos de varios aspectos de la cicatrización deficiente de heridas.

Evaluación de la cicatrización aguda de heridas utilizando los modelos de esponja de alcohol de polivinilo subcutáneo dorsal y modelos de herida sin piel de cola excisional.

Este artículo describe un protocolo paso a paso para establecer un modelo ex vivo porcino de queratitis bacteriana. Pseudomonas aeruginosa se utiliza como organismo prototípico. Este modelo innovador imita la infección in vivo, ya que la proliferación bacteriana depende de la capacidad de la bacteria para dañar el tejido corneal.

Establecer un modelo de córnea ex vivo porcina para estudiar tratamientos farmacológicos contra la queratitis bacteriana

Aquí demostramos una técnica optimizada para evaluar la reparación de heridas utilizando piel humana ex vivo combinada con un enfoque de tinción de montaje completo. Esta metodología proporciona una plataforma preclínica para la evaluación de posibles terapias de heridas.

Modelo de herida humana ex vivo y enfoque de tinción de montaje completo para evaluar con precisión la reparación de la piel

Las heridas crónicas resistentes a los antibióticos son una gran amenaza para el sistema sanitario. Las infecciones por biofilm son persistentes y hostiles y pueden causar un cierre funcional deficiente de la herida. Presentamos un modelo porcino clínicamente relevante de heridas crónicas de espesor total infectadas con biofilm. Este modelo es poderoso para estudios mecanicistas, así como para probar intervenciones.

Modelo porcino de infección por biofilm y heridas invisibles

Un dispositivo LED de luz azul de 405 nm demuestra eficacia antimicrobiana contra una amplia gama de patógenos de heridas cuando se evalúa en un modelo cutáneo sintético basado en colágeno. Este enfoque simplificado in vitro ofrece una alternativa reproducible y éticamente viable para la evaluación en fases tempranas de terapias antimicrobianas basadas en la luz.

Investigación de un dispositivo LED de luz azul para suprimir patógenos de heridas utilizando un modelo cutáneo sintético basado en colágeno

Aprende a establecer un modelo ex vivo de piel ovina herida infectada con Staphylococcus aureus para evaluar la eficacia antimicrobiana de nuevas formulaciones. Este método reduce el uso de animales y acelera la traducción clínica.

Un nuevo modelo de herida cutánea ovina ex vivo de alto rendimiento para probar antibióticos emergentes

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